Akademska digitalna zbirka SLovenije - logo
VSE knjižnice (vzajemna bibliografsko-kataložna baza podatkov COBIB.SI)
  • Razvoj metode za izolacijo izmenjevalnega dejavnika GRAB = Development of a method for isolation of an exchange factor GRAB : diplomska naloga
    Jager, Nataša
    Inozitolfosfat kinaze so encimi, ki sodelujejo v metabolizmu sekundarnih signalnih molekul, inozitolfosfatov. Inozitolheksakisfosfat kinaza (InsP6K) pretvarja inozitolheksakisfosfat (InsP6) v visje ... inozitolfosfate oz. pirofosfate, difosfoinozitol pentakisfosfat (InsP7), ki vsebuje eno pirofosfatno skupino, in bis difosfoinozitol tetrakisfosfat (InsP8), ki vsebuje dve pirofosfatni skupini. Te male energetsko bogate molekule sodelujejo pri popravljanju DNA, transportu mRNA iz jedra in dinamiki sinaptiènih membran ter pri vezikularnem transportu. Iz literature je tudi znano, da InsP6K1, ki je ena izmed izooblik kinaze, reagira z GRAB om (izmenjevalcem gvaninskega nukleotida za Rab3A). GRAB uravnava sprosèanje nevrotransmiterjev preko Rab3A. Za preuèevanje GRAB-a smo se odloèili iz dveh razlogov. Zanima nas metabolizem inozitol pirofosfatov, zato bi radi razlozilimehanizem njihovega nastanka in doloèili tridimenzionalno strukturo InsP6K. Zaradi tendence tega proteina do domnevno nefizioloske oligomerizacijepri pogojih izolacije rekombinantne InsP6K1, isèemo resitev tega problema v tvorbi kompleksa kinaze z efektorsko molekulo, v nasem primeruz GRAB om. Kot nadgradnja tega, pa nas zanima seveda tudi narava interakcij med njima in njihov bioloski pomen. Zato smo se torej odloèili razviti metodo za izrazanje tega proteina v Escherichii coli. Podganji GRAB smo klonirali v ekspresijske vektorje (plazmida SKB2 in pGEX-6p2) ter iskali optimalne pogoje za ekspresijo in èisèenje proteina. Trenutno najbolj ustrezenkonstrukt je plazmid SKB2, ki nosi zapis za GRAB in le-ta ima na N terminalnem delu pripet afinitetni repek iz sestih molekul histidina. Celice so rastle v mediju Luria-Bertani in po indukciji z izopropil Ž-D-tiogalaktopiranozidom (IPTG) eksprimirale protein preko noèi (12 do 18 ur)na 20 °C. Za èisèenje smo najprej uporabili afinitetno kolono, ki ima na nosilec vezano nikelj nitriltriocetno kislino (Ni NTA). Po cepitvi afinitetnega repka s proteazo in odstranitvi le-te z vezavo na Glutathione Sepharose 4 Fast Flow, sta se kot najbolj primerna nadaljnja stopnja izkazala kationsko izmenjevalna kromatografija ali afinitetna kromatografija na heparinu. Zadnja faza èisèenja je bila gelska filtracija, ki loèuje molekule na osnovi velikosti. Protein GRAB smo sprali s kolone pri volumnu, ki ustreza molekulam veèjih molekulskih mas, in sicer smo dobili dva vrhova, ki ustrezatatrimeru in heksameru. Oba vrhova sta poleg GRAB-a vsebovala tudi proteine z nizjo molekulsko maso. Po vrsti poskusov smo ugotovili, da so ti proteini z nizjo molekulsko maso GRAB, ki so se mu odcepili krajsi fragmenti na N-terminalnem delu. To smo potrdili z analizo aminokislinskega zaporedja. Nasi rezultati so pokazali, da za bolj homogen produkt, ki je potreben za strukturne studije proteinov (predvsem proteinsko kristalografijo) potrebujemonov konstrukt GRAB a. Nasa prihodnja naloga je pripraviti razliène konstrukte GRAB-a z delno krajsim N-terminalnim koncem in jih nato izolirati in oèistiti po postopkih, ki smo jih uporabili v tej nalogi.
    Vrsta gradiva - diplomsko delo
    Založništvo in izdelava - Ljubljana : [Jager, N.], 2006
    Jezik - slovenski
    COBISS.SI-ID - 1892465

Knjižnica/institucija Kraj Akronim Za izposojo Druga zaloga
Fakulteta za farmacijo, Ljubljana Ljubljana FFALJ v čitalnico 1 izv.
loading ...
loading ...
loading ...

Vnos na polico