Various in vivo and in vitro models have been described in order to elucidate the pathobiology underlying the traumatic brain injury (TBI) and test potentially suitable treatments. Since TBI is a ...complex disease, models differ in regard to the aspect of TBI that is being investigated. One of the used in vitro models is the scratch wound assay, first established as a reproducible, low-cost assay for the analysis of cell migration in vitro. The aim of the present study was to further investigate the relevancy of this model as a counter- part of in vivo TBI models.
We have examined the astrocytic response to a mechanical injury in terms of expression of chondroitin sul- fate proteoglycans (CSPGs) - phosphacan, neurocan and brevican, using real-time PCR and immunocytochemistry.
Our results indicate that in vitro scratch wounding alters the expression profile of examined CSPGs. Four hours after the scratch injury of the astrocytic monolayer, real-time PCR analysis revealed upregulation of mRNA levels for phos- phacan (3-fold) and neurocan (2-fold), whereas brevican mRNA was downregulated (2-fold). Immunofluorescent sig- nal for phosphacan and neurocan was more intense in astro- cytes close to the injury site, while brevican was scarcely present in cultured astrocytes.
Obtained results indicate that CSPGs are differ- entially expressed by astrocytes after scratch wounding, demonstrating that the scratch wound model might be suit- able for investigation of astrocyte-derived response to injury.
Brojni in vivo i in vitro modeli opisani su sa ciljem da se rasvetle patobiološki procesi koji su osnova traumatske povrede mozga (TPM) i testiraju potencijalni tretmani. Imajući u vidu da je TPM kompleksno oboljenje, ovi modeli se medusobno razlikuju shodno aspektu TPM koji se ispitu- je. Jedan od in vitro modela je i povreda ćelijskog jednoslo- ja grebanjem (engl. »scratch wound« assay), isprva ustanov- ljen kao ponovljiv, jeftin test za analizu ćelijske migracije in vitro. Cilj ove študije je da se bliže ispita relevantnost ovog modela u odnosu na in vivo modele TPM.
Da bi se istražio odgovor astrocita na mehaničku povredu, pradena je ekspresija odabranih hondroitin-sulfatnih proteoglikana (CSPG) - fosfakana, neurokana i brevikana, koriščenjem PCR u reálnom vremenu i imunocitohemije.
Dobijeni rezultati su pokazali da in vitro povreda astrocitnog jednosloja menja profile ekspresije ispitivanih CSPG. Četiri sata nakon povrede, primena PCR u reálnom vremenu analize pokazala je povečanje nivoa iRNKza fos- fakan (trostruko) i neurokan (dvostruko), dok je iRNK za brevikan bila smanjena na polovinu kontrolne vrednosti. Imunofluorescentni signal poreklom od fosfakana i neuro- kana je bio intenzivniji u astrocitima bližim mestu povrede, dok je signal za brevikan bio slab kako u kontrolnoj, tako i u ozledenoj grupi.
Dobijeni rezultati pokazuju da povreda izazvana grebanjem različito utiče na ekspresiju ispitivanih CSPG u astrocitima, što ukazuju da ovaj model može biti pogodan za ispitivanje odgovora astrocita na povredu.
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Reactive astrogliosis is a hallmark of traumatic brain injury (TBI), which, among the others alterations, causes changes in ...purinergic signaling. Due to its neuroprotective features, fluctuations of adenosine extracellular concentration are particularly important aspect of purinergic signaling in brain pathology. Hence, herein given thesis aimed to investigate expression and function of astrocytes’ adenosine signaling system components after brain injury in vitro and in vivo, with special regard to the role of equilibrative nucleoside transporters (ENT). In vivo study, performed on a model of cortical stub injury of rat forebrain, showed that injury caused dynamic changes in expression of ENTs, ectonucleotidases, and adenosine A1 receptor. Moreover, injury induced cell redistribution of ENT1/2 and upregulation of transporters on reactive astrocytes, which is especially pronounced seven day after the impact. The role of astrocytes in orchestration of adenosine signaling system after the injury was examined in more details in vitro, after scratch wound injury of astrocytic monolayer. Results have shown that scarification induced upregulation of ENT1 and ENT2 in later time points. Biphasic alteration in expression of e-5NT was shown in early downregulation followed by upregulation of the enzyme in later time points after the induction of scratch wound. Beside, scarification of astrocytic monolayer caused changes in concentration of adenosine and its metabolites in extracellular medium. The rise of adenosine concentration was noted early after the injury, which was followed by drop of the concentration in later time points examined. Blocking of ENT with dipyridamole (DPM) resulted in changes of observed adenosine concentration after the scarification, pointing out that ENT1/2 have significant role in controlling extracellular concentration of this nucleoside. In order to identify possible regulation pathways for ENT, astrocytes where treated with adenosine, ATP, DPM and DPCPX, antagonist of A1 receptor. Results have shown that ATP upregulates both transporters as well as e-5NT, while adenosine enhances expression of ENT2 and diminishes expression of ENT1. Moreover, DPM and DPCPX have shown different effect on ENT1/2 expression, confirming that regulation of these two transporters depends on different pathways. Toward the end, we wanted to compare effects of mechanical injury to those caused by chemically induced hypoxia after 4-hour CoCl2 treatment, on activity of the components of adenosine system. Unlike the sratch wound injury, CoCl2 causes early upregulation of ENT2, e-5NT and HIF-1α, as well as much greater increase in extracellular adenosine concentration. Herein given results represent an overview of activity and expression the most important components of adenosine signaling system after the injury, therefore giving good foundation for future research of astrocyte role in control of adenosine in both physiological and pathological conditions, as well as for investigation of potential candidates for future TBI therapies.- Glavno obeležje traumatske povrede mozga (TPM) je reaktivna astroglioza koja, između ostalog, uzrokuje i promene u signalizaciji purinima. Posebno važan aspekt purinske signalizacije u patološkim procesima centralnog nervnog sistema predstavlja dinamika promena vanćelijskih koncentracija neuroprotektora adenozina. Stoga je cilj ove doktorske teze bio ispitivanje ekspresije i funkcije komponenti adenozinskog signalnog sistema astrocita u in vivo i in vitro modelu moždane povrede, sa posebnim osvrtom na ulogu ekvilibrišućih nukleozidnih transportera (ENT). U in vivo studiji, izvedenoj na modelu ubodne lezije kore prednjeg mozga pacova, je pokazano da povreda dovodi do dinamičnih promena u ekspresiji ENT, ektonukleotidaza i adenozinskog A1 receptora. Sem toga, povreda uzrokuje i ćelijsku re-distribuciju ENT1/2 i ushodnu regulaciju transportera na reaktivnim astrocitima, što je posebno izraženo sedmog dana nakon ozlede. Uloga astrocita u orkestraciji adenozinskog signalnog sistema nakon povrede je detaljnije ispitana in vitro, nakon skarifikacije astrocitnog jednosloja. Rezultati su pokazali da skarifikacija povećava ekspresiju ENT1 i ENT2 tek u kasnijim vremenima. Bifazna promena u ekspresiji ekto-5`-nukleotidaze (e-5NT) je iskazana prvobitnim smanjenjem i potom povećanjem ekspresije u kasnijim vremenima nakon skarifikacije. Pored toga, skarifikacija astrocitnog jednosloja vodi promenama u koncentracijama adenozina i njegovih metabolita u ćelijskom medijumu. Naime, porast koncentracija adenozina u ranim vremenima nakon povrede, bio je praćen padom u kasnijim vremenima. Blokiranje ENT dipiridamolom (DPM) je dovelo do promena u koncentracijama adenozina nakon skarifikacije, ukazavši na ulogu ENT1/2 u kontroli vanćelijskih koncentracija ovog nukleozida. Kako bi se nagovestili mogući putevi regulacije ENT, kultura astrocita je podvrgnuta tretmanima adenozinom, ATP, DPM i blokatorom A1 receptora DPCPX. Rezultati su pokazali da ATP ushodno reguliše oba transportera i e-5NT, dok adenozin povećava ekspresiju ENT2 a smanjuje ekspresiju ENT1. Takođe, drugačiji efekat na ekspresiju ENT1/2 su imali i DPM i DPCPX, potvrdivši da su ova dva transportera regulisana drugačijim putevima. Na kraju smo želeli da uporedimo efekte mehaničke povrede i CoCl2 izazvane hipoksije nakon četvoročasovnog na aktivnost komponenti adenozinskog sistema. Za razliku od skarifikacije, CoCl2 vodi ranom povećanju ekspresije ENT2, e-5NT i HIF-1α, kao i daleko većem povećanju vanćelijskih koncentracija adenozina. Dobijeni rezultati predstavljaju pregled eskpresije i aktivnosti najvažnijih komponenti adenozinskog sistema astrocita nakon povrede, dajući dobru osnovu za dalja ispitivanja uloge astrocita u kontroli kruženja adenozina u fiziološkim i patološkim stanjima, kao i potencijalne kandidate za buduće terapije TPM.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult onset fatal neurodegenerative
disease characterized mainly by the progressive loss ...of upper and lower motor
neurons resulting in wasting, paresis and death from respiratory failure.
Approximately 5-10% of ALS cases are familial (fALS), while the rest are
sporadic (sALS) with unknown cause of disease. The objective of this
dissertation was to evaluate the effect of immunoglobulin G (IgG) isolated
from sALS patients (ALS IgG) on calcium homeostasis and mobility of
endosomes/lysosomes in cultured rat cortical astrocytes. ALS IgG (0.1 mg/ml)
from 7 ALS patients, but not IgG from 3 control individuals evoked calcium
transients (Ca2+-waves) in astrocytes. About half of the tested astrocytes
responded with elevated calcium activity regardless of the presence of
extracellular calcium (47.5 ± 12.9 %, 2 mM Ca2+ vs. 48.2 ± 13.6 %, 0 mM
Ca2+). In presence of extracellular calcium, the peak amplitude developed ~3x
faster (19.7 ± 2.8 s, 2 mM Ca2+ vs. 56.3 ± 6.8 s, 0 mM Ca2+) and the overall
magnitude of calcium rise (area under the Ca2+-wave) was ~1.7x larger (26.0 ±
1.6 F/F0 *s, 2 mM Ca2+ vs. 15.6 ± 1.1 F/F0 *s, 0 mM Ca2+), while the peak
amplitude itself was not affected. Application of pharmacological inhibitors
revealed that activation of inositol 1,4,5- triphosphate (IP3), but not of
ryanodine receptors is necessary and sufficient to initiate elevated
activity, while the influx of extracellular calcium through TRPC channels
prolongs the responses. Inhibition of phospholipase C (PLC) diminishes, while
the inhibition of phosphatidilinositol-3-kinase (PI3K) completely prevents
typical ALS IgG evoked calcium response. The population of vesicles labeled
with lysotracker that mainly stains endosomes and lysosomes, consisted of
non-mobile (6.1%) vesicles with the average speed of <67 nm/s and mobile
vesicles (93.9%) with total track length (TL) in 15 s averaging at 3.03±0.01
μm. ALS IgG (0.1 mg/ml) from 12 of 13 patients increased the TL of mobile
vesicles by ~24% and the maximal displacement (MD) by ~26% within 4 min,
while IgG from control group (n=4) did not alter the vesicle mobility. The
mobility enhancement by ALS IgG was less pronounced in Ca2+-free
extracellular solution, indicating that ALS IgG vesicle mobility enhancement
involves changes in Ca2+ homeostasis. Interestingly, neither ALS IgG nor ATP
(1 mM) triggered the release of vesicular cargo, making rapid and complete
exocytosis unlikely in cultured astrocytes in our experimental conditions. In
conclusion, ALS IgG affect calcium homeostatic system in astrocytes by IP3
mediated calcium release from the endoplasmic reticulum and entry of
extracellular calcium through TRPC channels, with the activation of PI3K
upstream of PLC. ALS IgG enhance the mobility of endosomes and lysosomes, and
this effect is partialy dependent on extracellular calcium. This study
revealed the molecular mechanisms by which astrocytes become targeted cells
for humoral immune response in ALS that could contribute to the
aetiopathogenesis of the disease.- Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je fatalna neurodegenerativna bolest sa
početkom u adultnom dobu koja se karakteriše progresivnim gubitkom gornjih i
donjih motoneurona, što dovodi do atrofije muskulature, mišićne paralize i
smrti usled slabosti respiratorne muskulature. Oko 5-10% ALS slučajeva su sa
familijarnom istorijom bolesti (fALS), dok su preostali slučajevi sporadični
(sALS) sa nepoznatim uzrokom bolesti. Cilj ove disertacije bio je da proceni
efekat imunoglobulina G (IgG) izolovanog iz sALS bolesnika (ALS IgG) na
homeostazu kalcijuma i mobilnost endozoma/lizozoma kod pacovskih kortikalnih
astrocita u kulturi. ALS IgG (0.1 mg/ml) poreklom od 7 ALS pacijenata, za
razliku od IgG iz 3 kontrolne osobe, izazvao je prolazne promene
unutarćelijske koncentracije kalcijuma (Ca2+-talas) u astrocitima. Povećana
aktivnost kalcijuma detektovana je kod oko polovine astrocita nakon tretmana
sa ALS IgG, bez obzira na prisustvo vanćelijskog kalcijuma (47,5 ± 12,9 %, 2
mM Ca2+ naspram 48,2 ± 13,6 %, 0 mM Ca2+). U prisustvu vanćelijskog
kalcijuma, maksimalna vrednost promene dostignuta je ~3x brže (19,7 ± 2,8 s,
2 mM Ca2+ naspram 56,3 ± 6,8 s, 0 mM Ca2+) i ukupno povećanje kalcijuma
(površina pod Ca2+-talasom) bilo je ~1.7x veće (26,0 ± 1,6 F/F0 *s, 2 mM Ca2+
naspram 15,6 ± 1.1 F/F0 *s, 0 mM Ca2+), ali vanćelijski kalcijum nije uticao
na maksimum amplitude kalcijumovog talasa. Primena farmakoloških inhibitora
otkrila je da je aktivacija inozotol 1,4,5-trifosfatnog (IP3), za razliku od
rianodinskog receptora neophodna i dovoljna da inicira povećanu aktivnost, a
ulazak kalcijuma kroz TRPC kanale produžava odgovor. Inhibicija fosfolipaze C
(PLC) umanjuje, dok inhibicija fosfatidilinozitol-3-kinaze (PI3K) u
potpunosti sprečava tipičan ALS IgG-izazvan kalcijumski odgovor. Populacija
vezikula obeleženih lizotrekerom koji boji endozome i lizozome, sastojala se
od stacionarnih vezikula (6,1%) sa prosečnom brzinom koja nije prelazila 67
nm/s i mobilnih vezikula (93.9%) čija je ukupna dužina putanje (TL) pređene
za 15 s iznosila u proseku 3,03±0,01 μm. ALS IgG (0.1 mg/ml) poreklom iz 12
od 13 ALS bolesnika povećao je TL mobilnih vezikula za ~24% i maksimalni
pomeraj (MD) za ~26% tokom praćenih 4 min, za razliku od kontrolnih IgG
(poreklom od 4 osobe) koji nisu uticali na mobilnost vezikula. ALS
IgG-izazvano povećanje mobilnosti bilo je manje izraženo u rastvoru bez Ca2+,
što ukazuje da su promene u homeostazi kalcijuma uključene u proces kojim ALS
IgG povećava mobilnost vezikula. Interesantno, ALS IgG kao i ATP (1 mM) nisu
uticali na oslobađanje sadržaja vezikula, što znači da je brza i kompletna
egzocitoza malo verovatan događaj kod astrocita u kulturi u našim
eksperimentalnim uslovima. Sumarno, ALS IgG utiče na kalcijumovu homeostazu
astrocita preko IP3-posredovanog oslobađanja kalcijuma iz endoplazmatičnog
retikuluma i ulaska kalcijuma kroz TRPC kanale, uz aktivaciju PI3K uzvodno od
PLC. ALS IgG povećavaju mobilnost endozoma i lizozoma, a ovaj efekat
delimično zavisi od vanćelijskog kalcijuma. Ova studija je otkrila molekulske
mehanizme kojima astrociti postaju meta humoralnog imunskog odgovora u ALS,
što može da doprinese etiopatogenezi bolesti.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
Medu literaturnim podacima o toksičnosti olova ima malo podataka o neurotoksičnosti organskih spojeva olova. Otrovom izazvane promjene u koncentraciji glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFKP) u ...mozgu mogu pokazati u kojoj fazi neurotoksičnosti dolazi do oštećivanja astrocita te da li GFKP može služiti kao praktični pokazatelj otrovnog djelovanja. U ovom radu procjenjivano je izaziva li izloženost štakora organskom olovu promjene u koncentraciji GFKP te kako promjene ovise o dozi i o trajanju izloženosti. Mužjaci F344 štakora u dobi iznad 42 dana izlagani su dozi od 0 (kontrola), 8 ili 16 ppm olova u obliku trimetilnog olova (TMPb) u pitkoj vodi do ukupno 14 dana. U svakoj skupini bilo je osam životinja. Prirast tjelesne težine bio je značajno smanjen u obje izložene skupine. U kontrolnih štakora izmjerene su očekivane koncentracije GFKP u ispitivanim područjima mozga, s najvišim vrijednostima u hipokampusu i u malom mozgu i s najnižim vrijednostima u moždanoj kori. Područje hipokampusa bilo je veoma osjetljivo na TMPb, s porastom GFKP u štakora izloženih 8 i 15 ppm TMPb tijekom 14 dana. U štakora izloženih B ppm TMPb opažena je značajna ovisnost učinka o vremenu, tako da su koncentracije TMPb nakon sedam dana bile snižene, a nakon 14 dana povišene. U radu se raspravlja o hipotezi o ovim bifazičnim promjenama u koncentracijama GFKP. Rezultati pokazuju da GFKP može poslužiti kao pokazatelj mogućih staničnih mehanizama i uloge astrocita u neurotoksičnom djelovanju TMPb. Pokazano je također da je GFKP, kao biološki pokazatelj učinaka TMPb, jednako osjetljiv kao i tjelesna težina, pa stoga može poslužiti kao praktični pokazatelj neurotoksičnosti.
PDF
