L'objectif principal de ma thèse était de développer de nouvelles technologies et des outils pour l’étude de l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR).À la surface de la cellule se ...trouve une multitude de récepteurs qui jouent un rôle critique dans la communication cellule-cellule, dont les GPCR, une famille de récepteur utilisant les protéines G intracellulaires pour transmettre leurs signaux. Le ciblage de ces récepteurs à des fins thérapeutique est innovant et très prometteur. Mais à ce jour seuls quelques médicaments ciblant les GPCR ont été mis sur le marché, en partie en raison d'un manque d'outils permettant le suivi de leur action sur les cellules natives.L’objectif de cette thèse est donc de développer des tests simples pour suivre l’activation de n’importe quel GPCR. Pour développer ce type de test, nous avons décidé d'utiliser des fragments d'anticorps appelés nanobodies. Les anticorps sont des protéines du sang produites en réponse à un antigène spécifique qui sont capable de le neutraliser. Les nanobodies correspondent au domaine variable de certains anticorps de camélidés. En raison de leur faible taille (13 kDa) et de leur site de liaison à l'antigène réduit, les nanobodies se lient souvent à des cavités et présentent une grande sensibilité aux changements de conformation de l'antigène.
The main objective of my thesis was to develop technologies and tools to study activation of G protein-coupled receptors (GPCRs).The cell surface is displaying a multitude of receptors, who play critical roles in cell-cell communication. Among them, GPCRs represent a large family relying on the use of intracellular G proteins for their signaling. Targeting these receptors for therapies is very promising and innovative. So far, only few new drugs have been put on the market, partly due to a lack of tools enabling the follow-up of their action on native cells.The aim of this thesis is thus to develop simple assays to study activation of any GPCRs. To develop this kind of test, we used antibody fragments called nanobodies. Antibodies are blood protein produced in response to and counteracting a specific antigen. Nanobodies correspond to antibody fragments derived from the variable domain of a special class of camelid antibodies. Because of their small size (13 kDa) and reduced antigen binding site, nanobodies often bind cavities and show a high sensitivity to antigen conformational changes.
Les acteurs neuroendocriniens régulant la physiologie des Lophotrochozoaires, groupe frère des Ecdysozoaires parmi les Protostomiens, demeurent peu connus. Grâce à l’émergence récente de ressources ...génomiques, transcriptomiques et peptidomiques chez l’huître creuse Crassostrea gigas, l’étude des couples ligand(s)/récepteur(s) régulant les fonctions physiologiques est désormais facilitée. Ainsi, par une approche d’endocrinologie inverse consistant à éprouver l’activité d’un panel de ligands potentiels, plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs), jusqu’alors orphelins ont pu être caractérisés sur le plan fonctionnel. Trois voies de signalisation ont été étudiées : la voie de type cholécystokinine/sulfakinine (CCK/SK) la voie de type calcitonine (CT) et la voie de type dopamine (DA). Grâce à des tests fonctionnels, deux neuropeptides et deux récepteurs de type CCK/SK ont pu être caractérisés. Des tests d’activité biologique in vitro et des expériences de conditionnement alimentaire ont montré la potentielle implication de ces couples dans la régulation de la digestion et de la satiété chez l’huître. Par ailleurs, deux couples neuropeptide/récepteur de type CT ont été caractérisés montrant, à l’image de leurs homologues chez les vertébrés, leur possible rôle dans la régulation hydrique ou ionique. D’autre part, un récepteur activé de manière spécifique par la dopamine et la tyramine a été caractérisé. Ce système de signalisation semble être impliqué dans la médiation du stress et intervenir dans les processus régulateurs de la reproduction au niveau de la gonade. Ainsi, les différents résultats obtenus au cours de ces travaux ont permis d’identifier des couples ligands/récepteurs d’huître homologues de systèmes de signalisation présents chez les Ecdysozoaires et les vertébrés confirmant l’origine de ces systèmes neuroendocriniens depuis l’ancêtre commun des Bilatériens. Les résultats obtenus ont également permis de mieux comprendre comment l’huître intègre les paramètres du milieu et donc s’acclimate aux différentes contraintes environnementales.
The neuroendocrine regulators of the physiology of Lophotrochozoa, the sister clade of Ecdysozoa among Protostoma, remain poorly understood. Thanks to the recent emergence of genomic, transcriptomic and peptidomic resources in the Pacific oyster Crassostrea gigas, the functional characterization of ligand/receptor pairs regulating a diversity of physiological functions has been facilitated. Using a reverse endocrinology approach, a number of orphan G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) have been functionally characterized. Three signalling systems have been studied in the oyster: The cholecystokinin/sulfakinin (CCK/SK), the calcitonin (CT) and the dopamine (DA) signalling systems. Two CCK/SK receptors and ligands have been characterized. In vitro bioassays and feeding conditions suggested the potential involvement of this signalling system in the regulation of digestion and satiety. Besides, two couples of CT-type peptides and receptors have been characterized showing, as for their vertebrate counterparts, their possible role in the regulation of water and ion balance. A receptor specifically activated by dopamine and by tyramine has also been characterized. This signalling system appeared to be implicated in the mediation of stress and to play a role in the regulatory processes of reproduction in the gonads. This study allowed the characterization in the oyster of ligand receptor pairs homolog to known signalling systems present in Ecdysozoa and vertebrates, thus confirming the origin of these neuroendocrine systems in the common ancestor of Bilateria. The results of this study also contributed to understand how the oyster integrates external parameters and adapts to various environmental constrains.
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont des protéines membranaires impliquées dans la communication entre cellules via des messagers circulants (hormones, neurotransmetteurs) ainsi que ...dans la perception de notre environnement (vision, odorat, goût). Ils sont essentiels à de nombreuses fonctions physiologiques vitales (cardiaques,respiratoires...) et comportementales (relations sociales et affectives) et sont donc une cible thérapeutique de choix pour la découverte de nouveaux médicaments.Au sein de l'équipe Canaux, de l’Institut de Biologie Structurale, un biocapteur original a été créé se basant sur la fusion de ces RCPG avec un canal ionique (Kir6.2) appelé Ion Channel-Coupled Receptor (ICCR). Les changements conformationnels du récepteur induit par son activité (fixation de ligand, activation des protéines G) sonttraduits par le canal ionique en courant électrique aisément détectable par des techniques électrophysiologiques. Cette nouvelle génération de biocapteurs permet d'étudier en temps réel l’activité des RCPG par des techniques électrophysiologiques très sensibles.Le travail de thèse s’est principalement focalisé sur l’étude du récepteur de l’ocytocine (OXTR) impliqué dans l’accouchement, l’allaitement et le lien social. La technologie ICCR a été utilisée pour trois des projets de cette thèse. Le premier avait pour but l’étude des mécanismes moléculaires de la dépendance au cholestérol du récepteur del’ocytocine, et a ainsi permis d’identifier un nouveau mécanisme de régulation allostérique entre le cholestérol et la fixation des ligands. Un second projet a porté sur l’utilisation de ce biocapteur pour identifier de nouveaux types de ligands, plus spécifiques de certaines voies intracellulaires, appelés ligands biaisés. Enfin, un troisième projet a mis en relief l’effet de certains composés environnementaux sur les RCPG et a permis de mettre en avant de nouveaux récepteurs ciblés par ce type de composés.Pour terminer, un projet parallèle s’est porté sur l'étude de la formation de pores par des protéines bactériennes dépendantes des RCPG. Il s’agit des « pore-forming toxins » (PFTs) de la famille des hémolysines gamma, produitespar un des pathogènes humains les plus virulents, Staphylococcus aureus. Certaines de ces toxines sont capables de sefixer sur des RCPG très spécifiques, les récepteurs aux chimiokines, et ont donc un rôle important dans les infections virales et dans certaines pathologies cancéreuses. Les travaux ont notamment permis d’obtenir des informations nouvelles sur le mécanisme d’insertion de ces pores dans la membrane.
G protein-coupled receptors (GPCRs) are membrane proteins involved in communication between cells via circulatingmessengers (hormones, neurotransmitters) as well as in the perception of the environment (vision, smell, taste). Theyare essential for many physiological functions (cardiac, respiratory...) and behavioral (social and emotional responses)and therefore represent interesting therapeutic targets.Within the Channels team, at the Institute of Structural Biology, an original biosensor was created, based onthe fusion of a GPCR to an ion channel (Kir6.2), called an Ion Channel-Coupled Receptor (ICCR). Conformationalchanges of the receptor induced by its activity (ligand binding, activation of G proteins) are directly transmitted to theion channel and allow the generation of an electrical signal easily detectable by electrophysiological techniques. Thesenew biosensors are powerful tools to study GPCR activity in real time.The main focus of the thesis was the study of the oxytocin receptor (OXTR), involved in childbirth,breastfeeding and social bonding. ICCR technology has been used for three projects during the thesis. The first aimedat studying the molecular mechanisms of cholesterol dependency of the oxytocin receptor and allowed theidentification of a new allosteric regulation mechanism between cholesterol and the ligand binding. A second projectfocused on the use of this biosensor to identify new types of ligands, selective to certain intracellular pathways, calledbiased ligands. Finally, a third project highlighted the effect of certain compounds, known as endocrine disruptors, onGPCRs. Endocrine disruptors are environmental pollutants which have potentially harmful effects on human health.Finally, a parallel project was dedicated to the study of pore formation by GPCR-dependent bacterial toxins.These proteins are called pore-forming toxins (PFTs), from the gamma hemolysin family and are produced by one ofthe most virulent human pathogens Staphylococcus aureus. Some of these toxins are able to bind very specifically tocertain GPCRs, members of the chemokine receptor family. They therefore play a vital role in numerous viralinfections and in some cancerous pathologies. New information concerning the mechanism of membrane insertion ofthese toxins during pore formation was discovered during this work.
Les cellules de Schwann (CS) sont les cellules gliales myélinisantes du Système Nerveux Périphérique (SNP). Il existe une communication étroite entre ces cellules et les axones auxquels elles ...s’associent et ce dès les stades les plus précoces de leur développement. Elles migrent tout en se divisant le long des axones; cette division migratoire est suivie d’une deuxième division post-migratoire dans le but d’établir un ratio 1:1 avec les axones pour ensuite les myéliniser. Ce travail vise à analyser, in vivo, le comportement des CS chez le poisson zèbre au cours de leurs divisions.Nous avons remarqué que les CS se divisent parallèlement aux axones le long du nerf de la Ligne Latérale Postérieure (PLL). En analysant les deux mutants has et nok, nous avons montré que les gènes de polarité apicale aPKC et pals1 ne sont pas requis pour la migration et la division des CS, ni pour leur capacité à myéliniser. Nous avons mis en évidence, en analysant le mutant cassiopeia qui présente des défauts d’organisation du fuseau mitotique et en utilisant l’agent pharmacologique le nocodazole, que l’assemblage du fuseau mitotique au cours de la division des CS est essentiel pour la myélinisation.En parallèle, nous avons analysé le rôle du gène rgs4 (regulator of G-protein Signaling 4) dans le développement du SNP chez le poisson zèbre. Nous avons généré un mutant stable rgs4 par la technique CRISPR/Cas9 et montré un rôle de ce gène dans le développement du ganglion de la PLL et des motoneurones, et ce en agissant en amont de la voie PI3K/Akt/mTOR.Contrairement à l’inhibition pharmacologique qui suggère un rôle de rgs4 dans la myélinisation périphérique, le mutant ne présente pas de défauts de myéline.
Schwann cells (SCs) are the myelinating glial cells of the Peripheral Nervous System (PNS). They derive from neural crest cells during development, then migrate and divide along the axons of the peripheral nerves. This migratory division is followed by a post-migratory division in order to radially sort the axons in a 1:1 ratio and wrap them with a myelin sheath. This work provides an analysis of the polarity of SC divisions, in vivo, in intact zebrafish embryos.We showed that SCs divide parallel to the axons along the Posterior Lateral Line nerve (PLL). By analyzing the two mutants has and nok, we revealed that the apical polarity genes aPKC and pals1, are neither required for the migration and division of SCs, nor for their capacity to myelinate. By studying the cassiopeia mutant that shows defects in mitotic spindle, we revealed that the assembly of the mitotic spindle is essential for SC myelination.We have also analysed the role of rgs4 (regulator of G-protein Signaling 4) in PNS development. We generated a stable rgs4 mutant using the CRISPR/Cas9 technology. We showed that rgs4 plays an essentiel role in PLLg and motoneurons development by acting upstream of PI3K/Akt/mTOR pathway. Pharmacological analysis suggested a role for rgs4 in peripheral myelination, however, the rgs4 mutant do not show any myelin defects.
PDF