Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de protéines membranaires, et ils sont la cible de plus de 25% des médicaments. Ces récepteurs activent diverses ...voies de signalisation cellulaire via plusieurs familles de protéines G hétéro-trimériques (Gs, Gq, Gi/o et G12/13). Etant donné qu’un RCPG peut activer différentes protéines G, il est important de comprendre comment des ligands favorisent l’activation de certaines protéines G au détriment des autres (ligands biaisés). L’objectif de mon travail a été de développer de nouveaux tests pour l’étude des protéines G qui soient spécifiques d’une famille voire même de certains sous-types de protéines.
G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the main family of membrane proteins, and they are the target of more than 25% of drugs in the market. These receptors activate various signaling pathways through different families of heterotrimeric G proteins (Gs, Gq, Gi/o et G12/13). Since a given GPCR can activate several G proteins, it is important to understand how ligands favor the activation of some of these G proteins (biased ligands). The objective of my thesis was to develop assays to study most G protein subtypes.
Résumé Le récepteur de la TSH est un élément central de l’homéostasie thyroïdienne et de nombreuses mutations gain ou perte de fonction ont été décrites depuis son clonage en 1989. Au-delà des ...tableaux caricaturaux que représentent les hyperthyroïdies non auto-immunes familiales ou sporadiques, les nodules toxiques ou à l’inverse les syndromes de résistance complète à la TSH, de nouvelles approches méthodologiques ont permis récemment une caractérisation fonctionnelle plus fine de situations cliniques moins marquées: l’analyse en régression linéaire (LRA) des mutations activatrices différencie mutations faiblement activatrices et polymorphismes du récepteur non fonctionnels ; la démonstration d’une oligomérisation précoce du récepteur muté et natif dans les compartiments intracellulaires a explicité la transmission dominante de formes modérées de résistance à la TSH. De nombreux champs de la signalisation du récepteur de la TSH, dont son activité persistante après internalisation, restent cependant à explorer et leurs implications cliniques à déterminer. Enfin, de nouveaux modulateurs du récepteur sont en cours de développement avec des perspectives thérapeutiques séduisantes.
La mélatonine est une neurohormone produite principalement par la glande pinéale de manière circadienne et agissant par l’activation de deux récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) appelés MT1 et ...MT2. La mélatonine régule de nombreuses fonctions physiologiques importantes. La régulation des niveaux de dopamine (DA) et de glucose en font partie mais nous ne savons pas clairement comment la mélatonine les régule.Les niveaux de DA extracellulaire sont principalement régulés par son transporteur (DAT) responsable de sa recapture dans les neurones présynaptiques afin de prévenir d’une hyperactivation des récepteurs dopaminergiques. Par conséquent, nous avons vérifié le rôle de DAT dans la régulation du système dopaminergique par le système mélatoninergique. Nous avons montré qu’en interagissant avec la forme immature non-glycosylée de DAT, MT1 et MT2 le retiennent dans le réticulum endoplasmique régulant ainsi son expression à la surface cellulaire et donc la recapture de la DA. De la même manière, les souris déficientes en MT1 ou MT2 ont montré une augmentation de la recapture de la DA dans les synaptosomes de striatum et une baisse de l’hypermotilité induite par l’amphétamine. Dans ce projet nous avons ainsi révélé un nouveau lien entre les systèmes mélatoninergiques et dopaminergiques basé sur la formation de complexes moléculaires entre les récepteurs de la mélatonine et DAT.Afin de mieux comprendre le rôle de la mélatonine dans la régulation des niveaux de glucose, nous avons ensuite étudié l’implication de variants génétiques de MT2 dans le développement du diabète de type 2 (DT2). Des études antérieures avaient montré que des variants naturels défectueux fonctionnellement étaient associés à un risque de développer le DT2. Afin de déterminer plus précisément les propriétés défectueuses en lien avec le DT2, nous avons mesuré l’activation spontanée et celle induite par la mélatonine de 40 variants MT2. Nous avons ainsi montré que des défauts d’activation des protéines Gαi et Gαz induite par la mélatonine et de recrutement spontané de la βarrestine-2 sont significativement reliés à un risque de développer le DT2. Les résultats expérimentaux corrélaient avec les prédictions de l’analyse sur le score d’évolution. Ce travail permettra de nouvelles avancées dans la recherche de traitements personnalisés pour les personnes portants les mutations sur MT2 afin qu’il retrouve une réponse non défectueuse.Le séquençage de 9393 personnes a permis l’identification de 32 variants naturels MT1. Le récepteur MT1 sauvage et les variants ont ainsi été caractérisés grâce aux techniques de transfert d’énergie par résonnance de bioluminescence (BRET). Nous avons montré que MT1 active les protéines Gαi/o, Gα12 et Gα15 et recrute la βarrestine-2. L’analyse des résultats par factorisation matricielle non linéaire a révélé l’existence de 5 clusters caractérisés par différents profils de signalisation. La modélisation 3D par homologie de MT1 a permis de déterminer l’impact de chaque variant sur l’activation du récepteur et ses interactions avec les protéines G et la βarrestine-2. Ce projet a ainsi permis de démontrer que des variants naturels sont très intéressant afin de comprendre les mécanismes d’action des RCPGs. En résumé, ce travail contribue à la compréhension des fonctions des récepteurs à la mélatonine et souligne leur importance dans la régulation du système dopaminergique et de l’homéostasie glucidique. Nos résultats offrent de nouvelles perspectives dans la recherche de nouveaux traitements personnalisés pour les patients souffrant d’un dérèglement du système dopaminergique ou de DT2.
Melatonin is a neurohormone mainly released from the pineal gland in a circadian manner acting through two G protein-coupled receptors (GPCRs) called MT1 and MT2. Melatonin regulates many important physiological functions. Regulation of dopamine (DA) and glucose levels are two of them but how they do this is not clear.Extracellular DA levels are mainly regulated by its transporter (DAT) which mediates DA re-uptake into presynaptic nerve termini to prevent DA receptor hyperactivation in the presynaptic cleft. Consequently, we verified the role of DAT in the regulation of the DA system by melatonin. We showed that MT1 and MT2, by interacting with the immature non-glycosylated form of DAT retain DAT in the endoplasmic reticulum thus regulating DAT cell surface expression and DA reuptake. Consistently, mice with targeted deletion of MT1 and MT2 show markedly enhanced DA uptake in striatal synaptosomes and decreased amphetamine-induced locomotor activity. Collectively, we revealed here a molecular link between the melatonin and DA systems, which is based on the formation of a molecular complex between melatonin receptors and DAT.To better understand the role of melatonin on the regulation of glucose levels, we studied the involvement of genetic variants of MT2 in the development of type 2 diabetes (T2D). Previous studies showed that natural loss-of-function variants of MT2 associate with T2D risk. To determine more precisely the defective properties linked to T2D risk we monitored spontaneous and melatonin-induced activation of different signaling pathways by 40 MT2 variants. We show that defects in melatonin-induced Gαi and Gαz activation and spontaneous βarrestin-2 recruitment are most significantly associated to T2D risk. Experimental results correlated well with those predicted by evolutionary lineage analysis. This work will help to propose personalized treatments for MT2 variant carriers to recover their defective responses.Sequencing of 9393 individuals resulted in the identification of 32 natural MT1 variants. MT1 wild-type and variants were functionally characterized in bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assays. We showed that MT1 activates Gαi/o, Gα12 and Gα15 proteins and recruits βarrestin-2. Analyzes of results by non-linear matrix factorization revealed the existence of 5 clusters characterized by different signaling profiles. Computational homology modeling of the 3D model of MT1 helped to determine the impact of each variant on receptor activation and interaction with G proteins and βarrestin-2. Collectively, our data illustrate that natural variants are powerful tools to understand the molecular basis of GPCR function. Overall, this work contributes to our understanding of the function of melatonin receptors and highlights their importance in the regulation of the DA system and glucose homeostasis. Our results will open new, personalized therapeutic options for patient suffering from a defective DA system or T2D.
L’autophagie est un processus catabolique par lequel certaines protéines cytosoliquessont dirigées vers le compartiment lysosomial, afin d’y être dégradées. Ce processus débutepar la séquestration de ...constituants cytoplasmiques par une structure multimembranaireappelée phagophore. La fermeture du phagophore donne naissance à une vésicule à doublemembrane nommée autophagosome, qui fusionne avec les lysosomes, ce qui conduit à ladégradation du contenu de sa lumière. Ainsi, la modulation de l’autophagie permet unremodelage dynamique du protéome cellulaire. Bien que des données récentes ont permis dedémontrer la dégradation autophagique de protéines impliquées dans la migration cellulaire,telles que des intégrines, ou encore les protéines RhoA et Src, l'impact fonctionnel del'autophagie sur la migration cellulaire demeure sujet à controverse. Alors que l'autophagie estdécrite comme un processus pro-migratoire et pro-invasif dans certaines études, d'autrestravaux indiquent que l'inactivation des protéines pro-autophagiques stimule l'invasion descellules cancéreuses. De plus, l'effet fonctionnel des RCPG chimiotactiques sur l’activitéautophagique reste totalement inexploré. Sur la base de ces données, les objectifs de mon travail de thèse ont été i) d’évaluer les effets des RCPG chimiotactiques, le CXCR4 et l’UT,sur le processus autophagique et ii) d’étudier l’impact de cette modulation sur la migrationcellulaire. Pour ce faire, nous avons utilisé des cellules HEK-293, transfectées à l’aide deconstruits permettant l’expression des RCPG CXCR4 et UT, ainsi que la lignée deglioblastome humain U87, exprimant ces deux récepteurs de manière endogène.Nous avons dans un premier temps évalué l’activité autophagique à l’aide de laprotéine de fusion EGFP-LC3, marqueur des autophagosomes. Nous avons ainsi démontréque l’activation du CXCR4 et de l’UT provoque une diminution significative de la biogénèsedes autophagosomes. Une étape essentielle de cette biogenèse est le recrutement des protéinesAtg16L1 et Atg5 à la membrane plasmique, conduisant à la formation d'endosomes Atg16L1-Atg5-positifs, appelés « endosomes pré-autophagiques ». Cette population d’endosomesconstitue une source importante de phospholipides nécessaire à l’expansion du phagophore etla formation d’un autophagosome mature. Afin d’évaluer l’impact des RCPG chimiotactiquessur le recrutement de la protéine Atg16L1 à la membrane plasmique, nous avons bloqué leprocessus d’endocytose par l’utilisation d’un inhibiteur de la dynamine, le Dynasore. Cettemolécule provoque une accumulation marquée de la protéine Atg16L1 dans les endosomespré-autophagiques en formation, retenus à la membrane plasmique.
Autophagy is a catabolic process by which certain cytosolic proteins are directed to thelysosomal compartment to be degraded. This process begins with the sequestration ofcytoplasmic components, by a multimembrane structure called the phagophore. The closure ofthe phagophore gives rise to a double membrane vesicle called autophagosome, which thenmerges with lysosomes in order to degrade its luminal content. Autophagy modulation allowsa dynamic remodeling of the cellular proteome. Although recent evidence has demonstratedautophagic degradation of key proteins involved in cell migration, such as integrins, RhoAand the Src kinase, the functional impact of autophagy on cell migration remainscontroversial. While autophagy is described as a pro-migratory and pro-invasive process insome studies, others indicate that the inactivation of pro-autophagic proteins stimulates thecancer cell invasion. In addition, the functional effect of chemotactic GPCR on autophagicactivity remains unexplored. On the basis of these data, the objectives of my thesis were i) toevaluate the effects of the chemotactic GPCRs for SDF-1 (CXCR4) and for the vasoactivepeptide urotensin II (UT), on the autophagic process and ii) to study the impact of thismodulation on cell migration. In order to do this, we used HEK-293 cells, transfected with constructs allowing the expression of CXCR4 and UT, as well as the human glioblastomaline, U87, which endogenously expresses these two receptors. Previous studies have demonstrated a direct interaction of Atg5 with membranes,suggesting that recruitment of Atg16L1 to the plasma membrane may depend on Atg5. This prompted us to evaluate the formation of Atg16L1-positive pre-autophagic endosomes,following depletion of Atg5 levels. Several interfering RNAs, targeting the transcriptencoding Atg5, have been tested and, as expected, these interfering RNAs completely blockedthe recruitment of Atg16L1 to forming pre-autophagic endosomes. We then tested the effectsof chemotactic GPCRs on the subcellular localization of the Atg5 protein. By confocalmicroscopy, we found that a significant fraction of Atg5 localized to the plasma membraneunder basal conditions. The activation of CXCR4 or UT is accompanied by a marked decreaseof the Atg5 pool localized at the plasma membrane. Furthermore, we have demonstrated thatthe anti-autophagic effects of chemotactic GPCRs are completely abrogated byoverexpression of a recombinant Atg5 protein, suggesting that chemotactic GPCRs exert theiranti-autophagic effects by reducing the membrane pool of Atg5, necessary for the productionof pre-autophagic endosomes, and the expansion of the phagophore.
La symbiose mycorhizienne à arbuscules (MA) est une association bénéfique établie entre les membres d'un ancien sous-phylum de champignons, les Gloméromycètes, et les racines de la majorité des ...plantes terrestres. Les champignons MA procurent de l'eau et des minéraux (azote et phosphore principalement) à leur plante hôte et obtiennent de cette dernière des molécules carbonées sous forme d'hexoses et de lipides. Des études récentes ont montré que certaines protéines sécrétées par les champignons MA peuvent être des régulateurs importants de l'association (Kloppholz et al., 2011 ; Tsuzuki et al., 2016). Notre objectif était d'identifier de nouvelles protéines fongiques contribuant à la mise en place de la symbiose. Des protéines prédites pour être préférentiellement sécrétées par le champignon MA Rhizophagus irregularis dans les racines ont été identifiées au début de ma thèse (Kamel et al., 2017). Certaines d'entre-elles présentaient une structure ressemblant aux précurseurs de phéromones sexuelles d'Ascomycètes. Ces protéines sont connues pour être maturées dans les voies de sécrétion en petits peptides qui sont ensuite sécrétés. Leur reconnaissance par un récepteur couplé à la protéine G (GPCR) aboutit à la fusion cellulaire de deux types sexuels opposés. Dans le cas de R. irregularis, seule la reproduction clonale a été décrite, mais des données génomiques récentes remettent en question son statut d'organisme asexué (Ropars et al., 2016). Une grande partie de ma thèse a été dédiée à la caractérisation fonctionnelle de ce type de peptides chez R. irregularis. Nous avons montré que deux peptides étaient effectivement produits et sécrétés par R. irregularis. L'utilisation de peptides synthétiques nous a permis de mettre en évidence que l'un d'eux stimulait la colonisation de M. truncatula mais était également perçu par le champignon lui-même, induisant la transcription de son propre gène précurseur et d'un GPCR. Ce peptide stimulateur de la symbiose est composé de seulement trois acides aminés et il peut être produit à partir de trois précurseurs protéiques. Par des approches de génétique inverse (HIGS et VIGS), nous avons confirmé l'importance de ces précurseurs dans l'établissement de la symbiose....
Arbuscular Mycorrhizal (AM) symbiosis is a beneficial association established between members of an ancient subphylum of fungi, the Glomeromycotina, and the roots of the majority of terrestrial plants. AM fungi provide water and minerals (mainly nitrogen and phosphorus) to their host plant in exchange for organic carbon in the form of hexoses and lipids. Recent studies have shown that certain proteins secreted by AM fungi are important symbiosis regulators (Kloppholz et al., 2011, Tsuzuki et al., 2016). Our aim was to identify new fungal proteins involved in the establishment of symbiosis. Proteins predicted to be preferentially secreted by the AM fungus Rhizophagus irregularis in the roots were identified at the beginning of my thesis (Kamel et al., 2017). We noticed that some of them had a structure resembling the sex pheromone precursors of Ascomycota. These proteins are known to be processed in the secretory pathway into small peptides which are then secreted. Their recognition by a G protein-coupled receptor (GPCR) leads to cell fusion of two opposite sex types. In the case of R. irregularis, only clonal reproduction has been described. However, recent genomic data question its status as an asexual organism (Ropars et al., 2016). A large part of my thesis was dedicated to the functional characterization of this type of processed peptides in R. irregularis. We show that two of them are actually produced and secreted by R. irregularis. Treatments with synthetic forms of these peptides revealed that one of them stimulated the colonization of M. truncatula but was also perceived by the fungus itself, inducing the transcription of its own precursor gene and of a GPCR gene. This symbiosis-stimulating peptide is composed of only three amino acids and can be produced from three different protein precursors. Using reverse genetics (HIGS and VIGS), we confirmed the importance of these precursors in the symbiosis establishment. ...
PDF
