Abstract
Objectives
A strain of the opportunistic pathogenic yeast Candida lusitaniae was genetically engineered for full-length replacement of the FKS1 gene encoding the target of echinocandin ...antifungals in order to assess the impact of FKS mutations on echinocandin resistance and reduced echinocandin susceptibility (RES).
Methods
FKS1 allelic exchange was achieved by transforming C. lusitaniae with two DNA fragments covering the entire FKS1 ORF. Both fragments overlap a 40 bp region where SNPs or small indels of interest were inserted. To target integration at the FKS1 locus, each DNA fragment was fused with split auxotrophic markers of which complementary truncated parts were previously inserted into the chromosomal regions flanking FKS1, allowing selection on minimal medium.
Results
Three SNPs described in the FKS1 hotspot (HS) regions HS1 or HS2 of clinical isolates of Candida albicans were expressed at an equivalent position in C. lusitaniae and were confirmed to confer either reduced susceptibility (F641V) or full resistance (S645P and R1361G) to caspofungin. The F659 deletion reported in an FKS2 allele of Candida glabrata and the naturally occurring P660A substitution in FKS1 of Candida parapsilosis were shown to confer a 256-fold and 6-fold increase in caspofungin MIC, respectively, when introduced into an FKS1 allele of C. lusitaniae.
Conclusions
We have successfully developed a C. lusitaniae strain for the expression of full-length FKS1 alleles harbouring known mutations contributing to reduced susceptibility or resistance to caspofungin, thus opening the way for the screening of other FKS1/FKS2 mutations potentially involved in RES.
Fungal pathogens from Candida genus are responsible for severe life-threatening infections and the antifungal arsenal is still limited. Caspofungin, an antifungal drug used for human therapy, acts as ...a blocking agent of the cell wall synthesis by inhibiting the β-1,3-glucan-synthase encoded by FKS genes. Despite its efficiency, the number of genetic mutants that are resistant to caspofungin is increasing. An important challenge to improve antifungal therapy is to understand cellular phenomenon that are associated with drug resistance. Here we used atomic force microscopy (AFM) combined to Fourier transform infrared spectroscopy in attenuated total reflection mode (ATR-FTIR) to decipher the effect of low and high drug concentration on the morphology, mechanics and cell wall composition of two Candida strains, one susceptible and one resistant to caspofungin. Our results confirm that caspofungin induces a dramatic cell wall remodelling via activation of stress responses, even at high drug concentration. Additionally, we highlighted unexpected changes related to drug resistance, suggesting that caspofungin resistance associated with FKS gene mutations comes from a combination of effects: (i) an overall remodelling of yeast cell wall composition; and (ii) cell wall stiffening through chitin synthesis. This work demonstrates that AFM combined to ATR-FTIR is a valuable approach to understand at the molecular scale the biological mechanisms associated with drug resistance.
We report on the first cloning and nucleotide sequencing of an ERG11 allele from a clinical isolate of Candida kefyr cross-resistant to azole antifungals. It was recovered from a stem cell transplant ...patient, in an oncohematology unit exhibiting unexpected high prevalence of C. kefyr. Two amino acid substitutions were identified: K151E, whose role in fluconazole resistance was already demonstrated in Candida albicans, and E123Q, a new substitution never described so far in azole-resistant Candida yeast.
Campylobacter spp. bacteremia is a severe infection. A nationwide 5-year retrospective study was conducted to characterize its clinical features and prognostic factors.
The study included patients ...with Campylobacter spp. bacteremia diagnosed in 37 French hospitals participating in the surveillance network of the National Reference Center for Campylobacters and Helicobacters, from 1 January 2015 to 31 December 2019. The goal was to analyze the effects of a delay of appropriate antibiotic therapy and other risk factors on 30-day mortality rates, antibiotic resistance, patient characteristics, and prognosis according to the Campylobacter species.
Among the 592 patients, Campylobacter jejuni and Campylobacter fetus were the most commonly identified species (in 42.9% and 42.6%, respectively). The patients were elderly (median age 68 years), and most had underlying conditions, mainly immunodepression (43.4%), hematologic cancers (25.9%), solid neoplasms (23%), and diabetes (22.3%). C. jejuni and Campylobacter coli were associated with gastrointestinal signs, and C. fetus was associated with secondary localizations. Among the 80 patients (13.5%) with secondary localizations, 12 had endocarditis, 38 vascular, 24 osteoarticular, and 9 ascitic fluid infections. The 30-day mortality rate was 11.7%, and an appropriate antibiotic treatment was independently associated with 30-day survival (odds ratio, 0.47 95% confidence interval, .24-.93; P = .03). The median efficient therapy initiation delay was quite short (2 days interquartile range, 0-4 days) but it had no significant impact on the 30-day mortality rate (P = .78).
Campylobacter spp. bacteremia mainly occurred in elderly immunocompromised individuals with variable clinical presentations according to the species involved. Appropriate antimicrobial therapy was associated with improved 30-day survival.
The incidence of campylobacteriosis has substantially increased over the past decade, notably in France. Secondary localizations complicating invasive infections are poorly described. We aimed to ...describe vascular infection or endocarditis caused by Campylobacter spp. We included 57 patients from a nationwide 5-year retrospective study on Campylobacter spp. bacteremia conducted in France; 44 patients had vascular infections, 12 had endocarditis, and 1 had both conditions. Campylobacter fetus was the most frequently involved species (83%). Antibiotic treatment involved a β-lactam monotherapy (54%) or was combined with a fluoroquinolone or an aminoglycoside (44%). The mortality rate was 25%. Relapse occurred in 8% of cases and was associated with delayed initiation of an efficient antimicrobial therapy after the first symptoms, diabetes, and coexistence of an osteoarticular location. Cardiovascular Campylobacter spp. infections are associated with a high mortality rate. Systematically searching for those localizations in cases of C. fetus bacteremia may be warranted.
Celotno besedilo
Dostopno za:
DOBA, IZUM, KILJ, NUK, ODKLJ, PILJ, PNG, SAZU, SIK, UILJ, UKNU, UL, UM, UPUK
Fungal pathogens from
Candida
genus are responsible for severe life-threatening infections and the antifungal arsenal is still limited. Caspofungin, an antifungal drug used for human therapy, acts as ...a blocking agent of the cell wall synthesis by inhibiting the β-1,3-glucan-synthase encoded by FKS genes. Despite its efficiency, the number of genetic mutants that are resistant to caspofungin is increasing. An important challenge to improve antifungal therapy is to understand cellular phenomenon that are associated with drug resistance. Here we used atomic force microscopy (AFM) combined to Fourier transform infrared spectroscopy in attenuated total reflection mode (ATR-FTIR) to decipher the effect of low and high drug concentration on the morphology, mechanics and cell wall composition of two
Candida
strains, one susceptible and one resistant to caspofungin. Our results confirm that caspofungin induces a dramatic cell wall remodelling
via
activation of stress responses, even at high drug concentration. Additionally, we highlighted unexpected changes related to drug resistance, suggesting that caspofungin resistance associated with FKS gene mutations comes from a combination of effects: (i) an overall remodelling of yeast cell wall composition; and (ii) cell wall stiffening through chitin synthesis. This work demonstrates that AFM combined to ATR-FTIR is a valuable approach to understand at the molecular scale the biological mechanisms associated with drug resistance.
AFM was combined to vibrational spectroscopy to decipher morphological, mechanical and biochemical changes induced by caspofungin treatment on
Candida
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Les échinocandines altèrent la synthèse de la paroi fongique en inhibant la β-(1-3)-D-glucane synthétase, codée par les gènes FKS. Des mutations dans deux régions « Hot Spot » (HS) très conservées ...des gènes FKS ont été décrites dans des cas de résistances acquises aux échinocandines chez les levures Candida. Les souches résistantes sont caractérisées au niveau phénotypique (mesure des CMIs et de l’activité enzymatique) et génotypique (séquençage généralement limité aux régions HS). Faute d’un bon modèle biologique, et à cause de la grande taille des gènes FKS (5–6kb), peu de mutations ont été caractérisées par remplacement d’allèle chez les levures Candida.
L’objectif de ce travail est de construire une souche de Candida lusitaniae génétiquement modifiée pour exprimer des allèles FKS mutés.
C. lusitaniae est une levure haploïde appartenant au clade CTG des Candida. La souche utilisée est une souche auxotrophe pour le tryptophane et l’uracile (6936 ura3Δ990 trp1Δ798), dans laquelle des demi-marqueurs d’auxotrophie trp1 et ura3 ont été implantés dans les régions 5′ et 3′ du gène FKS1.
Le remplacement de l’allèle résident sauvage FKS+ est effectué par l’apport de deux fragments d’ADN qui vont reconstituer des marqueurs d’auxotrophie fonctionnels de part et d’autre du gène FKS. Un fragment porte la partie 3′ du gène TRP1 et la partie 5′ du gène FKSmut, et un fragment porte la partie 3′ du gène FKSmut et la partie 5′ du gène URA3. Ces deux fragments sont co-transformés dans la souche réceptrice, recombinent in cellulo pour former un seul fragment qui s’intègre au locus FKS par double crossing-over. Cette recombinaison aboutit à une souche prototrophe exprimant l’allèle FKSmut.
Trois mutations déjà connues du gène FKS ont été introduites pour la validation du modèle : les mutations F641V et S645P dans HS1 et R1361G dans HS2. À l’issue du remplacement d’allèle, les CMIs aux échinocandines ont été déterminées par la méthode des E-Test et par dilution en milieu liquide.
Cette souche de C. lusitaniae génétiquement modifiée pour permettre l’expression d’un allèle FKS complet ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude d’une grande diversité de mutations, notamment dans les régions hors HS, et pour l’expression hétérologue de différents allèles de Candida spp. chez C. lusitaniae.
Les mécanismes de résistance aux antifongiques azolés et aux échinocandines reposent en grande partie sur des mutations des gènes codant la cible. Chez les levures du genre Candida, il s’agit du gène ...codant la protéine Erg11, la lanostérol déméthylase de la voie de biosynthèse de l’ergostérol, qui est la cible des azolés, et du gène codant la protéine Fks1, la 1,3-ß-D-glucan synthase, cible des échinocandines. Le séquençage nucléotidique des gènes ERG11 et FKS1 a permis de mettre en évidence de nombreux polymorphismes nucléotidiques (SNP) chez des isolats résistants. Néanmoins, le rôle des SNP dans la résistance aux antifongiques n’a été démontré que pour très peu d’entre eux, soit par la mesure de l’activité enzymatique en présence ou en absence de l’inhibiteur, ou bien par l’expression hétérologue d’un allèle muté dans une espèce modèle de levure, généralement Saccharomyces cerevisiae. Or, cette espèce est peu sensible aux antifongiques azolés, et elle n’appartient pas au clade CTG des Candida (qui décodent préférentiellement le codon CTG en sérine au lieu d’une leucine), ce qui nécessite le cas échéant de corriger les codons des allèles ERG11 ou FKS1 de Candida avant qu’il ne soient exprimés chez S. cerevisiae.
Dans cette étude, nous décrivons une méthode d’ingénierie génétique originale pour effectuer du remplacement d’allèle chez une espèce de Candida sensible à tous les antifongiques utilisés par voie systémique, Candida lusitaniae. C’est une espèce haploïde qui appartient au clade CTG des Candida, dont le génome est séquencé et pour laquelle nous disposons de tous les outils moléculaires pour modifier le génome. Pour cibler l’intégration de l’allèle muté par recombinaison homologue en lieu et place de l’allèle sensible normalement exprimé par la levure, nous avons développé une stratégie qui consiste à implanter à proximité des allèles à remplacer des demi-marqueurs d’auxotrophie non-fonctionnels. La partie manquante du marqueur d’auxotrophie est amenée avec l’allèle ERG11 ou FKS1 portant la mutation à analyser, ce qui permet de sélectionner les levures ayant effectué le remplacement d’allèle sur des milieux synthétiques simples. Cette technique permet l’expression hétérologue des allèles ERG11 de différentes espèces de levure chez C. lusitaniae, notamment de C. albicans sans avoir d’effet de trailing ou de double ellipse lors de la détermination des CMI. Elle permet en outre d’étudier l’effet de plusieurs SNPs combinés au sein d’un même allèle. Dans le cas du gène FKS1, et à cause de sa grande taille (environ 6 kbp), le remplacement complet de l’allèle est effectué en deux parties grâce à ce qui s’apparente à un pontage moléculaire. Cette stratégie a été validée par l’expression chez C. lusitaniae des mutations de résistance les plus courantes et permettra d’étudier plus facilement le rôle de SNPs en dehors des régions Hot Spot.
Non-English title Accoceberry, Isabelle; Couzigou, Celia; Rougeron, Amandine ...
Journal de mycologie médicale,
09/2015, Letnik:
25, Številka:
3
Journal Article
Recenzirano
Original Abstract: Les mecanismes de resistance aux antifongiques azoles et aux echinocandines reposent en grande partie sur des mutations des genes codant la cible. Chez les levures du genre ...Candida, il s'agit du gene codant la proteine Erg11, la lanosterol demethylase de la voie de biosynthese de l'ergosterol, qui est la cible des azoles, et du gene codant la proteine Fks1, la 1,3-s-D-glucan synthase, cible des echinocandines. Le sequencage nucleotidique des genes ERG11 et FKS1 a permis de mettre en evidence de nombreux polymorphismes nucleotidiques (SNP) chez des isolats resistants. Neanmoins, le role des SNP dans la resistance aux antifongiques n'a ete demontre que pour tres peu d'entre eux, soit par la mesure de l'activite enzymatique en presence ou en absence de l'inhibiteur, ou bien par l'expression heterologue d'un allele mute dans une espece modele de levure, generalement Saccharomyces cerevisiae. Or, cette espece est peu sensible aux antifongiques azoles, et elle n'appartient pas au clade CTG des Candida (qui decodent preferentiellement le codon CTG en serine au lieu d'une leucine), ce qui necessite le cas echeant de corriger les codons des alleles ERG11 ou FKS1 de Candida avant qu'il ne soient exprimes chez S. cerevisiae. Dans cette etude, nous decrivons une methode d'ingenierie genetique originale pour effectuer du remplacement d'allele chez une espece de Candida sensible a tous les antifongiques utilises par voie systemique, Candida lusitaniae. C'est une espece haploide qui appartient au clade CTG des Candida, dont le genome est sequence et pour laquelle nous disposons de tous les outils moleculaires pour modifier le genome. Pour cibler l'integration de l'allele mute par recombinaison homologue en lieu et place de l'allele sensible normalement exprime par la levure, nous avons developpe une strategie qui consiste a implanter a proximite des alleles a remplacer des demi-marqueurs d'auxotrophie non-fonctionnels. La partie manquante du marqueur d'auxotrophie est amenee avec l'allele ERG11 ou FKS1 portant la mutation a analyser, ce qui permet de selectionner les levures ayant effectue le remplacement d'allele sur des milieux synthetiques simples. Cette technique permet l'expression heterologue des alleles ERG11 de differentes especes de levure chez C. lusitaniae, notamment de C. albicans sans avoir d'effet de trailing ou de double ellipse lors de la determination des CMI. Elle permet en outre d'etudier l'effet de plusieurs SNPs combines au sein d'un meme allele. Dans le cas du gene FKS1, et a cause de sa grande taille (environ 6 kbp), le remplacement complet de l'allele est effectue en deux parties grace a ce qui s'apparente a un pontage moleculaire. Cette strategie a ete validee par l'expression chez C. lusitaniae des mutations de resistance les plus courantes et permettra d'etudier plus facilement le role de SNPs en dehors des regions Hot Spot.
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