Akademska digitalna zbirka SLovenije - logo
VSE knjižnice (vzajemna bibliografsko-kataložna baza podatkov COBIB.SI)
  • Vpeljava tehnologije kapljične digitalne verižne reakcije s polimerazo v razvoj bioloških zdravil = Implementation of droplet digital polymerase chain reaction technology in biological drugs development : magistrski študij laboratorijska biomedicina
    Dermota, Tjaša
    Kapljična digitalna verižna reakcija s polimerazo (ddPCR) je novejša oblika digitalne verižne reakcije s polimerazo (dPCR). Metoda temelji na tvorbi približno 20.000 kapljic, ki nastanejo v emulziji ... voda v olju (V/O), verižni pomnožitvi s polimerazo in končni absolutni kvantifikaciji kapljic s prisotnim pomnoženim produktom. Metoda je uporabna na številnih področjih, v okviru magistrske naloge pa smo želeli preveriti, če jo lahko uporabljamo tudi za razvoj rekombinantnih bioloških učinkovin v biofarmacevtski industriji. Pri izbiri ustreznih klonov igra ključno vlogo karakterizacija števila kopij, integritete in stabilnosti transgena. V podjetju Lek d.d. v ta namen uporabljajo verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (qPCR) in metodo prenosa po Southernu, ki pa ju želijo nadomestiti z novejšo metodo - ddPCR. Metodo ddPCR smo najprej optimizirali in nato preverili njeno uporabnost za genetsko karakterizacijo klonov ovarijskih celic kitajskega hrčka (CHO), uporabljenih v proizvodnji rekombinantnih proteinov, zlasti monoklonskih protiteles. Preverili smo analitske parametre ddPCR pri določanju števila kopij in integritete vstavljenih transgenov, izražanja lahke in težke verige protiteles v celičnih linijah in možnost uporabe ddPCR za kvantifikacijo rezidualne DNA v različnih stopnjah čiščenja zdravilne učinkovine. Določili smo široko dinamično območje, ki ga pokriva ddPCR tako za določanje koncentracije DNA (4 % 8000 kopij/[mikro]L), kot tudi mRNA (8 % 20.000 kopij/[mikro]L). Gre za visoko občutljivo metodo, saj je limita detekcije 1,5 % 3 kopije tarčnega gena/[mikro]L pri vzorcih DNA, ter 1,2 kopij/[mikro]L pri RNA vzorcih. Variabilnost metode pri kvantifikaciji DNA se giblje med 10 in 15 % in je nekoliko višja pri uporabi barvila EvaGreen v primerjavi s hidrolizirajočimi sondami. DdPCR smo primerjali z uveljavljenimi metodami in ugotovili, da je metoda primerna za določanje števila kopij in izražanja transgenov ter rezidualne DNA. Pri preverjanju integritete vstavljenih transgenov je ddPCR izkazala 80 % občutljivost, 88 % specifičnost in 82 % točnost glede na metodo prenosa po Southernu. Pri določanju stabilnosti vstavljenih transgenov je ddPCR izkazala 40 % občutljivost, 100% specifičnost ter 70 % točnost glede na prenos po Southernu. V razvoju bioloških zdravil je metoda ddPCR primerna za preverjanje integritete transgenov in določanje števila kopij pri presejanju klonov, saj je hitrejša in v primeru določanja števila kopij tudi točnejša. Za uporabo pri določanju stabilnosti pa bi ddPCR potrebovala še nadaljnjo optimizacijo.
    Vrsta gradiva - magistrsko delo ; neleposlovje za odrasle
    Založništvo in izdelava - Ljubljana : [T. Dermota], 2021
    Jezik - slovenski
    COBISS.SI-ID - 52884483

    Povezava(-e):

    https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=124802

Knjižnica/institucija Kraj Akronim Za izposojo Druga zaloga
Fakulteta za farmacijo, Ljubljana Ljubljana FFALJ v čitalnico 1 izv.
loading ...
loading ...
loading ...

Vnos na polico