La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la présence d'enchevêtrements neurofibrillaires et de plaques séniles. Le composant majoritaire des plaques séniles est ...le peptide amyloïde Aβ.Dans une première partie de cette thèse, l'objectif a été de caractériser la toxicité du peptide Aβ25-35 après son injection au niveau des ventricules latéraux chez le rat au cours du temps. Nous avons ainsi pu démontrer, entre autre, qu'une seule injection, engendre des déficits mnésiques à court et à long terme qui persistent six semaines après l'injection. Nous avons également montré, entre autre, une astrogliose, une microgliose, une élévation du stress oxydant, ainsi que des phénomènes apoptotiques dans les différentes structures cérébrales étudiées. Le deuxième objectif de cette thèse a été de caractériser le rôle du peptide Aβ25-35 dans la régulation de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) au cours du temps. Dans un premier temps nous avons démontré une hyperactivité de l'axe, qui se caractérise par une modification de l'expression des hormones et une modification d'expression et de localisation des récepteurs aux glucocorticoïdes (GC). Nous avons montré que l'injection d'Aβ25-35 induisait un comportement anxieux. Néanmoins la fonctionnalité du rétrocontrôle négatif des GC reste intacte. Alors que l'injection de l'Aβ25-35 modifie la réponse de l'axe HPA à un stress. Nos résultats, dans un modèle pathomimétique, de la MA, montrent que la toxicité amyloïde modifie la fonctionnalité et la réactivité de l'axe HPA, ce qui pourrait participer à la pathophysiologie de la MA.
Alzheimer's disease (AD) is characterized by neurofibrillary tangles and seniles plaques. The major component of senile plaques is the amyloid-β peptide (Aβ). In a first part of this thesis, we characterized the time course toxicity effect of the Aβ25-35 intracerebroventricular (icv) injection in the rat brain. We particulary demonstrated, that only one injection induced memories impairments at short and long term which persisted six weeks after the icv injection. We also shown, a sustain astrogliosis and microgliosis, oxidative stress, apoptotics processes in the differents brain structure of interest.In a second part of this thesis, we characterized the time course impact of Aβ25-35 on hypothalamo-pituitary-adrenal axis during the time. First, we demonstrated an the hyperactivity of the axis, which is characterized by modifications of hormonal concentration associated with modification of the expression and localization of glucocorticoids (GC) receptors. We also demonstrated Aβ25-35 an anxious behavioural in animals. Nevertheless, the functionality of negative feedback is not modified. However, Aβ25-35 injection modify the HPA axis reactivity after acute stress. In conclusions, we shown, in a pathomimetic model of AD that the Aβ25-35 toxicity modifes the reactivity and the functionality of HPA axis, that could be partly involved in the pathophysiology of AD.
Cardiac natriuretic peptides (including ANP, BNP, CNP and urodilatin) constitute a family of peptide hormones and neurotransmitters, sharing similar chemical structure (characterized by a cysteine ...bridge) and biological function. ANP and BNP are cardiac hormones because they are principally produced and secreted by cardiomyocytes. CNP is principally produced and secreted by endothelial cells, while urodilatin only by renal tubular cells. Natriuretic peptides share a direct diuretic, natriuretic and vasodilator effect and an inhibitory action on ventricular myocyte contraction as well as on remodeling, restenosis and other inflammatory processes of myocardium and smooth muscle cells. Cardiac natriuretic peptides share their biological action by means of specific receptors (NPR), which are present into the cell membranes of target tissues. Three different subtypes of NPRs have been so far identified in mammalian tissues. NPR-A and NPR-B are generally considered to mediate all known biological actions throughout the guanylate cyclase (GC) intracellular domain, while the third member of the natriuretic peptide receptor family, the NPR-C receptor, has not a GC domain. It is generally thought that the NPR-C is not linked to GC and so serves as a clearance receptor. Natriuretic peptides constitute a family sharing both endocrine. paracrine and autocrine actions and neurotransmitter and immuno-modulator functions. Therefore, it can be hypothesized that the cardiac natriuretic peptide system is closely related with other regulatory systems in a biological hierarchical networks.
La découverte d'un contexte génétique chez les streptocoques – codant un petit peptide hydrophobe (SHP) et un régulateur transcriptionnel appartenant à la famille Rgg –, suivi de l'étude d'un de ces ...loci chez S. thermophilus LMD-9, a conduit à l'hypothèse que les protéines régulatrices Rgg en association avec une phéromone putative SHP pourraient intervenir dans un mécanisme de type quorum-sensing (QS) chez les bactéries à Gram positif. La première partie de ma thèse a consisté à confirmer cette hypothèse sur le locus shp/rgg1358 de S. thermophilus LMD-9, espèce contenant le plus grand nombre de systèmes SHP/Rgg dans son génome. Pour ceci, les étapes impliquées dans un mécanisme de QS ont été étudiées : la sécrétion, la maturation et la détection à une concentration seuil de la phéromone, sa réimportation à l'intérieur de la cellule, son interaction avec un régulateur transcriptionnel et enfin l'interaction de la protéine régulatrice à l'ADN. Par l'utilisation d'approches génétiques et biochimiques, nous avons démontré l'existence d'un nouveau mécanisme de QS impliquant pour la première fois un régulateur transcriptionnel Rgg et une phéromone SHP, importée à l'intérieur de la cellule par le transporteur d'oligopeptides AmiCDEF. Le rôle de la protéase membranaire, Eep, a également été démontré dans la maturation de la phéromone, dont la forme mature a été déterminée par spectrométrie de masse et validée in vivo. Dans un second temps, nous avons exploré la fonctionnalité de ce nouveau mécanisme sur d'autres loci shp/rgg, dans le but d’étudier l'existence d’éventuels phénomènes de cross-talk entre les bactéries. L'étude de nouveaux loci, en système hétérologue chez S. thermophilus LMD-9, a permis d'étendre la fonctionnalité du mécanisme à deux systèmes SHP/Rgg de streptocoques pathogènes, à savoir S. agalactiae et S. mutans. En parallèle à ce travail de caractérisation, l'identification des régulons des systèmes SHP/Rgg a été entreprise. La construction d'un arbre phylogénétique des protéines Rgg-like a permis d'identifier 68 systèmes SHP/Rgg, que nous avons classés en trois groupes. L'analyse des régions promotrices des gènes shp a conduit à l'identification d'un site putatif de liaison des protéines Rgg à l'ADN spécifiques de chaque groupe SHP/Rgg. Une approche in silico a ensuite été menée afin de rechercher, dans les génomes séquencés de streptocoques, les gènes cibles putatifs. Alors que des cibles proximales ont été détectées pour les groupes II et III, des cibles distales ont été identifiées dans les groupes I et II. Actuellement, la validation de certaines cibles est en cours au laboratoire. A l'avenir, ce travail pourrait permettre le développement de petits peptides permettant d'optimiser l'utilisation de S. thermophilus en industries laitières et de réduire la virulence des streptocoques pathogènes.
The discovery of a genetic context – encoding a small hydrophobic peptide (SHP) and a transcriptional regulator belonging to the Rgg family (in nearly all streptococcal genomes) –, following by the study of one of this loci in S. thermophilus LMD-9, led to the hypothesis that the regulatory proteins Rgg in association with a putative pheromone SHP could define a novel quorum-sensing (QS) regulatory mechanism in Gram-positive bacteria. The first part of my PhD consisted to validate this hypothesis. For this purpose, we analyzed the SHP/Rgg system in all the steps that are commonly involved in QS mechanisms: (i) secretion of the putative pheromone, (ii) maturation of the pheromone, (iii) capture of the pheromone from the external environment at a threshold concentration, (iv) importation of the pheromone inside the cell and (v) interaction of the transcriptional regulator to the promoter regions of targeted genes. Experimentally, we focused on the so-called shp/rgg1358 locus of S. thermophilus LMD-9, which is the streptococcal species containing the largest number of shp/rgg pairs in its genome. By using genetic and biochemistry approaches, we uncovered a new QS mechanism that involves the pheromone SHP, the oligopeptide transporter AmiCDEF for the uptake of the pheromone and the transcriptional regulator Rgg for the control of target gene expression. Furthermore, we showed that the membrane protease Eep participates in the production of the mature pheromone, which has been identified by mass spectrometry. Once characterized, the second part of my PhD was to explore the functionality of this new QS system in other streptococcal strain or species, in order to determine if cross-reactivity phenomenon between streptococci can occur. By using heterologous expression in S. thermophilus LMD-9, we extended the functionality of the SHP/Rgg system to two pathogenic streptococcal species, i.e. S. agalactiae and S. mutans. The last part of my PhD consisted in identifying the regulon of all SHP/Rgg systems. Following the construction of a phylogenetic tree of the Rgg-like proteins in low GC Gram-positive bacteria, we identified 68 SHP/Rgg systems that we classified in three groups. Analyzing the promoter regions of all shp genes led to the identification of a putative Rgg DNA binding site specific to each SHP/Rgg group. An in silico approach was used to scan all sequenced streptococcal genomes for the three identified patterns. Whereas proximal target genes were detected for groups II and III, distal target genes were found in groups I and II. In addition, we uncovered that putative Rgg DNA binding sites can be localized in coding or non-coding region. Currently, validations are in progress. To sum-up, my PhD studies provided evidences that the Rgg proteins in association with small peptide pheromones define a new QS mechanism that seems to regulate the expression of distal and proximal genes in a species-dependent manner. Important insights should be obtained concerning a putative crosstalk among streptococci that involves the SHP/Rgg QS system. My studies may constitute a basis for the development of small peptides to optimize the use of S. thermophilus in dairy factories and reduce the virulence of pathogenic streptococci.
Le niveau de beta-endorphine immunoreactive (beta-END-LI) a ete mesure avec la methode radioimmunologique dans le liquide folliculaire provenant des petits, des grands et des moyens follicules de ...truie au cours de son cycle oestral. La concentration de beta-END-LI dans le liquide folliculaire des petits follicules preleves durant les 1. a 5. jours du cycle a ete au moins 10 fois plus elevee en comparaison avec le liquide des autres follicules, independamment de leur taille ou de la phase du cycle. Le niveau de beta-END-LI dans les petits follicules entre le 6. et le 10. jour a baisse d'une maniere drastique. Ensuite, entre le 11. et le 16. jour, sa concentration a ete elevee et de nouveau reduite durant le pre-oestrus dans le cycle. Les concentrations de beta-END-LI dans le liquide folliculaire des follicules moyens ont ete relativement egales durant les differents moments du cycle (6.-21. jour). Il n'y a pas eu de differences significatives du niveau de beta-END-LI des petits, moyens ou grands follicules entre le 17. et le 21. jour. Neanmoins, les concentrations de beta-END-LI dans les follicules moyens entre le 11. et le 13. et entre le 14. et le 16. jour ont ete statistiquement plus basses en comparaison avec les petits follicules. En outre, l'influence de FSH, de prolactine (PRL), de progesterone (P4), de testosterone (T) et de 17 beta-oestradiol (E2) sur la liberation du beta-END-LI par les cellules de granulosa (GCs) provenant des grands follicules a ete etudiee ainsi que l'effet de l'agoniste des opioides FK 33-824 seul ou en combinaison avec FSH, PRL ou nalaxone (NAL) sur la sterydogenese folliculaire. FSH, suivant la dose, augmente d'une facon drastique la secretion de beta-END-LI. Cet effet stimulateur de la gonadotrophine a ete inhibe par P4 en dose tres elevee (10(5) M). L'influence de PRL et des steroides ajoutes aux cultures sur la secretion de beta-END-LI a ete negligeable. La secretion de P4 induite par FSH ou PRL a ete essentiellement reduite aussi bien sur l'influence de FK 33-824 que sur celle de NAL. Neanmoins, la secretion d'androstendione (A4) et de testosterone par les cellules de granulosa a ete stimulee d'une facon significative par FK 33-824. En presence de NAL, FSH ou de PRL la liberation de A4 stimulee par FK 33-824 a ete reduite au niveau de base. La secretion de E2 a ete completement independante de l'effet de FK 33-824 ou celui de NAL; uniquement la secretion d'oestrone a ete modulee par les deux facteurs sur les cultures auxquelles FSH ou PRL ont ete ajoutes. En resumant, FSH semble etre le facteur cle de la regulation de la secretion de beta-END-LI par les cellules de granulosa chez la truie. En outre, la steroidogenese dans les cellules de granulosa de truie est modulee par les peptides opioides agissant seuls ou bien en interaction avec FSH ou PRL
Traditionnellement associée à la reproduction féminine, l'ocytocine (OT), une hormone peptidique synthétisée par les noyaux paraventriculaire et supraoptique de l'hypothalamus et sécrétée par ...l'hypophyse postérieure (neurohypophyse), a été récemment revue et a été démontrée avoir plusieurs nouveaux rôles dans le système cardio-vasculaire. En effet, notre laboratoire a montré que l’OT peut induire la différenciation des cellules souches embryonnaires (CSE) en cardiomyocytes (CM) fonctionnels. À l’aide du modèle cellulaire embryonnaire carcinomateux de souris P19, il a été démontré que ce processus survenait suite à la libération de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dépendante du monoxyde d’azote. De même, il est connu que le peptide natriurétique auriculaire (ANP), un peptide produit, stocké et sécrété par les myocytes cardiaques, peut aussi induire la production du GMPc. De nombreuses études ont démontré que le cœur ayant subi un infarctus pouvait être régénéré à partir d’une population isolée de cellules souches et progénitrices transplantées. Une de ces populations de cellules, fréquemment isolées à partir d'organes provenant d'animaux aux stades de développement embryonnaire et adulte, appelée « Side Population » (SP), sont identifiées par cytométrie en flux (FACS) comme une population de cellules non marquées par le colorant fluorescent Hoechst 33342 (Ho). Les cellules SP expriment des protéines de transport spécifiques, de la famille ATP-binding cassette, qui ont pour rôle de transporter activement le colorant fluorescent Ho de leur cytoplasme. La sous-population de cellules SP isolée du cœur affiche un potentiel de différenciation cardiaque amélioré en réponse à un traitement avec l’OT. Récemment, l'hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des CSE a été mise en évidence, et cela a été corrélé avec la présence de sous-populations cellulaires ressemblant beaucoup aux cellules SP issues du cœur. Puisque l’ANP peut induire la production du GMPc et qu’il a été démontré que la différenciation cardiaque était médiée par la production du GMPc, alors nous émettons l'hypothèse selon laquelle l’ANP pourrait induire la différenciation cardiaque. Étant donné que les CSE sont composés d’un mélange de différents types cellulaires alors nous émettons aussi l’hypothèse selon laquelle l’utilisation d’une sous-population de CSE plus homogène renforcerait le potentiel de différenciation de l'ANP.
Méthodes : Les SP ont été isolées des cellules P19 par FACS en utilisant la méthode d’exclusion du colorant fluorescent Ho. Puis, leur phénotype a été caractérisé par immunofluorescence (IF) pour les marqueurs de l’état indifférencié, d’auto-renouvellement et de pluripotence octamer-binding transcription factor 4 (OCT4) et stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1). Ensuite, la dose pharmacologique optimale d’ANP a été déterminée via des tests de cytotoxicité sur des cellules P19 (MTT assay). Pour induire la différenciation en cardiomyocytes, des cellules à l’état de sphéroïdes ont été formées à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » sous la stimulation de l’ANP pendant 5 jours. Puis, des cryosections ont été faites dans les sphéroïdes afin de mettre en évidence la présence de marqueurs de cellules cardiaques progénitrices tels que GATA4, Nkx2.5 et un marqueur mitochondrial spécifique Tom22. Ensuite, les cellules SP P19 ont été stimulées dans les sphéroïdes cellulaires par le traitement avec de l'ANP (10-7 M) ou de l’OT (10-7 M), de l’antagoniste spécifique du guanylate cyclase particulé (GCp) A71915 (10-6 M), ainsi que la combinaison des inducteurs OT+ANP, OT+A71915, ANP+A71915. Après la mise en culture, la différenciation en cardiomyocytes a été identifié par l’apparition de colonies de cellules battantes caractéristiques des cellules cardiaques, par la détermination du phénotype cellulaire par IF, et enfin par l’extraction d'ARN et de protéines qui ont été utilisés pour le dosage du GMPc par RIA, l’expression des ARNm par RT-PCR et l’expression des protéines par immunobuvardage de type western.
Résultats : Les sphéroïdes obtenus à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » ont montré une hausse modeste de l’expression des ARNm suivants : OTR, ANP et GATA4 comparativement aux cellules cultivées en monocouches. Les sphéroïdes induits par l’ANP ont présenté une augmentation significative des facteurs de transcription cardiaque GATA4 et Nkx2.5 ainsi qu’un plus grand nombre de mitochondries caractérisé par une plus grande présence de Tom22. De plus, L’ANP a induit l’apparition de colonies de cellules battantes du jour 7 (stade précoce) au jour 14 (stade mature) de façon presque similaire à l’OT. Cependant, la combinaison de l’ANP avec l’OT n’a pas induit de colonies de cellules battantes suggérant un effet opposé à celui de l’OT. Par IF, nous avons quantifié (nombre de cellules positives) et caractérisé, du jour 6 au jour 14 de différenciation, le phénotype cardiaque de nos cellules en utilisant les marqueurs suivants : Troponine T Cardiaque, ANP, Connexines 40 et 43, l’isoforme ventriculaire de la chaîne légère de myosine (MLC-2v), OTR. Les SP différenciées sous la stimulation de l’ANP ont montré une augmentation significative du GMPc intracellulaire comparé aux cellules non différenciées. À notre grande surprise, l’antagoniste A71915 a induit une plus grande apparition de colonies de cellules battantes comparativement à l’OT et l’ANP à un jour précoce de différenciation cardiaque et l’ajout de l’OT ou de l’ANP a potentialisé ses effets, augmentant encore plus la proportion de colonies de cellules battantes. De plus, la taille des colonies de cellules battantes était encore plus importante que sous la simple stimulation de l’OT ou de l’ANP. Les analyses radioimmunologiques dans les cellules SP P19 stimulés avec l’ANP, A71915 et la combinaison des deux pendant 15min, 30min et 60min a montré que l’ANP stimule significativement la production du GMPc, cependant A71915 n’abolit pas les effets de l’ANP et celui-ci au contraire stimule la production du GMPc via des effets agonistes partiels.
Conclusion : Nos résultats démontrent d’une part que l’ANP induit la différenciation des cellules SP P19 en CM fonctionnels. D’autre part, il semblerait que la voie de signalisation NPRA-B/GCp/GMPc soit impliquée dans le mécanisme de différenciation cardiaque puisque l’abolition du GMPc médiée par le GCp potentialise la différenciation cardiaque et il semblerait que cette voie de signalisation soit additive de la voie de signalisation induite par l’OT, NO/GCs/GMPc, puisque l’ajout de l’OT à l’antagoniste A71915 stimule plus fortement la différenciation cardiaque que l’OT ou l’A71915 seuls. Cela suggère que l’effet thérapeutique des peptides natriurétiques observé dans la défaillance cardiaque ainsi que les propriétés vasodilatatrices de certains antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques inclus la stimulation de la différenciation des cellules souches en cardiomyocytes. Cela laisse donc à penser que les peptides natriurétiques ou les antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques pourraient être une alternative très intéressante dans la thérapie cellulaire visant à induire la régénération cardiovasculaire.
Traditionally associated with female reproduction, oxytocin (OT), a peptidic hormone synthesized in the paraventricular and supraoptic nuclei of the hypothalamus and secreted by the posterior pituitary (neurohypophysis), was revisited recently and was revealed to have several new roles in the cardiovascular system. Indeed, our laboratory has shown that OT can induce the differentiation of embryonic stem cells (ESC) into functional cardiomyocytes (CM). On the model of embryonal carcinoma cell line P19, it has been shown that this process occurs following the release of cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent nitric oxide. Similarly, it is known that atrial natriuretic peptide (ANP), a peptide produced, stored and secreted by cardiac myocytes, can also induce the release of cGMP. However, the cellular mechanisms involved in cardiac differentiation are still poorly understood. Numerous studies have shown that the injured heart can be regenerated from an isolated population of transplanted stem and progenitor cells. One of these cell populations, frequently isolated from embryonic and adult animal organs, called "Side Population" (SP), is characterized by active efflux of the fluorescent dye Hoechst 33342 (Ho). SP cells express specific ATP-binding cassette transporter proteins which actively transport Ho out of their cytoplasm. The SP cell subpopulation isolated from the heart display enhanced differentiation potential into cardiac phenotype in response to OT treatment. Recently, the phenotypic and functional heterogeneity of embryonic stem cells has been demonstrated, and this was correlated with the presence of cell subpopulations much like the SP cells from the heart and these cells can be identified by flow cytometry (FACS) as a population of unmarked cells by the Ho and which exhibit sensitivity to the inhibitor of the family of ATP-binding cassette ABC, verapamil. Thus, the SP from ESC could be a good candidate to induce cell differentiation more effectively to the cardiac phenotype. Since ANP can induce the release of cGMP and it has been shown that cardiac differentiation was mediated by the release of cGMP through the nitric oxide (NO), then we therefore formulate the hypothesis that ANP could also induce cardiac differentiation. Since ESC are composed of a mixture of different cell types so as we emit the hypothesis that the use of a subpopulation of more homogeneous ESC strengthen the differentiation potential of ANP.
Methods: SP were isolated from P19 cells by FACS using the method of exclusion of fluorescent dye Hoechst and their phenotype was characterized by immunofluorescence (IF) for markers of the undifferentiated state, self-renewal and pluripotency OCT4 and SSEA1. Then, the optimal pharmac
Hormis les mutations de GNAS, la pathogénie moléculaire des adénomes hypophysaires somatotropes est mal connue. Récemment, nous avons décrit, chez des patients acromégales présentant une réponse ...paradoxale de la GH (Growth Hormone) à la charge orale en glucose, un sous-groupe d’adénomes, sans mutation de GNAS, ayant une expression hypophysaire ectopique du récepteur du GIP (Glucose-dependent Insulinotropic Peptide). L’objectif de ce travail a été d’analyser le couplage fonctionnel du GIPR hypophysaire à la sécrétion de la GH.
Nous avons étudié, par transfection transitoire, l’impact de la surexpression du GIPR humain dans les lignées cellulaires somatotropes GH3 et GC. L’immunofluorescence nous a permis de vérifier la surexpression du GIPR; l’activation de la voie de l’AMPc ainsi que la sécrétion de GH ont été mesurées après stimulation des cellules par le GIP.
Nous avons montré que l’expression endogène du GIPR, dans ces deux modèles cellulaires, ne permet pas l’activation de la voie de l’AMPc aux concentrations physiologiques de GIP. En revanche, la surexpression du GIPR augmente la sensibilité des cellules au ligand. En effet, le GIP induit la production d’AMPc à des concentrations inférieures de deux logs décimaux dans les cellules transfectées par rapport aux cellules contrôles. De plus, à stimulation équivalente, elles secrètent davantage de GH (8,143 vs 4,555ng/L/10 000 cellules, p=0,0079).
Le GIPR, surexprimé dans des cellules somatotropes, est fonctionnellement couplé à la voie de l’AMPc et sa stimulation augmente la sécrétion de GH.
Les circuits et réseaux d’eau subissent épisodiquement des problèmes de contamination par des microorganismes tels que Legionella pneumophila, conduisant à la dégradation de la qualité ...microbiologique de l’eau circulante. De nouveaux moyens de traitements doivent être mis en place de façon notamment à limiter l’usage de biocides chimiques. Ce travail de thèse s’inscrit dans cette problématique et a pour objectif d’identifier de nouveaux composés actifs contre L. pneumophila en tenant compte de son comportement et de ses interactions au sein de son microenvironnement. De manière à obtenir des composés produits par des souches bactériennes appartenant à la même niche écologique que L. pneumophila, une campagne de prélèvement d’eau a été réalisée. Un total de 273 isolats environnementaux ont été isolés et testés contre L. pneumophila. Les résultats obtenus indiquent que 178 de ces isolats (65%) présentent une activité anti-Legionella. Quatre souches ont ensuite été sélectionnées (Aeromonas bestiarum SW257, Rahnella aquatilis SW265, Flavobacterium spp. PW52 et Pseudomonas spp PW329) et les composés actifs produits ont été caractérisés. A. bestiarum SW257 produit un peptide anti-Legionella. Flavobacterium sp. PW52 produit un mélange de composés anti-Legionella ayant des propriétés tensioactives, les flavolipides. Pseudomonas sp. PW329 produit des composés organiques volatiles, identifiés par SPME-GC-MS, actifs contre L. pneumophila. Enfin, R. aquatilis SW265 produit un sidérophore à activité anti-Legionella.
Water is essential to sustain life and water sources used for human consumption must be biologically safe, to avoid any risk for health. Indeed, the most common and widespread health risk associated with drinking water are infectious diseases caused by pathogenic microorganisms such as Legionella pneumophila. However, more efforts are needed to control disinfection by-products and minimize people exposure to potentially hazardous chemicals while maintaining adequate disinfection to ensure good water quality. Thus, this work aimed to find natural antibacterial compounds to control L. pneumophila growth using bacteria from freshwater environments. Environmental aquatic bacteria were sampled from five freshwater sources to get a large culturable bacterial collection. A total of 273 bacterial isolates were recovered and screened for their ability to produce anti-Legionella compounds. Among those, 178 (65%) were shown to be active against L. pneumophila. Four strains (Aeromonas bestiarum SW257, Rahnella aquatilis SW265, Flavobacterium spp. PW52, and Pseudomonas spp PW329) were next selected for the characterization of their active compounds. A. bestiarum SW257 produces an anti-Legionella peptide, and Flavobacterium spp PW52 produces a mixture of anti-Legionella compounds with surface active properties, named flavolipids. Finally Pseudomonas sp. PW329 delivers many volatile organic compounds, and R. aquatilis SW26 produces a anti-Legionella siderophore.
L'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) permet de maintenir l'homéostasie de l'organisme face à divers stress. Qu'ils soient de nature psychologique,
physique ou inflammatoire/infectieux, les ...stress provoquent la synthèse et la libération
de CRH par l'hypothalamus. Les cellules corticotropes hypophysaires perçoivent ce
signal et en réaction, produisent et sécrètent l'ACTH. Ceci induit la synthèse des
glucocorticoïdes (Gc) par le cortex surrénalien; ces stéroïdes mettent le système
métabolique en état d’alerte pour la réponse au stress et à l’agression. Les Gc ont le rôle
essentiel de contrôler les défenses de l'organisme, en plus d'exercer une rétro-inhibition
sur l'axe HPA.
L'ACTH est une petite hormone peptidique produite par le clivage d'un
précurseur: la pro-opiomélanocortine (POMC). À cause de sa position critique dans la
normalisation de l'homéostasie, le contrôle transcriptionnel du gène Pomc a fait l'objet
d'études approfondies au cours des dernières décennies. Nous savons maintenant que la
région promotrice du gène Pomc permet une expression ciblée dans les cellules POMC
hypophysaires. L'étude du locus Pomc par des technologies génomiques m'a permis de
découvrir un nouvel élément de régulation qui est conservé à travers l'évolution des
mammifères. La caractérisation de cet enhancer a démontré qu'il dirige une expression
restreinte à l'hypophyse, et plus particulièrement dans les cellules corticotropes. De
façon intéressante, l'activité de cet élément dépend d'un nouveau site de liaison recrutant
un homodimère du facteur de transcription Tpit, dont l'expression est également limitée
aux cellules POMC de l'hypophyse. La découverte de cet enhancer ajoute une toute
nouvelle dimension à la régulation de l'expression de POMC.
Les cytokines pro-inflammatoires IL6/LIF et les Gc sont connus pour leur
antagonisme sur la réaction inflammatoire et sur le promoteur Pomc via l'action des
facteurs de transcription Stat3 et GR respectivement. L'analyse génomique des sites liés
ii
par ces deux facteurs nous a révélé une interrelation complexe et a permis de définir un
code transcriptionnel entre ces voies de signalisation. En plus de leur action par
interaction directe avec l’ADN au niveau des séquences régulatrices, ces facteurs
interagissent directement entre eux avec des résultats transcriptionnels différents. Ainsi,
le recrutement de GR par contact protéine:protéine (tethering) sur Stat3 étant lié à
l'ADN provoque un antagonisme transcriptionnel. Inversement, le tethering de Stat3 sur
GR supporte une action synergique, tout comme leur co-recrutement à l'ADN sur des
sites contigus ou composites. Lors d'une activation soutenue, ce synergisme entre les
voies IL6/LIF et Gc induit une réponse innée de défense cellulaire. Ainsi lors d'un stress
majeur, ce mécanisme de défense est mis en branle dans toutes les cellules et tissus.
En somme, les travaux présentés dans cette thèse définissent les mécanismes
transcriptionnels engagés dans le combat de l'organisme contre les stress. Plus
particulièrement, ces mécanismes ont été décrits au niveau de la réponse globale des
corticotropes et du gène Pomc. Il est essentiel pour l'organisme d'induire adéquatement
ces mécanismes afin de faire face aux stress et d'éviter des dérèglements comme les
maladies inflammatoires et métaboliques.
The hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis regulates homeostasis in various
conditions of stress contributing to both the stress response and its termination.
Psychological, physical or inflammatory/infectious stresses all prompt the synthesis and
secretion of hypothalamic CRH. The pituitary corticotrope cells receive this signal and
in turn, secrete ACTH which triggers the synthesis of glucocorticoids (Gc) by the
adrenal cortex; these steroids induce a general state of alertness in order to fight or flight
aggressions and stresses. Glucocorticoids have the critical role to restrict the stress
response by exerting a negative feedback on the HPA axis.
ACTH is a small peptidic hormone produced after cleavage of a precursor
protein: pro-opiomelanocortin (POMC). Due to its critical role in homeostasis,
transcriptional control of the Pomc gene has been intensely studied during the last
decades. Previous investigations identified a promoter region that is sufficient for
expression of Pomc in the appropriate pituitary cells. Genome-wide studies of the Pomc
locus led me to discover a novel regulatory element that is conserved throughout
mammalian evolution. The activity of this enhancer is restricted to the pituitary, and
more precisely to the corticotrope lineage. Interestingly, its activity depends on a novel
transcription factor binding motif that binds homodimers of Tpit, a transcription factor
that is only found in pituitary POMC cells. The discovery of this enhancer adds a new
dimension in the control of pituitary Pomc expression.
The IL6/LIF pro-inflammatory cytokines and the glucocorticoids are well known
for their antagonism in control of the inflammatory response; at the Pomc promoter,
their action is mediated by the transcription factors Stat3 and GR, respectively. The
analysis of genomic sites bound by these two factors revealed a complex relationship
and led us to define a transcription regulatory code linking these signalling pathways. In
addition to their direct DNA interaction with cognate regulatory sequences, these factors
iv
interact with each other with different outcomes. Thus, the recruitment of GR on DNAbound
Stat3 through protein:protein contacts (tethering) results in transcriptional
antagonism. Conversely, Stat3 tethering to GR produces synergism; this is also the case
when the two factors are co-recruited to DNA on contiguous or composite binding sites.
Prolonged activation of the IL6/LIF and Gc pathways elicits a synergistic innate cell
defense response in all cells and tissues.
In summary, this doctoral work has defined transcriptional mechanisms that
mediate and control the stress response. In particular, pituitary components of the stress
response were defined at the level of the Pomc gene and as a global response of
corticotrope cells. This response is critical for appropriate organism defense during
stresses such as those produced in inflammatory and metabolic diseases.
Giriş ve amaç:Alzheimer hastalığı yaşlılarda en sık görülen nörodejeneratif bozukluktur. Klinik olarak ilerleyici, geri dönüşümsüz hafiza kaybı ve bilişsel bozukluklarla karakterizedir. Serbest ...oksijen radikalleri aracılı oksidatif makromolekül hasarı, Alzheimer hastalığında temel nörodejeneratif mekanizmalarda rol almaktadır. Bu tez çalışmasında Alzheimer hastalarında ve sağlıklı gönüllü kişilerde, oksidatif hasarın makromoleküler (DNA, lipid, protein, karbohidrat) düzeyde incelenmesi ve DNA hasarının onarımında rol oynayan bazı enzimlerin araştırılması amaçlandı. Bunun yanısıra radikal hasar ve Alzheimer hastalığı üzerine etkilerini araştırmak amacıyla, matriks metalloproteinazlar (MMP2, MMP9) ve metalloproteinazların spesifik doku inhibitörleri (TIMPI, TIMP2) düzeylerinin de incelenmesi amaçlandı.Gereç ve yöntem:Çalışma, 44 Alzheimer hastası ve 45 sağlıklı gönüllü bireylerden alınan periferal kan örneklerinde gerçekleştirildi. DNA baz hasan çalışmalan izotop dilüsyonlu GC-MS/MS tekniği ile gerçekleştirildi. DNA baz hasarı onarım enzimlerinden NEILİ ve OGGİ glikozilaz enzimlerinin mRNA ekspresyon düzeyleri RT-PCR tekniği ile belirlendi. Protein oksidasyonu belirteci 3-Nitrotirozin düzeyi ve MMP2, MMP9, TIMPI, TIMP2 düzeyleri ELİSA yöntemi ile ölçüldü. Lipid peroksidasyon ürünlerinden malondialdehit ve ileri glikasyon son ürünü olan N"-karboksimetillizin düzeyleri ise HPLC yöntemi ile incelendi.Bulgular:Alzheimer hastalan DNA örneklerinde incelenen DNA baz hasarı lezyonlarından, FapyAde /106DNA baz hasarı kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulundu (p-0,00). B-OHGua/106DNA bazı, FapyGua/106DNA bazı, 5-OH-5-MeHyd/106 DNA bazı ve 5-OHCyu106DNA bazı düzeylerinde ise anlamlı farklılık gözlenmedi. ThyGiy, 5-0H-Melira, 5-OH-Ura, 5,6-diOH-Ura hasarları ise hasta ve kontrol örneklerinde saptanmadı. DNA onarım enzimlerinden NEİLİ ekspresyonu Alzheimer hastalarında kontrol grubuna göre 0,21 kat artmış olarak bulundu. OGGI ekspresyonu ise hasta grubunda kontrol grubuna göre 0,02 kat azalmış olarak bulundu. Ancak her iki enzimdeki değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı değildi. Alzheimer hastalar ile kontrol grubu arasında nitrotirozin ve Nε-karboksimetillizin düzeyleri açısından anlamlı fark bulunmazken, Alzheimer hastalarına ait MDA düzeyleri kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulundu (p-0,000). o Alzheimer hastalarında MMP2, TIMPI düzeyleri kontrol grubuna göre istatistiksel anlamlılıkta düşük iken (sırasıyla p-0,000, 0,003) TIMP2 ve MMP9 düzeyleri açısından kontrol grubu ile arasında istatistiksel anlamlı bir farklılık bulunmadı.Sonuç:Bu çalışma Alzheimer hastalarında oksidatif makromolekül basarı belirteçlerinin ve DNA onanm enzim ekspresyonlarının ilk kez bu kadar geniş bir biçimde araştırılmış olması açısından önem taşımaktadır. Oksidatif maromolekül hasarı, Alzheimer hastalığının patogenezinde önemli rol oynamaktadır. Bu sürece hangi moleküllerin ne derece dahil olduğunun bilinmesi hastalığın etiyolojisinde ve tedavisinde uygulanacak metodların seçiminde önem taşımaktadır. Aynı zamanda matriks metalloproteinazların ve inhibitörlerin Alzheimer hastalığının patogenezinden sorumlu AB peptidlerin katabolizmasında rol aldıklannı destekleyici bulguların da elde edilmesinin literatüre katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
Chez les eucaryotes, les ARNm cellulaires subissent une traduction dépendante de la coiffe qui nécessite des facteurs appelés eIFs pour produire des protéines, mais les ARNm Hox sont traduits dans un ...mécanisme non canonique en raison de deux régulateurs d'ARN dans l'élément 5'UTR appelé Internal Ribosome Entry Site (IRES) qui recrute le ribosome sans le besoin de coiffe, et un élément inhibiteur de traduction (TIE) qui empêche la translation dépendant de coiffe. L'objectif de ma thèse est de déchiffrer le mécanisme de deux éléments TIE a3 et a11 dans les ARNm Hox. Pour cela, nous avons utilisé le système de traduction sans cellules RRL. Notre modèle pour TIE a3 suggère qu'il inhibe la traduction en uORF qui se traduit par un ARNm Hox a3 UTR 5'UTR de pleine longueur et produit un peptide de 9 KDa avec l'implication de eIF2D, un facteur d'initiation non canonique indépendant du GTP. Pour TIE a11, il séquestre le ribosome 80S sur une combinaison de codons start-stop à 19 nucléotides en amont d'une structure de boucle de tige riche en GC qui bloque le 80S au codon stop.
In eukaryotes, cellular mRNAs undergo cap-dependent translation which requires factors called eIFs to produce proteins.However, Hox mRNAs are translated in a non-canonical mechanism due to two RNA regulons in the 5’UTR called Internal Ribosome Entry Site (IRES) element which recruits the ribosome without the need of a cap, and a Translation Inhibitory Element (TIE) which inhibits cap-dependent translation. The objective of my PhD is to decipher the mechanism of two TIE elements a3 and a11 in Hox mRNAs. For that, we used RRL cell-free translation system. Our model for TIE a3 suggests that it inhibits translation to a uORF which translates through full length 5’UTR Hox a3 mRNA and produces a peptide of 9 KDa with the involvement of eIF2D, a non-canonical GTP-independent initiation factor. For TIE a11, it sequesters 80S ribosome on a start-stop codon combination at 19 nucleotides upstream of a GC-rich stem loop structure which blocks the 80S at the stop codon.
