ALL libraries (COBIB.SI union bibliographic/catalogue database)
13.
Izražanje in vrednotenje encimske aktivnosti rekombinantne človeške indolamin 2,3-dioksigenaze 1 ter sinteza izoksazolo[5,4-d]pirimidin-4(5H)-onskih zaviralcev = The expression of recombinant human indoleamine 2,3-dioxygenase 1, evaluation of its enzymatic activity and synthesis of isoxazolo[5,4-d]pyrimidin-4(5H)-one inhibitors
Abe, Aljaž
Indolamin 2,3-dioksigenaza 1 (IDO1) je poglavitni encim kinureninske metabolne poti, kjer katalizira pretvorbo L-triptofana v N-formilkinurenin. Za večino vrst rakavih obolenj je značilno povišano ...izražanje encima, kar je v tesni povezavi s slabo prognozo in nižjo možnostjo preživetja. IDO1 je vpleten v zaviranje efektorske funkcije celic T in ubijalk, diferenciacijo in aktivacijo imunosupresivnih regulatornih limfocitov T ter celic mieloidne supresorske vrste, kar promovira razrast tumorskih celic, omogoča neovaskularizacijo in zmanjšuje učinkovitost imunoterapij. Rezultati prvih in drugih faz kliničnih vrednotenj zaviralcev IDO1 so obetali protitumorno delovanje, a zaenkrat še nimamo potencialne učinkovine, ki bi prestala vse klinične faze. V sklopu magistrske naloge smo želeli z uporabo ekspresijskega sistema Escherichia coli pridobiti IDO1, ki bi izkazoval ekvivalentno aktivnost v primerjavi s komercialno dostopnim encimom in sintetizirati nove zaviralce IDO1 ter ovrednotiti njihovo zaviralno aktivnost. Z optimizacijo sestave gojišča in pogojev gojenja smo skušali zagotoviti čim večje izražanje. Celicam smo dodali različne prekurzorje za sintezo hema in primerjali izkoristek gojenja po 24 h in 48 h v prisotnosti oz. odsotnosti induktorja. S poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata smo potrdili istovetnost produkta in pretežno zastopanost v topni obliki, nakar smo protein izolirali in očistili s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo in gelsko filtracijo. Koncentracijo očiščenega encima smo določili spektrofotometrično pri 280 nm, še bolj pa nas je zanimala vrednost razmerja absorbanc A404/A280, ki korelira z deležem proteina, na katerega je vezan hem, kar vpliva na encimsko aktivnost. Največ rekombinantnega encima smo uspeli pridobiti, če smo bakterijam v gojišče dodali 5-aminolevulinsko kislino in z gojenjem nadaljevali še 24 h po indukciji izražanja. Aktivnost rekombinantnega encima IDO1 je bila kar petkrat nižja od komercialnega, verjetno na račun odsotnosti reducenta po zadnjem kromatografskem čiščenju. Sintetizirali smo tri končne spojine na osnovi 2-(3-(4-fluorofenil)-4-oksoizoksazolo[5,4-d]pirimidin-7(4H)-il)-N-fenilacetamidnega skeleta, ki so se razlikovale v substituentu na položaju meta fenilnega obroča, vezanega na N-atomu acetamida. Zaviralno delovanje končnih spojin smo vrednotili s fluorescenčnim testom, pri katerem se je kot najmočnejši zaviralec z IC50 vrednostjo 55.1 [mikro]M izkazala spojina 10 s trifluorometilno skupino. Čeprav rekombinantni encim ni dosegel želene aktivnosti, pa smo z našim raziskovalnim delom pomembno prispevali k temu, da bo v prihodnje možno pridobiti kristalno strukturo in na osnovi lastnosti vezavnega mesta načrtovati še močnejše zaviralce.
Type of material - master's thesis
; adult, serious
Publication and manufacture - Ljubljana : [A. Abe], 2020
It was not necessary to add the material to the shelf.
Bibliographic material was successfully added on shelf.
Adding bibliographical material on shelf was not successful.
Material is already on the shelf.
Permalink
URL:
Impact factor
Access to the JCR database is permitted only to users from Slovenia. Your current IP address is not on the list of IP addresses with access permission, and authentication with the relevant AAI accout is required.
Year
Impact factor
Edition
Category
Classification
JCR
SNIP
JCR
SNIP
JCR
SNIP
JCR
SNIP
Select the library membership card:
DRS,
in which the journal is indexed
Database name
Field
Year
Links to authors' personal bibliographies
Links to information on researchers in the SICRIS system
Subject headings in COBISS General List of Subject Headings
Select pickup location
The material from the parent unit is free. If the material is delivered to the pickup location from another unit, the library may charge you for this service.
