-
Vpeljava tehnologije kapljične digitalne verižne reakcije s polimerazo v razvoj bioloških zdravil = Implementation of droplet digital polymerase chain reaction technology in biological drugs development : magistrski študij laboratorijska biomedicinaDermota, TjašaKapljična digitalna verižna reakcija s polimerazo (ddPCR) je novejša oblika digitalne verižne reakcije s polimerazo (dPCR). Metoda temelji na tvorbi približno 20.000 kapljic, ki nastanejo v emulziji ... voda v olju (V/O), verižni pomnožitvi s polimerazo in končni absolutni kvantifikaciji kapljic s prisotnim pomnoženim produktom. Metoda je uporabna na številnih področjih, v okviru magistrske naloge pa smo želeli preveriti, če jo lahko uporabljamo tudi za razvoj rekombinantnih bioloških učinkovin v biofarmacevtski industriji. Pri izbiri ustreznih klonov igra ključno vlogo karakterizacija števila kopij, integritete in stabilnosti transgena. V podjetju Lek d.d. v ta namen uporabljajo verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (qPCR) in metodo prenosa po Southernu, ki pa ju želijo nadomestiti z novejšo metodo - ddPCR. Metodo ddPCR smo najprej optimizirali in nato preverili njeno uporabnost za genetsko karakterizacijo klonov ovarijskih celic kitajskega hrčka (CHO), uporabljenih v proizvodnji rekombinantnih proteinov, zlasti monoklonskih protiteles. Preverili smo analitske parametre ddPCR pri določanju števila kopij in integritete vstavljenih transgenov, izražanja lahke in težke verige protiteles v celičnih linijah in možnost uporabe ddPCR za kvantifikacijo rezidualne DNA v različnih stopnjah čiščenja zdravilne učinkovine. Določili smo široko dinamično območje, ki ga pokriva ddPCR tako za določanje koncentracije DNA (4 % 8000 kopij/[mikro]L), kot tudi mRNA (8 % 20.000 kopij/[mikro]L). Gre za visoko občutljivo metodo, saj je limita detekcije 1,5 % 3 kopije tarčnega gena/[mikro]L pri vzorcih DNA, ter 1,2 kopij/[mikro]L pri RNA vzorcih. Variabilnost metode pri kvantifikaciji DNA se giblje med 10 in 15 % in je nekoliko višja pri uporabi barvila EvaGreen v primerjavi s hidrolizirajočimi sondami. DdPCR smo primerjali z uveljavljenimi metodami in ugotovili, da je metoda primerna za določanje števila kopij in izražanja transgenov ter rezidualne DNA. Pri preverjanju integritete vstavljenih transgenov je ddPCR izkazala 80 % občutljivost, 88 % specifičnost in 82 % točnost glede na metodo prenosa po Southernu. Pri določanju stabilnosti vstavljenih transgenov je ddPCR izkazala 40 % občutljivost, 100% specifičnost ter 70 % točnost glede na prenos po Southernu. V razvoju bioloških zdravil je metoda ddPCR primerna za preverjanje integritete transgenov in določanje števila kopij pri presejanju klonov, saj je hitrejša in v primeru določanja števila kopij tudi točnejša. Za uporabo pri določanju stabilnosti pa bi ddPCR potrebovala še nadaljnjo optimizacijo.Type of material - master's thesis ; adult, seriousPublication and manufacture - Ljubljana : [T. Dermota], 2021Language - slovenianCOBISS.SI-ID - 52884483
Author
Dermota, Tjaša
Other authors
Doljak, Bojan |
Vogelsang, Matjaž
Topics
Biološka zdravila |
Analizna kemija |
ddPCR |
kapljična digitalna verižna reakcija s polimerazo |
celice CHO |
ovarijske celice kitajskega hrčka |
integriteta transgena |
stabilnost klona |
rezidualna DNA |
ekspresija transgena |
optimizacija ddPCR |
optmizacija digitalne verižne reakcije s polimerazo
Library/institution |
City | Acronym | For loan | Other holdings |
---|---|---|---|---|
Faculty of Pharmacy, Ljubljana | Ljubljana | FFALJ |
reading room 1 cop.
|
Shelf entry
Permalink
- URL:
Impact factor
Access to the JCR database is permitted only to users from Slovenia. Your current IP address is not on the list of IP addresses with access permission, and authentication with the relevant AAI accout is required.
Year | Impact factor | Edition | Category | Classification | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
JCR | SNIP | JCR | SNIP | JCR | SNIP | JCR | SNIP |
Select the library membership card:
DRS, in which the journal is indexed
Database name | Field | Year |
---|
Links to authors' personal bibliographies | Links to information on researchers in the SICRIS system |
---|---|
Dermota, Tjaša | |
Doljak, Bojan | 19785 |
Vogelsang, Matjaž | 26574 |
Select pickup location:
Material pickup by post
Notification
Subject headings in COBISS General List of Subject Headings
Select pickup location
Pickup location | Material status | Reservation |
---|
Please wait a moment.