Anti-silencing function 1 (ASF1) is a conserved H3-H4 histone chaperone involved in histone dynamics during replication, transcription, and DNA repair. Overexpressed in proliferating tissues including many tumors, ASF1 has emerged as a promising therapeutic target. Here, we combine structural, computational, and biochemical approaches to design peptides that inhibit the ASF1-histone interaction. Starting from the structure of the human ASF1-histone complex, we developed a rational design strategy combining epitope tethering and optimization of interface contacts to identify a potent peptide inhibitor with a dissociation constant of 3 nM. When introduced into cultured cells, the inhibitors impair cell proliferation, perturb cell-cycle progression, and reduce cell migration and invasion in a manner commensurate with their affinity for ASF1. Finally, we find that direct injection of the most potent ASF1 peptide inhibitor in mouse allografts reduces tumor growth. Our results open new avenues to use ASF1 inhibitors as promising leads for cancer therapy. La fonction anti-silencing 1 (ASF1) est un chaperon d'histone H3-H4 conservé, impliqué dans la dynamique des histones pendant la réplication, la transcription et la réparation de l'ADN. Surexprimée dans les tissus en prolifération, y compris dans de nombreuses tumeurs, l'ASF1 est devenue une cible thérapeutique prometteuse. Ici, nous combinons des approches structurelles, informatiques et biochimiques pour concevoir des peptides qui inhibent l'interaction ASF1-histone. En partant de la structure du complexe ASF1-histone humain, nous avons mis au point une stratégie de conception rationnelle combinant la fixation des épitopes et l'optimisation des contacts d'interface pour identifier un puissant inhibiteur peptidique avec une constante de dissociation de 3 nM. Lorsqu'ils sont introduits dans des cellules en culture, les inhibiteurs entravent la prolifération cellulaire, perturbent la progression du cycle cellulaire et réduisent la migration et l'invasion des cellules d'une manière proportionnelle à leur affinité pour l'ASF1. Enfin, nous constatons que l'injection directe du plus puissant inhibiteur du peptide ASF1 dans les allogreffes de souris réduit la croissance des tumeurs. Nos résultats ouvrent de nouvelles voies pour utiliser les inhibiteurs de l'ASF1 comme des pistes prometteuses pour le traitement du cancer.