Even though the endocrine-disrupting potential of perfluorooctanoic acid (PFOA) is well known, the mechanisms underlying its cellular and epigenetic toxicity at the critical stage of hypothalamic ...development are poorly understood. This is why we studied its effects on the embryonic mouse hypothalamic cell line N46 (mHypoE-N46) with a hope to shed more light on the mechanisms through which PFOA causes embryonic hypothalamic cell damage. To do that, we studied cell viability, global DNA methylation, and gene expression in cells exposed to PFOA. As the PFOA dose increased, cell viability decreased, while global DNA methylation increased. PFOA also significantly altered the expression of genes related to the apoptosis and cell cycle, neurotrophic genes, and the
,
, and
genes. Our findings suggest that exposure to PFOA affects cell survival through the reprogramming of embryonic hypothalamic DNA methylation patterns and altering cell homeostasis genes. DNA methylation and changes in the
gene expression induced by PFOA also imply wider ramifications, as they alter genes of other major mechanisms of the embryonic hypothalamus. Our study may therefore serve as a good starting point for further research into the mechanisms of PFOA effect of hypothalamic development.
Premda je perfluorooktanska kiselina (PFOA) dobro znana kao endokrini disruptor, i dalje se malo zna o mehanizmima u pozadini njezina djelovanja na stanice i njezine toksičnosti u kritičnoj fazi ...razvoja hipotalamusa. Stoga smo istražili njezino djelovanje u staničnoj liniji N46 hipotalamusa mišjeg embrija (mHypoE-N46) da bismo saznali o mehanizmima kroz koje ih PFOA oštećuje. S tom smo svrhom analizirali vijabilnost stanica, globalnu metilaciju DNA i gensku ekspresiju izloženih stanica. Porastom koncentracija PFOA padala je stanična vijabilnost, a globalna DNA metilacija rasla. Usto je PFOA značajno utjecala na ekspresiju gena povezanih s apoptozom i staničnim ciklusom, neurotrofnih gena te Tet, Dnmt i Mecp2 gena. Naše istraživanje ukazuje na to da izloženost PFOA utječe na preživljenje stanica hipotalamusa mišjeg embrija reprogramiranjem obrazaca metilacije DNA te promjenama u genima zaduženim za održavanje homeostaze. Metilacija DNA i promjene u ekspresiji Mecp2 gena izazvane djelovanjem PFOA također imaju široki spektar implikacija, budući da utječu na promjene u genima zaduženim za druge važne mehanizme u embrijskom hipotalamusu. Stoga naše istraživanje može poslužiti kao dobra polazna točka za daljnje istraživanje mehanizama djelovanja PFOA na razvoj hipotalamusa.
Inaktivacija X kromosoma složeni je epigenski postupak kojim se osigurava jednaka ekspresija većine X-vezanih gena kod oba spola. Xist (X kromosom specifični inaktivirajući transkript) je ključni gen ...povezan s razvojem koji potiče inaktivaciju X kromosoma kod ženki sisavaca tijekom embriogeneze. Metilacija DNA glavna je modifikacija kromatina uključena u transkripcijsku regresiju gena, regulaciju X kromosomske inaktivacije, genomskog utiska, specifičnu staničnu ili tkivnu gensku ekspresiju odnosno u mnoge druge procese tijekom embrionalnog razvoja. Prikladna DNA metilacija citozin-rezidua na CpG dinukleotidu, unutar metilacijske regije mnogih utišanih gena, prijeko je potrebna za normalni postimplantacijski razvoj embrija sisavaca. Nepravilan oblik DNA metilacije zbog nekompletnog ili poremećenog reprogramiranja u jezgi somatskih stanica razlog je manje uspješnosti njezinog prijenosa kod farmskih životinja. U ovom radu istražena je moguća druga metilacijska regija koja je utvrđena prvi put u koze (Capra hircus). Navedeno je omogućeno nakon istraživanja statusa DNA metilacije u toj regiji, primjenom analize bisulfit sekvenciranja, uz upotrebu fibroblasta i stanice kumulusa koze. Moguća nova metilirajuća regija sadrži 10 CpG mjesta s prosječnom razinom metilacije od 92% i 94% za fibroblaste odnosno stanica kumulusa. Filogenetske analize regije pokazale su da su koze i ovce smještene u jedan odvojeni “grozd”. Istraživanje će pomoći u budućem radu vezanom za molekularnu razinu koja je odgovorna za potpuno reprogramiranje jezgre somatskih stanica koza u SCNT.
Osnovni cilj ovog rada bio je utvrditi povezanosti globalne DNA metilacije i nepravilnog razdvajanja kromosoma 21 tijekom oogeneze i razvoja prirođenih srčanih grešaka (engl. congenital heart ...defects, CHD) u sklopu Down sindroma (DS). Dodatno, ispitivan je i utjecaj endogenih i egzogenih čimbenika na globalnu DNA metilaciju, kao što su MTHFR C677T polimorfizam, spol, starosna dob, indeks tjelesne mase, unos folata putem prehrane, perikoncepcijski unos pripravaka folata, uživanje duhanskog dima i alkohola te primjena lijekova.
Ispitanici i metode: U istraživanje je bilo uključeno 94 majki djece s DS-om majčinog podrijetla u kojih je točno određena mejotička dioba u kojoj je došlo do nerazdvajanja kromosoma 21. Kontrolnu grupu su činile majke zdrave djece i uredne obiteljske i osobne anamneze (N=100). Utjecaj globalne DNA metilacije na razvoj sindromskog CHD-a ispitivan je na uzorku od 42 osobe s DS-om koje su ujedno djeca majki uključenih u ovo istraživanje. Globalna DNA metilacija analizirana je u limfocitima periferne krvi, kvantifikacijom metilacije LINE-1 pomoću MethyLight metode. Genotipizacija MTHFR C677T polimorfizma izvedena je PCR-RFLP metodom.
Rezultati: Globalna DNA metilacija u majki djece s DS-om je statistički značajno niža nego u majki zdrave djece (P=0,000), ali se ne razlikuje ovisno o mejotičkoj diobi u kojoj je došlo do nerazdvajanja kromosoma 21 (P=1,000), kao ni u odnosu na prisustvo CHD-a u njihove djece (P=0,951). Vrijednost globalne DNA metilacije je statistički značajno povezana s kombinacijom MTHFR C677T genotip/prehrana (R2=4,5%; P=0,046). Najniže vrijednosti globalne DNA metilacije su imale majke CT+TT genotipa i prehrane siromašne folatima. Doprinos ovog čimbenika na varijabilnost globalne DNA metilacije još je veći u majki kod kojih se dogodilo nerazdvajanje kromosoma tijekom prve mejotičke diobe (R2=6,2%; P=0,036), a najveći udio utvrđen je u majki djece s DS-CHD+ (R2=9,9%; P=0,026), i to posebno u majki djece s DS-om i septalnim defektom (R2=15,4%; P=0,018). Globalna DNA metilacija u ispitanika s DS-om se statistički značajno ne razlikuje ovisno o prisutnosti CHD-a (P=1,000), ali ju statistički značajno opisuje spol osobe (R2=19,1%; P=0,025).
Zaključak: U našem istraživanju utvrđena je globalna DNA hipometilacija u majki djece s DS-om regularnog tipa majčinog podrijetla što ju opisuje kao mogućeg čimbenika rizika za nepravilno razdvajanje kromosoma 21 tijekom oogeneze. Iako nije utvrđena povezanost globalne DNA metilacije i CHD-a u sklopu DS-a, njen se utjecaj ne može potpuno isključiti jer na njene vrijednosti utječu MTHFR genotip i prehrana majke, čiji bi se učinak mogao ispoljiti na većem broju ispitanika.
The aim of this study was to determine the association between global DNA methylation and nondisjunction of chromosome 21 during oogenesis and occurence of congenital heart defects (CHD) in Down syndrome (DS). Additionally, the imact of endogenous and exogenous factors on global DNA methylation was analyzed, including MTHFR C677T polymorphism, gender, age, body mass index, intake of folate through diet, periconceptional folic acid supplementation, smoking, alcohol drinking and medication use.
Patients and methods: A total of 94 mothers of children with DS of maternal origin and with defined meiotic stage of chromosome nondisjunction have been enrolled in this study. The control group consisted of mothers of healthy children with no personal or family history (N=100). The influence of global DNA methylation on development of CHD was studied in 42 DS probands who were the children of mothers included in this study. Global DNA methylation was analyzed in peripheral blood lymphocytes by quantification of LINE-1 methylation using MethyLight method. Genotyping of MTHFR C677T polymorphism was performed by PCR-RFLP.
Results: Global DNA methylation in mothers of children with DS was significantly lower than in mothers of healthy children (P=0.000), but no significant differences were found regarding the meiotic stage of nondisjunction of chromosome 21 (P=1.000) or regarding the presence of CHD in their children (P=0.951). Combination of MTHFR C677T genotype/diet significantly influenced global DNA methylation (R2=4.5%, P=0.046). The lowest values of global DNA methylation were determined in mothers with CT+TT genotype and low folate diet. The contribution of these factors was even higher among mothers of children with trisomy 21 resulted from meiotic one nondisjunction (R2=6.2%, P=0.036). The highest effect was found in mothers of children with DS-CHD+ (R2=9.9%, P=0.026), particularly among those who had children with DS and septal heart defect (R2=15.4%, P=0.018). In DS probands, no significant differences in global DNA methylation were found according to the presence of CHD (P=1.000), but values of global DNA methylation were significantly influenced by gender (R2=19.1%; P=0.025).
Conclusion: Our findings revealed global DNA hypomethylation in mothers of children with DS, suggesting that this is a possible risk factor for nondisjunction of chromosomes 21 during oogenesis 21. Although, global DNA methylation was not significantly associated with development of CHD in DS, its influence can not be completely excluded, since the significant impact of MTHFR genotype and diet on global DNA methylation in mothers of DS-CHD+ was determined. Further analyses on larger sample are needed to provide an answer to this question.
Osnovni cilj ovog rada bio je utvrditi povezanosti globalne DNA metilacije i nepravilnog razdvajanja kromosoma 21 tijekom oogeneze i razvoja prirođenih srčanih grešaka (engl. congenital heart defects, CHD) u sklopu Down sindroma (DS). Dodatno, ispitivan je i utjecaj endogenih i egzogenih čimbenika na globalnu DNA metilaciju, kao što su MTHFR C677T polimorfizam, spol, starosna dob, indeks tjelesne mase, unos folata putem prehrane, perikoncepcijski unos pripravaka folata, uživanje duhanskog dima i alkohola te primjena lijekova.
Ispitanici i metode: U istraživanje je bilo uključeno 94 majki djece s DS-om majčinog podrijetla u kojih je točno određena mejotička dioba u kojoj je došlo do nerazdvajanja kromosoma 21. Kontrolnu grupu su činile majke zdrave djece i uredne obiteljske i osobne anamneze (N=100). Utjecaj globalne DNA metilacije na razvoj sindromskog CHD-a ispitivan je na uzorku od 42 osobe s DS-om koje su ujedno djeca majki uključenih u ovo istraživanje. Globalna DNA metilacija analizirana je u limfocitima periferne krvi, kvantifikacijom metilacije LINE-1 pomoću MethyLight metode. Genotipizacija MTHFR C677T polimorfizma izvedena je PCR-RFLP metodom.
Rezultati: Globalna DNA metilacija u majki djece s DS-om je statistički značajno niža nego u majki zdrave djece (P=0,000), ali se ne razlikuje ovisno o mejotičkoj diobi u kojoj je došlo do nerazdvajanja kromosoma 21 (P=1,000), kao ni u odnosu na prisustvo CHD-a u njihove djece (P=0,951). Vrijednost globalne DNA metilacije je statistički značajno povezana s kombinacijom MTHFR C677T genotip/prehrana (R2=4,5%; P=0,046). Najniže vrijednosti globalne DNA metilacije su imale majke CT+TT genotipa i prehrane siromašne folatima. Doprinos ovog čimbenika na varijabilnost globalne DNA metilacije još je veći u majki kod kojih se dogodilo nerazdvajanje kromosoma tijekom prve mejotičke diobe (R2=6,2%; P=0,036), a najveći udio utvrđen je u majki djece s DS-CHD+ (R2=9,9%; P=0,026), i to posebno u majki djece s DS-om i septalnim defektom (R2=15,4%; P=0,018). Globalna DNA metilacija u ispitanika s DS-om se statistički značajno ne razlikuje ovisno o prisutnosti CHD-a (P=1,000), ali ju statistički značajno opisuje spol osobe (R2=19,1%; P=0,025).
Zaključak: U našem istraživanju utvrđena je globalna DNA hipometilacija u majki djece s DS-om regularnog tipa majčinog podrijetla što ju opisuje kao mogućeg čimbenika rizika za nepravilno razdvajanje kromosoma 21 tijekom oogeneze. Iako nije utvrđena povezanost globalne DNA metilacije i CHD-a u sklopu DS-a, njen se utjecaj ne može potpuno isključiti jer na njene vrijednosti utječu MTHFR genotip i prehrana majke, čiji bi se učinak mogao ispoljiti na većem broju ispitanika.
PDF
