The significance of changes in glycosylation for the beginning, progress and outcome of different human diseases is highly recognized. In this review we summarized literature data on the alteration ...of glycans in cancer, especially glycoforms of tumor markers of reproductive tract cancers: prostate-specific antigen (PSA) and cancer antigen 125 (CA125). We aimed to highlight the diagnostic potential and relevance of glycan microheterogeneity and to present some novel methods for cancer detection. A computerized search of articles published up to 2007 was performed through the PubMed database. Search terms utilized included prostate/ovarian cancer glycosylation, prostate/ovarian cancer detection, PSA/CA125 glycosylation. Additional sources were identified through cross-referencing and researching in available biomedical books. The comparative studies of sugar chain structures of the PSA and CA125 indicated specific structural alterations associated with malignant transformation, in relation to glycan branching, sialylation and fucosylation. These glycan modifications should be better in distinguishing between benign and malignant conditions than the measurement of marker concentrations alone, which is widely used in practice. Cancer-associated changes in the glycosylation could yield more sensitive and discriminative diagnostic tests for reproductive tract cancer detection, i.e. for improvement of the clinical utility of known tumor markers or the discovery of new ones.
Poznat je značaj promena glikozilacije za nastanak, razvoj i ishod različitih bolesti. U ovom radu sumirani su podaci iz literature o promenama glikana kod kancera, posebno glikoformi tumorskih markera kancera reproduktivnog trakta: specifičnog antigena prostate (PSA) i kancerskog antigena 125 (CA125). Cilj ovog rada je da se naglase dijagnostički potencijal i značaj mikroheterogenosti glikana kao i da se prezentuju neke nove metode za detekciju kancera. Izvršena je pretraga radova objavljenih do 2007. godine u bazi podataka PubMed, pomoću termina > prostate/ovarian cancer glycosylation<, >prostate/ovarian cancer detection<, >PSA/CA125 glycosylation<. Kao dodatni izvor podataka korišćene su i dostupne biomedicinske knjige. Uporedna studija strukture šećernih lanaca PSA i CA125 ukazala je na specifične promene povezane sa malignom transformacijom, koje se tiču grananja, sijalinizacije i fukozilacije glikana. Ovakve glikanske modifikacije tumorskih markera mogle bi imati veći potencijal u smislu diferencijalne dijagnostike benignih i malignih stanja nego samo merenje njihove koncentracije, koje se sada široko primenjuje u praksi. Promene glikozilacije, vezane za kancer, mogu biti osnov za razvoj senzitivnijih i specifičnijih dijagnostičkih testova za detekciju kancera reproduktivnog trakta, tj. poboljšati kliničku upotrebu poznatih ili doprineti pronalaženju novih tumorskih markera.
Upalne bolesti crijeva (engl. inflammatory bowel diseases, IBD) su kronične bolesti probavnog trakta koje nastaju zbog neodgovarajućeg upalnog odgovora imunološkog sustava na crijevnu mikrofloru u ...osoba s genetičkom predispozicijom. Cjelogenomske studije povezanosti su povezale gliko-gen MGAT3 s glikozilacijom imunoglobulina G (IgG) i IBD-em. Druga istraživanja su s razvojem IBD-a povezala i gliko-gen MGAT5. Bisulfitnim pirosekvenciranjem analizirala sam metilaciju gena MGAT3 i MGAT5 iz krvi pacijenata s IBD-em dviju velikih neovisnih kohorti te pokazala da je metilacija ovih gena značajno promijenjena u ulceroznom kolitisu i Crohnovoj bolesti. Korelacijske analize upućuju na smanjenu ekspresiju gena MGAT3 (kodira za enzim GnT-III) u IBD-u, ako je točna pretpostavka da su analizirana CpG mjesta unutar promotora tog gena uključena u regulaciju ekspresije. U trećoj manjoj kohorti analizirala sam metilaciju gena MGAT3 i MGAT5 u mononuklearnim stanicama krvi, T-limfocitima izoliranim iz krvi i iz tkiva crijeva, te pokazala značajnu promjenu metilacije oba gena u T-limfocitima iz crijeva, te promijenjenu metilaciju i ekspresiju gena MGAT5 u T-limfocitima iz tkiva crijeva pacijenata s aktivnim oblikom ulceroznog kolitisa.
Inflammatory bowel diseases (IBD) are a group of intestinal disorders that occur due to inappropriate immune response to intestinal microbiome in genetically susceptible individuals. Genome wide association studies associated MGAT3 gene with IgG glycosylation and IBD. Previous studies associated another glyco-gene, MGAT5 with IBD, too. Methylation of MGAT3 and MGAT5 genes was analysed from whole blood of IBD patients from two large independent cohorts using bisulfite pyrosequencing. The results showed significant change in methylation level between patients with Crohn's disease and ulcerative colitis, and healthy controls. Correlation analysis between MGAT3 methylation and IgG glycans suggests that MGAT3 (coding for GnT-III enzyme) expression is reduced in IBD, if CpG sites encompassed with methylation assays are relevant for transcriptional regulation. In third cohort with smaller number of patients with ulcerative colitis, methylation of MGAT3 and MGAT5 genes was analysed in mononuclear cells from blood, T cells from blood, and T cells from inflamed bowel tissue. Change in methylation level of both genes was observed only in T cells from bowel tissue. The methylation and expression of MGAT5 gene was significantly changed in T cells from bowel tissue in active ulcerative colitis.
Dijabetes mladih koji se javlja u odrasloj dobi (MODY, engl. maturity onset diabetes of the
young) monogenski je tip dijabetesa, najčešće uzrokovan mutacijama u genu HNF1A. Vrlo se
često pogrešno ...dijagnosticira kao dijabetes tipa 1 ili 2, međutim, pravilna dijagnoza od izrazite
je važnosti, budući da je kod ovih pacijenata moguće dugo održavati normoglikemiju oralnom
primjenom derivata sulfonilureje. Definitivna dijagnoza bolesti postavlja se sekvenciranjem
gena HNF1A, ali i tada postoji problem određivanja patogenosti pronađenih varijanti. Kako se
protein HNF1α pokazao ključnim regulatorom fukozilacije proteina, plazmatski je N-glikom
značajno promijenjen kod oboljelih od HNF1A-MODY-a. Dobiveni rezultati pokazuju da
mnogi glikanski parametri mogu uspješno raspoznati pacijente s rijetkim varijantama gena
HNF1A, od pacijenata bez HNF1A varijanti. Glikani pokazuju vrijednost i u određivanju
utjecaja pronađenih rijetkih HNF1A varijanti na funkciju, točnije, mogu se upotrijebiti kao
biljeg patogenih varijanti. Zaključno, uključivanjem glikanskog biljega u dijagnostički protokol
za HNF1A-MODY značajno bi se povećala dijagnostička osjetljivost.
Maturity onset diabetes of the young (MODY) is a monogenic form of diabetes most commonly
caused by HNF1A mutations. It is frequently misdiagnosed as type 1 or type 2 diabetes, but
correct diagnosis of MODY patients is of utmost importance, since their hyperglycemia is
usually very sensitive to oral treatment with sulphonylurea agents. HNF1A-MODY is
definitively diagnosed by gene sequencing, but even then, a confirmation that HNF1A variants
are pathogenic remains an issue. Since HNF1α showed to be a master regulator of protein
fucosylation, plasma N-glycome is significantly altered in HNF1A-MODY patients. Results
presented in this thesis show that many glycan traits can successfully discriminate patients with
rare HNF1A variants from patients without the variant. Glycans also show value in assessing
the effect of identified allele variants on gene function, i.e., they can be used as biomarkers of
pathogenic variants. In conclusion, incorporating glycans in diagnostic protocol for HNF1AMODY
would significantly increase diagnostic sensitivity.
Dijabetes mladih koji se javlja u odrasloj dobi (MODY, engl. maturity onset diabetes of the
young) monogenski je tip dijabetesa, najčešće uzrokovan mutacijama u genu HNF1A. Vrlo se
često pogrešno dijagnosticira kao dijabetes tipa 1 ili 2, međutim, pravilna dijagnoza od izrazite
je važnosti, budući da je kod ovih pacijenata moguće dugo održavati normoglikemiju oralnom
primjenom derivata sulfonilureje. Definitivna dijagnoza bolesti postavlja se sekvenciranjem
gena HNF1A, ali i tada postoji problem određivanja patogenosti pronađenih varijanti. Kako se
protein HNF1α pokazao ključnim regulatorom fukozilacije proteina, plazmatski je N-glikom
značajno promijenjen kod oboljelih od HNF1A-MODY-a. Dobiveni rezultati pokazuju da
mnogi glikanski parametri mogu uspješno raspoznati pacijente s rijetkim varijantama gena
HNF1A, od pacijenata bez HNF1A varijanti. Glikani pokazuju vrijednost i u određivanju
utjecaja pronađenih rijetkih HNF1A varijanti na funkciju, točnije, mogu se upotrijebiti kao
biljeg patogenih varijanti. Zaključno, uključivanjem glikanskog biljega u dijagnostički protokol
za HNF1A-MODY značajno bi se povećala dijagnostička osjetljivost.
N-glikozilacija proteina je ključna za razvoj i funkciju živčanog sustava. U ovoj disertaciji konstruiran je prostorno-vremenski glikomski profil mozga, istražujući N-glikanske strukture četiriju ...funkcionalno različitih regija mozga, fronatalna dorsalna kora velikog mozga, hipokampus, strijatum te mali mozak, i njihovu raspodjelu u mozgu odraslog čovjeka; kao i u mozgu čovjeka tijekom fetalnog razvoja. Također, s namjerom da se dobije evolucijska perspektiva N-glikanskih struktura unutar različitih regija mozga, napravljena je usporedba odgovarajućih regija mozga između glikoma mozga čovjeka, čimpanzi, makaki majmuna i štakora. Određivanje glikanskih profila uzoraka mozga je provedeno korištenjem dvaju analitičkih pristupa: tekućinske kromatografije ultravisoke djelotvornosti i spektrometrije masa. Uvidom u N-glikom analiziranih uzoraka, uočena je značajna razlika između različitih regija, vrsta i razvoja mozga. Razlika između N-glikoma je bila veća što su vrste bile evolucijski udaljenije. N-glikanski profil malog mozga se najviše razlikovao od ostalih analiziranih regija. Razvijena HILIC-UPLC metoda za analizu N-glikana tkiva mozga se pokazala reproducibilnom i robusnom.
N-glikozilacija proteina je ključna za razvoj i funkciju živčanog sustava. U ovoj disertaciji konstruiran je prostorno-vremenski glikomski profil mozga, istražujući N-glikanske strukture četiriju funkcionalno različitih regija mozga, fronatalna dorsalna kora velikog mozga, hipokampus, strijatum te mali mozak, i njihovu raspodjelu u mozgu odraslog čovjeka; kao i u mozgu čovjeka tijekom fetalnog razvoja. Također, s namjerom da se dobije evolucijska perspektiva N-glikanskih struktura unutar različitih regija mozga, napravljena je usporedba odgovarajućih regija mozga između glikoma mozga čovjeka, čimpanzi, makaki majmuna i štakora. Određivanje glikanskih profila uzoraka mozga je provedeno korištenjem dvaju analitičkih pristupa: tekućinske kromatografije ultravisoke djelotvornosti i spektrometrije masa. Uvidom u N-glikom analiziranih uzoraka, uočena je značajna razlika između različitih regija, vrsta i razvoja mozga. Razlika između N-glikoma je bila veća što su vrste bile evolucijski udaljenije. N-glikanski profil malog mozga se najviše razlikovao od ostalih analiziranih regija. Razvijena HILIC-UPLC metoda za analizu N-glikana tkiva mozga se pokazala reproducibilnom i robusnom.
Protein N-glycosylation is crucial for the development and function of the nervous system. In this dissertation, a spatio-temporal profile of the brain glycome was constructed by investigating N-glycan structures of four functionally distinct brain regions, the dorsal fronatal cortex, the hippocampus, the striatum and the cerebellum, and their distribution within the adult human brain as well as the fetal. Moreover, in order to obtain an evolutionary perspective of the corresponding brain regions, a cross-species comparison was made between the human, the chimpanzee, the macaque and the rat. Two analytical approaches were used for glycosylation profiling of brain samples: ultra-performance liquid chromatography and mass spectrometry. Significant difference was noticed between the regions, the species and the developmental stages in the analyzed N-glycomes. The difference between species was higher as they were evolutionary more distinct. The cerebellar N-glycom was the most distinctive of all the analyzed brain regions. The developed HILIC-UPLC method for the N-glycans analysis of the brain tissue was reproducible and robust.
Ispitivali smo učinke 10 μmol L-1 i 15 μmol L-1 kadmija (Cd), neesencijalnoga toksičnog elementa i 25 μmol L-1 i 50 μmol L-1 cinka (Zn), esencijalnog mikronutrijenta, na proteine i glikoproteine u ...klijancima i odraslim biljkama Nicotiana tabacum L. nakon izlaganja svakomu metalu posebno ili njihovim kombinacijama. Promjene kod nekoliko polipeptida koje su uočene u klijancima i listovima odraslih biljaka nisu bile brojne, dok su one najvažnije zabilježene u uzorku ukupnih topljivih proteina u korijenu biljke. Razlike između kontrole i tretiranog tkiva duhana bile su izraženije kod glikoproteina koji su analizirani primjenom različitih lektina. Većina glikoproteina uočenih u listovima i korijenu odraslih biljaka može se smatrati rezultatom povećane glikozilacije zbog stresa koji uzrokuju teški metali. Nije bilo moguće utvrditi razliku u glikoproteinima između tretiranja klijanaca i odraslih biljaka duhana kadmijem i cinkom jer je povećana glikozilacija utvrđena i nakon tretmana svakim metalom posebno i nakon tretmana njihovim kombinacijama. Stoga se može zaključiti da su, kao rezultat promijenjenih uvjeta u okolišu, oba metala potaknula N- i O-glikozilaciju.
Nedavno je dokazano da su transgene biljke dobar sustav za jeftinu i obilnu proizvodnju terapeutskih proteina. Usprkos mnogim prednostima biljaka kao domaćina za ekspresiju rekombinantnih proteina, ...postoje određena ograničenja uzrokovana velikim razlikama u strukturi N-glikana biljaka i sisavaca. Stoga se pokušava ukloniti ili barem smanjiti N-glikozilacija specifična za biljke i proizvesti neimunogene N-glikane iz biljnih lijekova dodatkom humane glikoziltransferaze endogenom biljnom sustavu za primjenu u medicini.
Glycans constitute the most abundant and diverse form of the post-translational modifications. While genes
unequivocally determine the structure of each polypeptide, there is no genetic template for ...the glycan part.
Instead, hundreds of genes and their products interact in the very complex pathway of glycan biosynthesis
which is further complicated by environmental influences. Therefore, the aim of this thesis was to
determine the extent to which individual differences in immunoglobulin G and total plasma proteins
glycosylation patterns reflect genetic versus environmental influences. A twin study design was used and
study subjects were twins enrolled in the TwinsUK registry, a national register of adult twins. More than
4500 samples were analyzed by HILIC-UPLC (Hydrophilic Interaction Ultra Performance Liquid
Chromatography). A high contribution of the genetic component to N-glycome composition was found.
Variation in levels of 51 of the 76 IgG glycan traits studied was at least 50% heritable and only a small
proportion of N-glycan traits had a low genetic contribution. Heritability of plasma N-glycome was also
high, with half of the plasma glycan traits being at least 50% heritable. Further, epigenome-wide association
(EWA) analysis showed that methylation levels at some genes are also implicated in glycome composition,
both in those with high heritability and those with a lower genetic contribution. The study to investigate the
potential role of glycosylation in kidney function was also conducted. Fourteen IgG glycan traits were
associated with renal function in discovery population and remained significant after validation in an
independent subset of monozygotic twins discordant for renal disease, reflecting difference in
galactosylation, sialylation, and level of bisecting N-acetylglucosamine. Using the weighted correlation
network analysis (WGCNA) for IgG glycan traits, a correlation between low back pain (LBP) and glycan
modules was established. There was a weak positive correlation between pain phenotypes and "proantibody-
dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC)" WGCNA glycan modules (high bisecting Nacetylglucosamine
and low core fucose) and a weak negative correlation between pain phenotypes and
"anti-ADCC" module (high core fucose, no bisecting N-acetylglucosamine). This suggests that glycans are
promising candidates for biomarkers in many different diseases.
Glycans constitute the most abundant and diverse form of the post-translational modifications. While genes
unequivocally determine the structure of each polypeptide, there is no genetic template for the glycan part.
Instead, hundreds of genes and their products interact in the very complex pathway of glycan biosynthesis
which is further complicated by environmental influences. Therefore, the aim of this thesis was to
determine the extent to which individual differences in immunoglobulin G and total plasma proteins
glycosylation patterns reflect genetic versus environmental influences. A twin study design was used and
study subjects were twins enrolled in the TwinsUK registry, a national register of adult twins. More than
4500 samples were analyzed by HILIC-UPLC (Hydrophilic Interaction Ultra Performance Liquid
Chromatography). A high contribution of the genetic component to N-glycome composition was found.
Variation in levels of 51 of the 76 IgG glycan traits studied was at least 50% heritable and only a small
proportion of N-glycan traits had a low genetic contribution. Heritability of plasma N-glycome was also
high, with half of the plasma glycan traits being at least 50% heritable. Further, epigenome-wide association
(EWA) analysis showed that methylation levels at some genes are also implicated in glycome composition,
both in those with high heritability and those with a lower genetic contribution. The study to investigate the
potential role of glycosylation in kidney function was also conducted. Fourteen IgG glycan traits were
associated with renal function in discovery population and remained significant after validation in an
independent subset of monozygotic twins discordant for renal disease, reflecting difference in
galactosylation, sialylation, and level of bisecting N-acetylglucosamine. Using the weighted correlation
network analysis (WGCNA) for IgG glycan traits, a correlation between low back pain (LBP) and glycan
modules was established. There was a weak positive correlation between pain phenotypes and "proantibody-
dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC)" WGCNA glycan modules (high bisecting Nacetylglucosamine
and low core fucose) and a weak negative correlation between pain phenotypes and
"anti-ADCC" module (high core fucose, no bisecting N-acetylglucosamine). This suggests that glycans are
promising candidates for biomarkers in many different diseases.
Glikani predstavljaju najzastupljeniji i najraznolikiji oblik posttranslacijske modifikacije. Dok geni
nedvosmisleno određuju strukturu svakog polipeptida, za sintezu glikana ne postoji genski predložak.
Umjesto toga, stotine gena i njihovih produkata sudjeluju u vrlo kompleksnoj biosintezi glikana koju
okolišni utjecaji čine još složenijom. Stoga je cilj ovog doktorskog rada odrediti razmjer kojim genski i
okolišni čimbenici utječu na N-glikane imunoglobulina G (IgG) i ukupnih glikoproteina plazme. Da bi se
postigao navedeni cilj, upotrijebljena je studija na blizancima. Ispitanici su regrutirani TwinsUK registrom,
najvećim registrom blizanaca u Velikoj Britaniji. Više od 4500 uzoraka analizirano je HILIC-UPLC
metodom (kromatografijom vrlo visoke djelotvornosti temeljenoj na hidrofilnim interakcijama, eng.
Hydrophilic Interaction Ultra Performance Liquid Chromatography). Velika genska komponenta
(heritabilnost ≥ 50%) pokazana je za 51 od 76 glikanskih svojstava IgG-a. Nasuprot tome, samo je 12
glikanskih svojstava IgG-a pokazalo malu gensku komponentu. Heritabilnost plazmatskog N-glikoma
također se pokazala velikom. Polovica plazmatskih glikanskih svojstava bila je barem 50% heritabilna.
Epigenomska asocijacijska analiza pokazala je da razina metilacije na nekim genima također utječe na
sastav glikoma, i to na visokoheritabilne i niskoheritabilne glikane. Također je provedeno prvo istraživanje
potencijalne uloge IgG glikozilacije u funkciji bubrega. U prvoj je analizi pronađena značajna povezanost s
bubrežnom funkcijom za 14 glikanskih svojstava, a ostala je značajna i nakon validacije na neovisnoj
podskupini monozigotnih blizanaca diskordantnih za bubrežnu funkciju. Ta glikanska svojstva pripadaju
trima glavnim glikozilacijskim karakteristikama IgG-a: galaktozilaciji, sijalinizaciji i razini račvajućeg Nacetilglukozamina.
Koristeći se WGCNA (eng. weighted correlation network analysis) metodologijom,
provedena je mrežna analiza razina IgG glikana kod blizanaca, da bi se uspostavili klasteri koreliranih
glikana. Pronađene su povezanosti između tih klastera i fenotipova boli kod blizanaca s LBP-om. Opažena
je pozitivna korelacija između fenotipova boli i „pro-stanična citotoksičnost ovisna o protutijelima (eng.
antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)“ WGCNA glikanskog modula (visoka razina
račvajućeg N-acetilglukozamina i niska razina sržne fukoze) te negativna korelacija između fenotipova boli
i „anti-ADCC“ modula (visoka razina sržne fukoze, bez račvajućeg N-acetilglukozamina). Rezultati
pokazuju da su glikani obećavajući biomarkeri za mnoge bolesti.
Promjene glikozilacije su nerijetko opisivane u različitim fiziološkim i patološkim stanjima, te kao posljedica stila života. Promjene u metabolizmu tumorskih stanica rezultiraju proizvodnjom ...izmijenjenih glikanskih struktura, koje imunosni sustav prepoznaje i generira nova protuglikanska protutijela. Prisustvo i probir ovih protutijela je analiziran pomoću glikanskih čipova, a glikozilacija imunoglobulina G (IgG) pročišćavanjem iz plazme, i kromatografskom analizom glikana. Rezultati istraživanja su pokazali da postoje značajne razlike između zdravih osoba i oboljelih od raka. Vezanje protutijela je dalo pozitivne rezultate na 24 od 48 glikanskih struktura uz značajnu statističku značajnost između izučavanih grupa. Analiza glikozilacije IgG-a je pokazala da 10 od 23 kromatografska vrška mijenjaju udio unutar kromatograma u raku debeloga crijeva, a promjene galaktozilacije su jedan od pokazatelja pojave i napretka bolesti. Razumijevanje promjena glikozilacije imunoglobulina G i interakcija koje se događaju između ovih proteina i ugljikohidrata, a koje su izražene u različitim bolesnim stanjima, važno je za razumijevanje biologije tumorskih stanica.
Glycosylation changes are often described in different physiological processes and pathological conditions and as a lifestyle effect. Alterations in cancer cells metabolism result in the production of altered glycan structures, which are being recognized by the immune system that result in generation of novel anti-glycan antibodies. Presence and screening of antibodies was performed using glycan arrays. Immunoglobulin G (IgG) glycosylation was performed using plasma purification and glycan chromatography. Results show significant differences between healthy individuals and those with cancer. Antibody binding to 24/48 glycans give positive results with great statistical significance between studied sample groups. IgG glycosylation analysis shows that 10/23 glycan chromatographic peaks are changed in colorectal cancer and that galactosylation is one of the main indicators of appearance and progression of the disease. Understanding of IgG glycosylation changes and protein-glycan interactions, and the fact they are effective in numerous diseases are important for understanding biology of cancer cells.
Promjene glikozilacije su nerijetko opisivane u različitim fiziološkim i patološkim stanjima, te kao posljedica stila života. Promjene u metabolizmu tumorskih stanica rezultiraju proizvodnjom izmijenjenih glikanskih struktura, koje imunosni sustav prepoznaje i generira nova protuglikanska protutijela. Prisustvo i probir ovih protutijela je analiziran pomoću glikanskih čipova, a glikozilacija imunoglobulina G (IgG) pročišćavanjem iz plazme, i kromatografskom analizom glikana. Rezultati istraživanja su pokazali da postoje značajne razlike između zdravih osoba i oboljelih od raka. Vezanje protutijela je dalo pozitivne rezultate na 24 od 48 glikanskih struktura uz značajnu statističku značajnost između izučavanih grupa. Analiza glikozilacije IgG-a je pokazala da 10 od 23 kromatografska vrška mijenjaju udio unutar kromatograma u raku debeloga crijeva, a promjene galaktozilacije su jedan od pokazatelja pojave i napretka bolesti. Razumijevanje promjena glikozilacije imunoglobulina G i interakcija koje se događaju između ovih proteina i ugljikohidrata, a koje su izražene u različitim bolesnim stanjima, važno je za razumijevanje biologije tumorskih stanica.
Sažetak Upalna bolest crijeva je kroniĉni upalni poremećaj gastrointestinalnog trakta za koji se smatra da je rezultat meĊudjelovanja genskih i okolišnih ĉimbenika. Genetiĉka israţivanja su pokazala ...da postoji povezanost gena koji sudjeluju u regulaciji glikozilacije IgG-a i upalne bolesti crijeva. N-glikozilacija IgG-a utjeĉe na njegovu strukturu i imunološku funkciju. U ovoj disertaciji analizirana je N-glikozilacija IgG-a kod 804 pacijenta s upalnom bolesti crijeva i zdravih ispitanika, što je dosad najveće istraţivanje glikana u upalnoj bolesti crijeva. Pokazano je da su galaktozilirane glikoforme IgG-a statistiĉki znaĉajno manje zastupljene kod pacijenata koji boluju od Crohnove bolesti i ulceroznog kolitisa u odnosu na zdrave ispitanike. Monosijalinizirane glikoforme su statistiĉki znaĉajno manje zastupljene kod pacijenata koji boluju od Crohnove bolesti. Uoĉena je veća zastupljenost glikoformi s raĉvajućim GlcNAc-om u upalnoj bolesti crijeva u odnosu na zdrave ispitanike. IgG ima potencijal kao dijagnostiĉki i prognostiĉki biomarker za upalnu bolest crijeva. Tijekom studije evaluirana je metoda HILIC-UPLC, te je razvijena, optimirana i validirana nova visoko-protoĉna metoda priprave N-glikana za analizu tekućinskom kromatografijom. Poboljšanje metodologije će omogućiti toĉniju i informativniju analizu N-vezanih glikana u budućnosti.
Inflammatory bowel disease is chronic inflammatory disorder of the gastrointestinal tract which is considered to be the result of the interaction of genetic and environmental factors. Genetic studies have shown pleiotropy between IgG glycosylation and inflammatory bowel disease. IgG N-glycosylation affects its structure and immune function. IgG N-glycosylation in 804 inflammatory bowel disease patients and healthy controls was analyzed within this dissertation, which makes it the largest study of glycans in inflammatory bowel disease. The results demonstrated statistically significant decrease in IgG galactosylation in Crohn's disease and ulcerative colitis compared to healthy controls, as well as statistically significant decrease in IgG monosialylation in Crohns disease. Increase in proportion of structures with bisecting GlcNAc was observed in inflammatory bowel disease patients compared to healthy controls. Therefore, IgG has a potential as diagnostic and prognostic biomarker for inflammatory bowel disease. Within this dissertation HILIC-UPLC method was validated, and new high-throughput preparation method for N-glycan analysis by liquid chromatography was developed, optimized, and validated. Improved methodology will enable more accurate and informative N-glycan analysis in the future.
Imunoglobulin G (IgG) smatra se jednim od modulatora imunog odgovora u atopijskim bolestima, najčešće putem interakcija s Fcγ receptorima (FcγR) na površini imunoloških efektorskih stanica, a ...naročito inhibitornog receptora FcγRIIB. Diferencijalna N-glikozilacija Fc regija IgG utječe na afinitet IgG za FcγR, te stoga možda predstavlja jedan od mehanizama regulacije imunog odgovora u atopijskim bolestima. Ukupni N-glikom plazme (engl. total plasma N-glycome, TPNG) i N-glikom IgG djece po sastavu i dobnoj dinamici razlikuju se od onog u odraslih, što zahtijeva odvojene analize N-glikoma ove dvije populacije. Kako bi se utvrdilo postoji li povezanost između specifičnog N-glikoprofila IgG i atopijskih bolesti u pedijatrijskoj populaciji, ova studija ispitala je TPNG i N-glikoprofil IgG u djece koja pate od atopijskih bolesti i zdrave djece. Prikupljena je periferna krv 61 pedijatrijskog pacijenta i 74 zdrave djece oba spola starosti od 5 do 18 godina. Plazma je odvojena centrifugiranjem, te IgG izoliran afinitetnom kromatografijom pomoću proteina G. TPNG je ispitan tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti s hidrofilnim interakcijama, a N-glikom IgG tekućinskom kromatografijom ultravisoke učinkovitosti s hidrofilnim interakcijama. N-glikozilacijski profil IgG kod djece s atopijom pokazao se specifičnim za ovaj protein, te različitim od onog kod zdrave djece. Udio većine jednostavnih, manjih, nesijaliniziranih struktura u ukupnim N-glikanima IgG manji je, a udio većih, većinom sijaliniziranih složenih struktura uglavnom veći kod djece s atopijom. Udio sijaliniziranih (naročito disijaliniziranih), digalaktoziliranih i sržno fukoziliranih (većinom bez presijecajućeg GlcNAc) struktura veći je, dok je udio agalaktoziliranih struktura i udio struktura s presijecajućim GlcNAc manji nego kod zdrave djece, što je u načelu suprotno od glikoprofila IgG i drugih proteina koji uobičajeno karakteriziraju upalna stanja. Analiza N-glikozilacije IgG ima zbog toga potencijal da se razvije u predispozicijski, dijagnostički i/ili prognostički marker za atopijske bolesti kod djece, te pruža temelj za istraživanje ovog područja s ciljem razvoja novih vrsta bioloških terapeutika za liječenje atopijskih bolesti.
Immunoglobulin G (IgG) is considered one of modulators of immune response in atopic diseases, most often through interactions with Fcγ receptors (FcγR) on the surface of immune effector cells, and especially with the inhibitory receptor FcγRIIB. Differential N-glycosylation of IgG Fc regions affects the IgG affinity for FcγR, and thus maybe represents one of regulatory mechanisms of immune response in atopic diseases. Children's total plasma N-glycome (TPNG) and IgG N-glycome differ in composition and age dynamics from those found in adults, requiring independent N-glycome analyses of the two populations. To verify the existence of an association between a specific IgG N-glycoprofile and atopic diseases in pediatric population, this study examined TPNG and IgG N-glycoprofile in atopic vs. healthy children. Peripheral blood was collected from 61 patients and 74 healthy controls of both sexes aged 5-18 years. Plasma was separated by centrifugation and IgG isolated by affinity chromatography using protein G. TPNG was examined by hydrophilic interaction high performance liquid chromatography, and IgG N-glycome by hydrophilic interaction ultra performance liquid chromatography. A protein specific IgG N-glycosylation profile different from the one in healthy children was found. The content of majority of simple, smaller, asialylated structures in total IgG N-glycome was smaller and the content of greater, mainly sialylated complex structures was mostly greater in children with atopy. The content of sialylated (especially disialylated), digalactosilated and core fucosylated (mostly without GlcNAc) structures was greater, while the content of agalactosylated and the content of structures with bisecting GlcNAc was smaller in comparison with healthy children, displaying a glycoprofile in principle opposite from the one usually observed in IgG and other proteins in inflammatory conditions. The analysis of IgG N-glycoslyation thus has the potential to be developed into a predisposition, diagnostic and/or prognostic biomarker for atopic diseases in children, and provides a ground for further research in the area, aiming at the development of novel class of biological therapeutics for the treatment of atopic diseases.
PDF
