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Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
GPC3 (Glipican-3) é membro de uma família de proteoglicano de heparina sulfatada (HSPG). O GPC3 pode atuar controlando a migração celular, regulação negativa do crescimento celular e indução de apoptose. Esse gene é relatado por estar hipoexpresso em vários tipos de cânceres, o que pode resultar no crescimento celular descontrolado e contribuir para o fenótipo maligno de alguns tumores. O objetivo desse estudo foi analisar o mecanismo de ação do gene GPC3 em carcinoma renal de células claras (CCRCC). Primeiramente, foi construído o vetor de expressão e transfectado nas linhagens celulares de carcinoma renal ACHN e 786-O. A expressão de GPC3 foi analisada usando qRT-PCR e imunohistoquímica. A proliferação celular foi avaliada usando o MTT e o ensaio de formação de colônia. Análises de apoptose e ciclo celular foram avaliadas por citometria de fluxo. Foi observado que o gene GPC3 estava com baixa expressão em amostras de carcinoma renal de células claras e nas linhagens celulares quando comparado com amostras renais normais. Foi observado que a expressão de RNAm e os níveis de proteína GPC3 aumentaram após a transfecção com o vetor de expressão contendo a ORF de GPC3 nas linhagens celulares. A taxa de proliferação celular diminuiu nas células superexpressando GPC3 em ambas as linhagens, ACHN e 786-O (p<0,01). A apoptose não foi observada nas linhagens celulares de carcinoma renal superexpressando GPC3 (p > 0,05); entretanto, ocorreu um aumento na população de células na fase G1 do ciclo celular (p< 0,05). Esses resultados sugerem que o gene GPC3 reduz a taxa de proliferação celular por meio da parada do ciclo celular na fase G1 em carcinoma renal
Background: GPC3 (Glypican 3) is a member of the family of glypican heparan sulfate proteoglycans (HSPG). The GPC3 gene may play a role in controlling cell migration, negative regulation of cell growth and induction of apoptosis. This gene is reported to be downregulated in several cancers, which can result in uncontrolled cell growth and which can also contribute to the malignant phenotype of some tumors. The purpose of this study was to analyze the mechanism of action of the GPC3 gene in clear cell renal cell carcinoma (CCRCC). Methods: First, we constructed the expression vector and transfected renal carcinoma cell lines. GPC3 expression was analyzed using qRT-PCR and immunohistochemistry. We evaluated cell proliferation using MTT and colony formation assays. Apoptosis and cell cycle analyses were evaluated using flow cytometry. Results: We observed that the GPC3 gene was downexpressed in the clear cell renal cell carcinoma samples and in cell lines, which were both compared to normal renal samples. We observed that GPC3 mRNA expression and protein levels increased after the transfection into ACHN and 786-O cell lines. We found that the cell proliferation rate decreased in cells overexpressing GPC3 in both cell lines, ACHN and 786-O (p < 0.01). Also, apoptosis in the renal cell carcinoma cell line was not observed in cells overexpressing GPC3 (p > 0.05), but there was an increase in the cell population during the G1 phase in the cell cycle (p< 0.05). Conclusion: We suggest that the GPC3 gene reduced the cell proliferation rate through cell cycle arrest during the G1 phase in renal cell carcinoma
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Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
O tumor renal é a mais letal das doenças urológicas. É uma doença histologicamente heterogênea, sendo o carcinoma renal de células claras o subtipo histológico mais comum. Embora a nefrectomia e imunoterapia sejam tratamentos bem estabelecidos, aproximadamente 30% dos pacientes tratados são acometidos por metástases. Alterações na expressão gênica e na inativação transcricional, devido ao mecanismo de metilação, são evidentes em células cancerosas. A metilação do DNA é um evento epigenético intimamente relacionado com o silenciamento da expressão gênica, e está envolvida em vários processos, dentre eles, a carcinogênese. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos investigar se os genes selecionados, GPC3, CRABP2, KTN1 e ADAM23 apresentam expressão alterada nas amostras tumorais, verificar se a expressão gênica está associada com a progressão tumoral, e analisar o padrão de metilação de ilhas CpGs. Os quatro genes selecionados foram validados pela técnica de PCR em Tempo Real. Para validação desses genes foram utilizadas 35 amostras de carcinoma renal de células claras e 35 amostras de córtex renal normal. Os genes GPC3, CRABP2, KTN1 e ADAM23 apresentaram redução de expressão significativa em amostras de carcinoma renal de células claras quando comparadas ao pool de amostras de córtex renal normal. Observou-se que a redução da expressão do gene ADAM23 está diretamente relacionada com o avanço do estadiamento tumoral. Foi observada uma freqüência elevada de hipermetilação do gene ADAM23, entretanto, não houve associação do padrão de metilação com os dados clínicos. A análise da expressão gênica e dos mecanismos responsáveis pela inativação transcricional dos genes CRABP2, KTN1 e ADAM23, estudados pela primeira vez em carcinoma renal, e GPC3, podem fornecer informações relevantes para o conhecimento e desenvolvimento do carcinoma renal de células claras.
The renal tumor, which is the most lethal of urological diseases, is a histologically heterogeneous disease, and the clear cell renal cell carcinoma the most common histological subtype. Although the treatment of nephrectomy and immunotherapy are established, approximately 30% of patients are affected by metastases. Changes in gene expression and transcriptional inactivation, due to the methylation mechanism are evident in cancer cells. The DNA methylation is an epigenetic event closely related to the silencing of gene expression, and is involved in several cases, including the carcinogenesis. The aim of this study was to investigate the gene expression of GPC3, CRABP2, KTN1 and ADAM23, check if gene expression was associated with tumor progression and analyze methylation pattern of CpG island. The four selected genes were validated by the quantitative RT-PCR. Thirty five samples of clear cell renal cell carcinoma and 35 samples of normal renal cortex were used for validation. The genes GPC3, CRABP2, KTN1 and ADAM23 showed significant reduction of expression in samples of clear cell renal cell carcinoma when compared to a pool of samples of normal renal cortex. It was observed that the lower expression of ADAM23 is directly related to the advancement of the tumor staging. Despite the high frequency of hypermethylation of ADAM23, there was no association with the methylation pattern of the clinical data. The analysis of gene expression and the mechanisms responsible for the transcriptional inactivation of genes CRABP2, KTN1 and ADAM23, first studied in clear cell renal cell carcinoma, and GPC3, may provide relevant information for the clear cell renal cell carcinoma understanding and development.
