Akademska digitalna zbirka SLovenije - logo
VSE knjižnice (vzajemna bibliografsko-kataložna baza podatkov COBIB.SI)
  • Cell-penetrating peptide for CRISPR/Cas9 delivery = Celico penetrirajoči peptid za dostavo CRISPR/Cas9 : cargo optimization and homology directed DNA repair enhancement in human cells : optimizacija tovora in izboljšanje homologno usmerjenega popravljanja DNA v človeških celicah : magistrski študij laboratorijska biomedicina
    Roudi, Samantha
    Genske bolezni so posledica sprememb na nivoju DNA, ki jih večinoma zdravimo simptomatsko, ker je za odpravo vzroka bolezni potrebno preurejanje genoma. Do nedavnega znanost ni imela molekularnih ... orodij, s katerimi bi lahko uvedla spremembe v našem genskem zapisu. To se je spremenilo z odkritjem sistema CRISPR/Cas9, bakterijskega obrambnega mehanizma, in spoznanjem, da njegova uporabnost seže onstran obrambe pred virusi. Sistem je tako vsestranski, da lahko z njim preuredimo genom bodisi prokariontskih ali evkariontskih celic, hkrati pa je enostaven za uporabo, kar je ključnega pomena za ogromen napredek, ki smo ga deležni v zadnjem desetletju na področju genskega inženiringa. Cas9 protein je ključni protein tega sistema, ki uporablja RNA molekulo kot vodilo za iskanje tarčnega zaporedja DNA v celici. Cas9 in vodilna RNA (ang. gRNA) skupaj tvorita funkcionalni ribonukleoproteinski kompleks (RNP). Za specifično prepoznavo tarčnega zaporedja v genom sta potrebni dve vrsti interakcij: (1) Cas9 protein % DNA in (2) gRNA-DNA. Protein Cas9 išče tarčno zaporedje v genomu preko specifičnega zaporedja DNA, običajno 3-6 nukleotidov, imenovanega motiv ob protovmesniku (PAM). Ta interakcija proteina Cas9 z zaporedjem PAM na DNA je prvi korak prepoznave tarčnega zaporedja, čemur sledi komplementarno prileganje nukleotidnih baz vodilne RNA s tarčnim zaporedjem DNA. V kolikor sta oba pogoja iskanja tarče izpolnjena, protein Cas9 s svojima dvema endonukleaznima domenama HNH in RuvC cepi obe verigi DNA in tako nastane dvoverižni prelom DNA. Nastanek dvoverižnega preloma na specifičnem tarčnem mestu je pa zgolj prvi korak za uspešno preurejanje genoma. Ti prelomi so ena izmed najbolj škodljivih okvar v celici, ki lahko vodijo v genomsko nestabilnost ali celo celično smrt. Zato ima celica vrsto DNA popravljanih mehanizmov, med katerimi sta najbolj aktivna povezovanje nehomolognih koncev (NHEJ) in popravljanje na podlagi homologije (HDR). Končni rezultat NHEJ mehanizma so raznovrstne insercije in delecije (indels) na mestu dvoverižnega preloma, ki pogosto privedejo do nastanka mutacije s spremembo bralnega okvirja. Ta mehanizem je uporaben predvsem, ko želimo onesposobiti funkcijo gena (ang. knockout). HDR mehanizem potrebuje donorsko matrično DNA, na podlagi katere lahko uvede želene spremembe DNA na mestu dvoverižnega preloma in se zato imenuje tudi popravljalni mehanizem brez napak. Ta mehanizem torej omogoča spremembe v genomu po %naših željah%, vendar ga je težko doseči, saj je najbolj aktiven v fazah S in G2 celičnega cikla, ko se celica pripravlja na delitev, poleg tega pa potrebuje še dodatno komponento % donorsko DNA, ki pa jo je večinoma težko dostaviti v celico istočasno s Cas9 proteinom. Prav dostava komponent za preurejanje genoma je ključnega pomena za uporabnost te metode in vitro kot tudi in vivo. Cas9 lahko dostavimo v treh molekularnih oblikah % DNA, mRNA ali kot Cas9 RNP, od katerih ima slednji številne prednosti kot so višji učinek tarčnega ciljanja (on-target) zaradi prehodne aktivnosti v celici, zmanjšana insercijska mutageneza, nadzorovano odmerjanje in hiter učinek preurejanje genoma, saj se izogne procesom transkripcije in translacije. Drug vidik dostave Cas9 kot terapevtskega zdravila so dostavni vektorji, ki jih v grobem delimo na virusne in ne-virusne vektorje. Virusni vektorji, posebno z adenovirusom asociirani vektorji (AAV), ki so že v kliničnih preizkušanjih za dostavo Cas9, so trenutno najučinkovitejše orodje za dostavo Cas9 v celice, vendar so z njimi neločljivo povezana tudi tveganja imunogenosti in karcinogeneze zaradi insercijske mutageneze. Zaradi teh razlogov je prisotna velika potreba po razvoju učinkovitih ne-virusnih vektorjev za področje genskega inženiringa. V tej nalogi smo se osredotočili na uporabo ne-virusnih vektorjev, tako imenovanih celico penetrirajočih peptidov (CPP) za dostavo kompleksa Cas9 RNP. CPP-ji so kratki peptidi dolgi do 30 aminokislin, običajno amfipatične narave s hidrofobnim delom na eni strani in kationskim delom na drugi strani [alfa]-vijačnice, ki so sposobni tvoriti nanokomplekse s številnimi biološkimi molekulami bodisi preko kovalentnih ali nekovalentnih interakcij. Amfipatični peptidi, ki smo jih uporabili v tej nalogi, poimenovani PepSE, tvorijo nanokomplekse preko nekovalentnih interakcij z negativno nabito površino kompleksa Cas9 RNP. Osrednje vprašanje naloge je, ali lahko s povečanjem negativnega naboja kompleksa Cas9 RNP izboljšamo učinkovitost dostave in preurejanja genoma v celici. Naboj na Cas9 RNP smo povečali na različne načine s fuzijskimi proteini. Prvi fuzijski protein je (-30)dGFP-Cas9, kjer ima deaktivirani zeleni fluorescentni protein (dGFP) na svoji površini dodatnih 30 negativno nabitih stranskih skupin. Druga fuzijska proteina sta Cas9-MAV in PCV-Cas9, pri katerih smo za povečanje negativnega naboja uporabili strategijo povezovanja MAV in PCV proteinov z enovijačnimi DNA oligonukleotidi (ssODN). Z biotinom konjugiran oligonukleotid tvori nekovalentno povezavo z monoavidinom (MAV), medtem ko je PCV protein z oligonukleotidom povezan s kovalentno vezjo. PCV je endonukleaza, ki izvira iz svinjskega cirkovirusa in preko prepoznave specifičnega zaporedja enovijačne DNA tvori kovalentno vez. Osrednja metoda prvega eksperimentalnega dela je bila pretočna citometrija, s katero smo ovrednotili delež celic s preurejenim genomom. Za to smo uporabili celice HEK 293T s stabilno vgrajenim reporterskim sistemom Stop-Light, pri katerem celice konstantno izražajo rdeč fluorescentni protein (RFP), izražanje GFP-ja pa je odvisno od nastanka indel-ov na mestu dvoverižnega preloma. CPP nanokomplekse s Cas9 konstrukti smo tvorili v naraščajočih molarnih razmerjih Cas9: CPP (od 1:25 do 1:200) in izbrali najučinkovitejše razmerje posameznega konstrukta za kasnejše ovrednotenje z odmerkom povezanega odziva (od 1 ng do 100 ng Cas9 RNP kompleksa dodanega k celicam). V tem delu smo prišli do zaključka, da povečanje negativnega naboja Cas9 v splošnem ne prispeva k izboljšanju učinkovitosti dostave in preurejanja genoma. Kljub vsemu sta konstrukta PCV-Cas9 (fuzijski Cas9 protein, ki prepozna specifično zaporedje enoverižne DNA in tvori kovalentno vez med PCV proteinom in oligonukleotidom) in PCV-Cas9 s kovalentno povezanim oligonukleotidom izkazala aktivnost za preurejanje genoma primerljivo s SpCas9 RNP (nemodificirani Cas9 protein), tako da se je na podlagi teh ugotovitev porodilo novo eksperimentalno vprašanje. V drugem eksperimentalnem delu smo tako poskušali odgovoriti na vprašanje, ali lahko z uporabo CPP-jev kot dostavnega vektorja dosežemo HDR, če PCV-Cas9 kovalentno povežemo s ssODN, ki bo služila kot matrica za HDR. V ta namen smo zasnovali donorsko enoverižno DNA (ssDNA), kjer smo uvedli prepoznavno mesto za restrikcijski encim BcuI na mestu dvoverižnega preloma, kar nam je omogočilo detekcijo HDR-ja z metodo polimorfizma dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP) na agaroznem gelu. Rezultate smo prav tako ovrednotili z metodo sekvenciranja po Sangerju. Dokazali smo, da lahko s PCV-Cas9 RNP s kovalentno povezano donorsko DNA dosežemo s HDR posredovano integracijo želene spremembe v genomu. Čeprav neposredna primerjava z drugimi študijami ni primerna zaradi številnih razlik med pristopi v dostavi Cas9 sistema (npr. izbira celične linije, različni odmerki Cas9, različni dostavni vektorji, itd.), lahko v splošnem trdimo, da smo dosegli stopnjo z HDR preurejenih genov, ki se lahko primerja z najvišjimi rezultati, doseženimi na tem področju. Poleg tega smo ugotovili, da kovalentna vez med donorsko DNA in Cas9 proteinom ni nujno potrebna za uspešno dostavo v celice s PepSE peptidom. PepSE se je tako izkazal kot vsestranski ne-virusni dostavni vektor, ki lahko sočasno posreduje dostavo donorske DNA in Cas9 proteina v celice, ki vodi v uspešno integracijo specifične spremembe v genomu. Zaradi rastoče potrebe po novih učinkovitih ne-virusnih vektorjih za dostavo Cas9 RNP, imajo CPP-ji kot vsestranski vektor, potencial za preboj na tem področju.
    Vrsta gradiva - magistrsko delo ; neleposlovje za odrasle
    Založništvo in izdelava - Ljubljana : [S. Roudi], 2021
    Jezik - angleški
    COBISS.SI-ID - 78070019

Knjižnica/institucija Kraj Akronim Za izposojo Druga zaloga
Fakulteta za farmacijo, Ljubljana Ljubljana FFALJ v čitalnico 1 izv.
loading ...
loading ...
loading ...

Vnos na polico