Povezanost između unutarstanične hiperglikemije, promjene u oksidacijskoredukcijskoj homeostazi, pojavnost oksidativnog stresa, smanjenje antioksidativne obrane i povećano stvaranje vaskularnoga ...endotelnog faktora rasta (VEGF), ključni su događaji u patogenezi proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR). Ciljevi istraživanja: 1. Utvrditi koncentracije: VEGF-a, markera oksidativnog stresa i antioksidativnog sustava u staklastom tijelu i serumu. 2. Utvrditi korelaciju tih parametara u staklastom tijelu i serumu. 3. Temeljem rezultata korelativnog odnosa mjerenih pokusnih parametara, predvidjeti mogućnost dijagnostike retinopatičnih promjena mjerenjima serumskih vrijednosti. Metode istraživanja: ispitivane varijable mjerene su u uzorcima staklastog tijela i seruma bolesnika i eksperimentalnih životinja s izraženom proliferativnom dijabetičkom retinopatijom te u istim uzorcima bolesnika i eksperimentalnih životinja bez pojavnosti oksidativnog stresa, kao kontrola. Svi parametri analizirani su standardiziranim laboratorijskim metodama, a dobivene vrijednosti statistički obrađene. Korelacije podataka između promatranih skupina prikazane su Spearmanovim koeficijentima korelacije. Rezultati su pokazali povišene markere oksidativnog stresa u oku i u sistemskoj cirkulaciji, smanjen antioksidativni kapacitet u staklastom tijelu, te povišene vrijednosti u serumu kod dijabetičara s PDR-om. Zaključak: U dijabetičara, praćenjem serumskih parametara (lipidne peroksidacije, superoksid dismutaze i VEGF-a), moguće je indirektno procjenjivati oksidativni status unutar oka, a time i nastanak/napredovanje dijabetičke retinopatije i prije nego što promjene u oku postanu klinički očite.
The relationship between intracellular hyperglycemia, changes in oxidative - reductive homeostasis, the onset of oxidative stress, reduction of antioxidant defense and increased production of VEGF are considered to be key events in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Research goals: 1. To determine concentrations of: vascular endothelial growth factor, markers of oxidative stress and antioxidant system in the vitreous humor and serum. 2. To determine the correlation between these parameters in the vitreous and serum. 3. Based on the results of the correlation of the measured experimental parameters, predict the ability to diagnose retinopathy changes based on serum values. Research Methods: The examined variables were measured in samples of vitreous and serum of patients and experimental animals with pronounced proliferative diabetic retinopathy and of control group of patients and experimental animals without incidence of oxidative stress. All parameters were analyzed by standardized laboratory methods and the obtained values were statistically evaluated. Data correlations between observed groups were presented by the Spearman correlation coefficient. Results: The results showed elevated markers of oxidative stress in the eye and systemic circulation, reduced antioxidant capacity in the vitreous humor and increased antioxidant capacity in diabetic patients with PDR. Conclusion: In diabetic patients, monitoring of serum parameters (Lipid Peroxidation, Superoxide Dismutase and VEGF), can be used to indirectly evaluate the oxidative status inside the eye, and thus the formation/progression of diabetic retinopathy before clinical manifestation of changes in the eye.
U ovoj disertaciji istraživana je višestruka različitost u toksičnim učincima i načinu istraživanja toksičnih učinaka tri učestalo korištena insekticida, organofosfata dimetoata i pirimifos-metila i ...piretroida deltametrina, na različite ekološke kategorije gujavica primjenom dva standardizirana testa toksičnosti (kontaktni filter papir test i test s umjetnim tlom) i mikrokozmičkog sustava. Rezultati su pokazali da postoji mjerljiva razlika u odgovoru biljega gujavica između pokusa koji se provode u pretežno determinističkim uvjetima (standardizirani testovi toksičnosti) i pokusa koji se provode u pretežno stohastičkim uvjetima (mikrokozmički sustavi). Iz rezultata dobivenih primjenom okolišno relevantnih koncentracija istraživanih pesticida, može se zaključiti da primjena istraživanih organofosfata u poljoprivredi ima mjerljiv toksikološki učinak na jedinke gujavica, dok primjena deltametrina u poljoprivredi najvjerojatnije neće imati utjecaj na odgovor biokemijskih biljega gujavica u okolišu. Rezultati mjerenja su pokazali da toksičnom djelovanju pesticida na gujavice može znatno doprinijeti pojava oksidativnog stresa i promjene u aktivnosti transmembranskih crpki za izbacivanje ksenobiotika. Dobiveni podatci o oporavku biljega su pokazali da je vrijeme oporavka istraživanih biokemijskih biljega bilo relativno sporo, pa je stoga nužno pri dizajniranju monitoringa zagađenja okoliša pomoću biokemijskih biljega uzeti u obzir to vrijeme. Usporedba osjetljivosti vrsta pokazala je da se vrsta-specifična ovisnost istraživanih vrsta gujavica nakon izlaganja istraživanim organofosfatima razlikuje ovisno o primijenjenom sustavu testiranja toksičnosti, odnosno osjetljivost vrsta bila je različita u standardiziranim testovima toksičnosti u usporedbi s mikrokozmičkim sustavom. Te su razlike ukazale na potrebu razlikovanja dva tipa osjetljivosti, fiziološku i okolišnu osjetljivost vrste, koje obje treba uzimati u obzir pri interpretaciji rezultata toksikoloških i ekotoksikoloških testova.
In the present thesis, the multiple differences in toxic effects and research methods of toxic effects of three commonly used insecticides, organophosphates dimethoate and pirimiphos-methyl and pyrethroid deltamethrin, on different ecological categories of earthworms by using two standardized toxicity tests (filter paper contact test and artificial soil test) and microcosmic system were investigated. The results showed measurable difference in responses between earthworm biomarkers obtained in experiments conducted mainly in deterministic conditions (standardized toxicity tests) and experiments conducted mainly in stochastic conditions (microcosmic systems). From the results obtained after applying environmentally relevant concentrations of investigated pesticides, it can be concluded that the application of the investigated organophosphates in agriculture has a measurable toxicological effects on earthworms, whereas application of deltamethrin in agriculture is unlikely to affect the response of biochemical biomarkers of earthworms in the environment. The measurements showed that the occurrence of oxidative stress and changes in the activity of efflux pumps might considerably contribute to the toxic effects of investigated pesticides on earthworms. The obtained data on the recovery of biomarkers showed that the recovery of investigated biochemical biomarkers was slow, so it is necessary to take into account the recovery time when designing the monitoring studies of environmental pollution using biochemical biomarkers. Comparison of the earthworm sensitivities showed that the species-specific sensitivity was different after exposure to organophosphates using standardized toxicity tests and microcosm. The obtained differences in sensitivities point to the need of distinguishing between two types of species sensitivity, physiological and environmental sensitivity, and both sensitivities should be taken into account in the interpretation of the results of toxicological and ecotoxicological tests.
Ciklooksigenaze su ključni enzimi u biosintezi prostanoida. Postoje dvije izoforme: COX-1 koja je povezana s održavanjem fizioloških uvjeta u sluznici debelog crijeva; te inducibilna izoforma COX-2 ...koja je uglavnom povezana s patološkim procesima uključujući karcinom debelog crijeva. Cilj ovog istraživanja bio je ispitati ulogu COX izoformi u razvoju i napredovanju sporadičnoga karcinoma debeloga crijeva, mehanizme njihove regulacije te povezanost regulatornih polimorfizama gena COX-1 i COX-2 sa sklonošću obolijevanju i ekspresijom mRNA i proteina. Naši rezultati su pokazali da COX-1 ima zaštitnu, a COX-2 tumorigenu ulogu u sluznici debelog crijeva. Gubitak COX-1 učestali je događaj u karcinogenezi, dok COX-2 pokazuje veću varijaciju između uzoraka. Porast COX-2 ekspresije povezan je s lošijim preživljenjem oboljelih. Dokazali smo povezanost regulatornih polimorfizama sa sklonošću obolijevanju i ekspresijom gena COX-2. Ekspresija proteina odgovara mRNA ekspresiji te nema povezanosti s ekspresijom miR-200 što pokazuje da je ekspresija gena COX-1 i COX-2 primarno regulirana na razini transkripcije.
Cyclooxygenases are the key enzymes in prostanoid biosynthesis. Two isoforms exist: COX-1, associated with maintainance of physiological conditions in colon; and inducible COX-2 that is mainly related to various pathologies including colorectal cancer. The aim of our study was to examine the role of COX isoforms in development and progression of sporadic colorectal cancer, mechanisms of their regulation and whether regulatory polymorphisms in COX genes are related to cancer susceptibility, mRNA and protein expression. Our results show that COX-1 has protective, and COX-2 tumorigenic role in colorectal mucosa. Loss of COX-1 is very frequent in carcinogenesis, while COX-2 shows greater variation between samples. Higher COX-2 expression correlates to worse patient survival. We proved the role of regulatory polymorphisms in cancer susceptibility, and COX-2 expression. Protein expression correlates with mRNA expression, and there is no associtation with miR-200, which indicates transcriptional regulation as the key regulatory mechanism of COX expression.
Koštani morfogenetski protein 6 (BMP6) je ključni regulator hepcidina, proteina koji sudjeluje u održavanju homeostaze željeza. Istražili smo utjecaj željeza na BMP6 u tkivima i plazmi, te zašto ...ostale BMP molekule nisu u mogućnosti spriječiti hematokromatozu u Bmp6 -/- miševa. Kod miševa divljeg tipa, 4 sata nakon tretmana željezom dolazi do povećanja izražaja gena za BMP6 i hepcidin u jetri, dok je izražaj ostalih BMP molekula nepromijenjen. BMP6 je detektiran u cirkulaciji miševa i štakora, te je pružen prvi dokaz utjecaja željeza na povećanje razine BMP6 u plazmi. Naprotiv, u Bmp6 -/- miševa, tretman željezom dovodi do zakašnjele i slabije aktivacije Smad signalnog puta i sinteze hepcidina u jetri nakon 24 sata, zajedno s povećanim izražajem gena za BMP2, 4, 5 i 9 u duodenumu i BMP5 i BMP7 u jetri. Povećana sinteza BMP7 u jetri potencijalno doprinosi indukciji izražaja gena za hepcidin, što je dodatno podržano BMP7 terapijom koja dovodi do djelotvorne sinteze hepcidina i normalizacije serumskog željeza. No, sinteza BMP7 nije povezana s metabolizmom željeza, već s uzročnim oštećenjima jetre gdje BMP7 predstavlja mogući oblik obrambenog mehanizma od viška nakupljenog željeza. Rezultati pokazuju da akutna doza željeza aktivira kompenzacijske mehanizme s različitim BMP molekulama, ali nedovoljnog intenziteta da bi se spriječila hematokromatoza u Bmp6 -/- miševa. Učinkovita terapija s BMP7 sugerira da je BMP6 bitan, ali ne isključiv regulator homeostaze željeza in vivo.
Bone morphogenetic protein 6 (BMP6) is a key regulator of hepcidin expression, a key iron regulatory hormone. We investigated the effect of iron on Bmp6 expression in tissues and plasma, and why other BMPs could not prevent hemochromatosis in Bmp6 -/- mice. In WT mice, 4 hours following iron challenge liver Bmp6 and Hamp expression were increased, while expression of other Bmps was not affected. In parallel, we provided the first evidence that iron increased the circulating BMP6 level. On the contrary, in Bmp6 -/- mice, iron challenge lead to a 24 hours delayed and blunted activation of liver Smad signaling and hepcidin expression, that was accompanied by an increased expression of Bmp2, 4, 5 and 9 in the duodenum and Bmp5 and Bmp7 in the liver. High liver Bmp7 expression potentially contributed to the late hepcidin response, which was further supported by BMP7 therapy resulting in an effective hepcidin expression and normalization of serum iron. However, BMP7 synthesis was not associated with iron metabolism, but the causal hepatic injuries where BMP7 represented a form of defense mechanism to the excessive iron accumulation. Our data indicate that iron activated BMP compensatory mechanisms that were not sufficient for preventing hemochromatosis in Bmp6 -/- mice. However, the effective BMP7 therapy suggested that BMP6 is an essential but not exclusive in vivo regulator of iron homeostasis.
Tekućinska kromatografija visokog učinka (high performance liquid chromatography, HPLC) je jedna od najznačajnijih i najuspješnijih metoda koje se primjenjuju za razdvajanje i pročišćavanje raznih ...molekula. Većina kromatografskih nosača je dizajnirana za razdvajanje proteina te je primjena ove metode u istraživanju makromolekula i makromolekularnih kompleksa otežana. Građa klasičnih nosača se temelji na poroznim kuglicama, a razdvajanje na difuziji. Zbog neadekvatne veličine pora i sporog razdvajanja, primjena ove metode u istraživanju biomolekula nije osobito uspješna. Monolitni su kromatografski nosači napravljeni iz jednog dijela te imaju visoki stupanj poroznosti i veličinu kanala koja je adekvatna za većinu makromolekularnih kompleksa (prosječni promjer je 1,5 μm). Karakterizira ih laminaran protok tekuće faze i interakcije s ligandima koje se temelje na konvekciji, a ne na difuziji što ujedno omogućava brzi prijenos mase i znatno skraćuje vrijeme potrebo za odvijanje eksperimenta (Barut et al., 2008). Viroidi su male jednolančane kružne, i u većini istraživanih slučajeva, fitopatogene RNA-molekule koje ne posjeduju gene za proteine već sve svoje funkcije provode formiranjem raznih sekundarnih/tercijarnih struktura. Te iste strukture omogućuju visoku stabilnost viroida u biljci i izvan nje te su temelj njihove visoke infektivnosti. Rasprostranjivanje virusa vodenim putovima je dobro dokumentirano (Mehle i Ravnikar, 2012) dok prijenos viroida vodom do nedavno nije razmatran. Viroid vretenaste ušiljenosti gomolja krumpira (Potato spindle tuber viroid, PSTVd) može preživjeti i do pet tjedana u vodenom okruženju te zadržati svoju infektivnost (Mehle et al., 2011). Najpreciznija metoda njegove detekcije je kvantitativna lančana reakcija polimerazom uz prethodnu reverznu transkripciju (reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR). Zbog tipičnih stohastičkih efekata koji utječu na qPCR, ova metoda ne može sa sigurnošću detektirati patogen koji je prisutan u izrazito niskim koncentracijama (Morrison et al., 1998). Takva situacija je vrlo vjerojatna u vodenim uzorcima zbog učinka razrjeđenja te je prethodni korak koncentriranja uzorka nužan. Jedan od ciljeva ove doktorske disertacije je optimizacija postupka koncentriranja viroida iz vodenih uzoraka. Analizirano je kromatografsko ponašanje PSTVd-a i biljnih mRNA dvjema adsorbcijskim metodama: ionskom izmjenom i kromatografijom hidroforbnih interakcija. Najbolji prinos ostvaren je pomoću kromatografije hidrofobnih interakcija te je ta metoda korištena za koncentriranje viroida iz vodenih uzoraka. Prinos je analiziran kvantitativnom PCR-metodom. Virus mozaika postrne repe (Turnip yellow mosaic virus, TYMV) i virus grmolike kržljavosti rajčice (Tomato bushy stunt virus, TBSV) pripadaju malim biljnim sferičnim virusima (promjer ~30 nm). Oni su modeli koji su poslužili za razumijevanje ikozaedarske strukture te niza procesa koji se odvijaju tijekom virusne replikacije i tijekom raznih staničnih procesa (Dreher, 2004; Morgan, 2003; Yamamura i Scholthof, 2005). Iako navedeni virusi nemaju jak ekonomski značaj (nisu izrazito patogeni), i danas su atraktivni zbog potencijalne primjene u biomedicini i nanotehnologiji (virus based vectors i virus-like particles). U ovoj doktorskoj disertaciji TYMV i TBSV su prvi put kromatografski izdvojeni iz biljnog homogenata. Korištena je ionsko-izmjenjivača kromatografija jer navedeni virusi posjeduju različiti ukupni naboj pri određenom pH. Sadržaj frakcija je analiziran pomoću kvantitativne PCR-metode, SDS-poliakrilamidne gel-elektroforeze proteina i elektronske mikroskopije. Infektivnost virusnih čestica nakon kromatografije je provjerena inokulacijom zdravih biljaka sadržajem virusnih frakcija te detekcijom virus (RT-qPCR) u tim istim biljkama. Metoda optimizirana za TYMV je primijenjena u analizi izolata koji pripadaju dvjema skupinama sojeva: TYMV-1 i TYMV-2 (Symons et al., 1963). Pripadnici skupine TYMV-2 (TYMV-N i TYMV-D) imaju kraće retencijsko vrijeme nego pripadnici skupine TYMV-1 (TYMV-E i TYMV-Y). Istodobno je uočena mogućnost da se u slučaju izolata TYMV-D radi o miješanoj infekciji dvama sojevima gdje, ovisno o vremenskom periodu, do izražaja dolazi jedan od njih. Nadalje, u ovoj disertaciji je istražena mogućnost primjene monolitne kromatografije u razdvajanju individualnih virusa iz smjesnog uzorka. Pomoću CIM DEAE kolone i radnih pufera sa pH 6, uspješno su razdvojena četiri biljna virusa: tri ikozaedarska (TBSV, TYMV-N i TYMV-E) i jedan štapićasti (TMV). Virus mozaika duhana (Tobacco mosaic virus, TMV) pripada štapićastim virusima (helikalna simetrija) i on je kamen temeljac virologije (Harrison i Wilson, 1999). Primjenom uvjeta optimiziranih za tobamoviruse (CIM QA i pH 5,5) razdvajanje četiriju virusa je bilo manje uspješno te se može zaključiti da svaki virus zahtjeva posebnu optimizaciju što je prethodno dokumentirano u literaturi (Adriaenssens et al., 2012). Adenovirusi serotipa 5 (Ad5) su jedni od najraširenijih vektora u genskoj terapiji (Wiley Database, 2013). Analizirano je kromatografsko ponašanje više genetički modificiranih Ad5- vektora. Frakcije su analizirane SDS-poliakrilamidnom elektroforezom proteina i testom blue forming units. Promjene u heksonskom proteinu koje su dovele do gubitka naboja su rezultirale skraćenim retencijskim vremenom, dok promjene u dužini vlakna nisu imale utjecaj na retencijsko vrijeme. Zamjena vlakna jednog serotipa drugim (Ad5-vlakno je zamijenjeno Ad3-vlaknom) je dovelo do povećanja ukupnog naboja viriona te do produženja retencijskog vremena. Rezultati dobiveni u sklopu ove disertacije pridonose proširenju primjene monolitne kromatografije i metodološki unaprjeđuju istraživanje virusa i viroida. Monolitna kromatografija je brza, praktična i učinkovita metoda za razdvajanje različitih virusnih čestica i te koncentriranje viroidne RNA.
By using monolithic supports it is possible to apply chromatography in purification, separation, and concentration of various large molecules and macromolecular complexes. In this thesis, chromatographic behaviour of RNA molecules was analysed using ion-exchange and hydrophobic interaction modes. A concentrating protocol for Potato spindle tuber viroid, which improved the sensitivity of its reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) detection, was developed. Turnip yellow mosaic virus (TYMV) and Tomato bushy stunt virus were separated from plant homogenate with monolithic supports for the first time. Furthermore, several plant viruses were separated from an artificially mixed sample using ion-exchange chromatography. High recoveries were obtained and virus infectivity was maintained. Electron microscopy confirmed the integrity of the plant virus particles after chromatography. The method was also used to differentiate members of two groups of TYMV isolates representing different virus strains. Chromatographic behaviour of several structurally modified Adenovirus 5-based vectors was considered. The influence of changes in the hexon protein and in the fibre on retention time was observed. Results obtained within this thesis represent methodological advancement in the research of viroids and viruses, proving that monolith chromatography is a fast, practical and efficient method for separation of different virus particles and concentrating viroid RNA.
Vođeni pretpostavkom da protein FADD (engl. Fas-Associated protein with Death Domain) sudjeluje u prijenosu apoptotskih, nekroptotskih i autofagnih signala nakon primjene NB-UVB (engl. Narrowband ...Ultraviolet B) zračenja, istražili smo njegovu ulogu smrtonosnog adaptera na modelu mišjih embrionalnih fibroblasta koji nemaju gen za protein FADD. Rezultati ovog istraživanja pokazuju da divlji tip mišjih embrionalnih fibroblasta umire apoptotskim smrtonosnim mehanizmom nakon izlaganja NB-UVB zračenju i to aktivacijom mitohondrijskog puta, ali bez aktivacije proteina p53. Stanice koje nemaju gen za protein FADD nakon izlaganja NB-UVB zračenju umiru programiranom nekrozom i autofagijom, uz aktivaciju kaspaza 3 i 9, ali bez aktivacije proteina p53, Bax i Bcl-2. Rezultati ukazuju da su protein FADD, ali i kinaza RIP1 (engl. Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1) nužni za pokretanje apoptotskog smrtonosnog mehanizma, dok protein FADD nije nužan za aktivaciju autofagije koja se javlja zajedno s programiranom nekrozom nakon izlaganja stanica NB-UVB zračenju.
Based on the presumption that FADD protein (Fas-Associated protein with Death Domain) intermediates apoptotic, necroptotic and autophagic signals after exposure to NB-UVB (Narrowband Ultraviolet B) irradiation, we tested its role of death adaptor using FADD knockout mouse embrionic fibroblasts. The results show that wild type mouse embryonic fibroblast die by triggering apoptotic death signals through mitochondrial control, but independently of p53. FADD knockout mouse embrionic fibroblasts die by programmed necrosis and autophagy, by activating caspase-3 and -9. Their necrotic programme does not involve p53 nor Bax and Bcl-2. The results show that protein FADD, as well as RIPK1 (Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1), are essential for triggering apoptotic cell death mechanism. FADD protein is not necessary for autophagic mechanism followed by necroptosis after NB-UVB irradiation.
Autoimune bolesti štitnjače – Gravesova bolest (hipertireoza) i Hashimotova bolest (hipotireoza), najčešće su bolesti štitnjače, ali i najčešća autoimuna oboljenja uopće, koja pogađaju oko 2 do 5% ...ukupne populacije. Prevalencija im raste s godinama, a u oba slučaja oko 10 puta češće obolijevaju žene. Kako su digito-palmarni dermatoglifi pokazatelji fenomena rasta i diferencijacije tijekom razdoblja rane embriogeneze, njihova analiza korištena je u istraživanju uloge naslijeđa u nastanku ovih bolesti, u otkrivanju za njih specifičnih biljega te u nastojanju da se ispita izdvajanje ovih bolesti u kontekstu bioloških skupina. Provedena je analiza razlika kvalitativnih i kvantitativnih svojstava dermatoglifa između skupine od 100 žena oboljelih od hipotireoze, 50 oboljelih od hipertireoze te kontrolne skupine od 100 fenotipski zdravih žena. Slijedom rezultata istraživanja koji upućuju na statistički značajne heterogenosti, zaključujemo da se bolesnice s autoimunim bolestima štitnjače izdvajaju kao posebna biološka skupina, razlikuju se i međusobno u latentnom prostoru, što ukazuje na ulogu različitih genskih polimorfizama i okolišnih čimbenika u etiologiji njihovog nastanka.
Hypothyreosis and hyperthyreosis are the most common autoimmune diseases. Their prevalence has been increasing over the years and in both cases women are about 10 times more affected. Dermatoglyphics are the indicators of growth phenomenon and the differentiation during the early stage of embryogenesis. Therefore analysis of digital-palmar dermatoglyphics has been used in the research of the role of heritage in the development of these diseases, also in detecting their specific markers and revealing the idea of their separation in the context of biological groups. The aim of this paper was to analyze the qualitative and quantitative characteristics of the digital and palmar dermatoglyphics between the group of 100 females with hypothyreosis, 50 females with hyperthyreosis and a control group of 100 phenotypically healthy females. The statistical analysis has shown the heterogenity between all examined groups. The results of the research have proved that patients with thyroid autoimmune diseases separate as specific biological group, there are also differences between hypothyreosis and hyperthyreosis in latent space, so we conclude that different polymorphisms of genes together with influence of enviroment are taking part in their development.
Gram-negativne bakterije su uzročnici teških bolničkih infekcija, a posebice infekcija rana. Postoji stalan trend porasta učestalosti rezistencije na sve veći broj antibakterijskih lijekova koji uz ...druge činitelje rizika u hospitaliziranih bolesnika doprinose kolonizaciji i nastanku infekcija uzrokovanih multirezistentnim bakterijama. Cilj ovog rada bio je karakterizirati mehanizme rezistencije u izolatima bakterija Acinetobacter baumannii, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis i Pseudomonas aeruginosa, koje produciraju različite β-laktamaze, iz obrisaka rana. Utvrđena je produkcija β-laktamaza iz TEM, SHV i CTX-M porodice u enterobakteija. U jednom izolatu K. pneumoniae dokazano je prisustvo plazmidne AmpC β-laktamaze iz CMY porodice i VIM metalo-β-laktamaze. Svi izolati P. mirabilis pripadali su istom klonu i posjedovali blaTEM-52 gen. U svih izolata A. baumannii dokazana je insercijska sekvenca ISAba1 i svi su pripadali istom klonu. U izolata P. aeruginosa dokazana je niska stopa produkcije VIM metalo-β-laktamaza i svi su pripadali istom klonu. Niti u jednom izolatu nefermentativnih bakterija nije utvrđena rezistencija na kolistin. Ovi rezultati daju uvid u molekularnu epidemiologiju multirezistentnih bakterija i mogu doprinijeti kreiranju smjernica za empirijsku terapiju teških infekcija.
Gram-negative bacteria are considered to be the most important pathogens causing serious nosocomial infections especially wound infections. The increasing resistance to numerous antibiotics together with other risk factors in hospitalized patients are contributing to development of multiresistant bacteria in recent years. The aim of this study was to determine the mechanisms of antibiotic resistance in: Acinetobacter baumannii, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis and Pseudomonas aeruginosa isolated from wound swabs. ß-lactamases of TEM, SHV and CTX-M family were found in Enterobacteriaceae. Only one isolate of K. pneumoniae produced plasmid-mediated ß-lactamase of CMY family and metallo-β-lactamase of VIM family. All isolates of P. mirabilis harboured blaTEM-52 genes and were clonally related. A. baumannii isolates belonged to a single clone and harboured only blaOXA-51 gene upregulated by ISAba1. The low prevalence of VIM metal-β-lactamase was demonstrated in P. aeruginosa and all of them belonged to the same cluster. Resistance to colistin was not detected in nonfermentative bacteria. The results of this study will give a better insight into molecular epidemiology and enable to establish guidelines for the treatment of these infections.
Fitoplazme ('Candidatus Phytoplasma') su nekultivabilne bakterije bez stanične stjenke izrazito reduciranih genoma koje parazitiraju u floemu biljaka i stanicama kukaca. Gospodarski značajne bolesti ...žutica vinove loze (grapevine yellows; GY) uzrokuju fitoplazme ribosomskih skupina 16SrV-C i V-D (flavescence dorée; FD) i 16SrXII-A (stolbur; bois noir; BN, ‘Candidatus Phytoplasma solani’). Iako uzrokuju gotovo jednake simptome, ove se fitoplazme razlikuju u epidemiologiji te je njihova precizna identifikacija neophodna. Filogenija fitoplazmi temelji se na polimorfizmu evolucijski očuvane genske regije za 16S rRNA, čestom bakterijskom filogenetskom markeru (Gundersen et al., 1994; IRPCM, 2004). Međutim, molekularne analize genske regije 16S rDNA nisu dovoljne za utvrđivanje varijabilnosti među izolatima fitoplazmi unutar iste skupine, te se uz tu regiju analiziraju i dodatni molekularni fitoplazmatski markeri. Identifikacija i karakterizacija fitoplazmi ima značajnu ulogu u epidemiologiji i monitoringu fitoplazmoza. Preciznija klasifikacija fitoplazmi ribosomskih skupina 16SrXII-A i 16SrV vrlo je važna u određivanju točnog uzroka i porijekla novih pojava ekonomskih važnih fitoplazmoza te predviđanju smjera njihovog širenja. Metoda multigenske analize (multilocus sequence typing; MLST) temelji se na istraživanju varijabilnosti evolucijski različito konzerviranih gena. Pri istraživanju fitoplazmi multigenskom metodom ciljani molekularni markeri su najčešće konstitutivni (housekeeping) geni, ali i varijabilni geni specifični za određenu vrstu kao što su geni koji kodiraju za membranske proteine. MLST predstavlja reproducibilan i mjerljiv sustav prikladan za epidemiološke studije jer za karakterizaciju istraživanih izolata pojedinih patogena koristi nukleotidne sljedove koji su lako usporedivi s nukleotidnim sljedovima drugih izolata. Cilj ovog istraživanja bio je provesti multigensku tipizaciju izolata fitoplazmi ribosomske skupine 16SrXII-A analizom gena tuf, vmp1, secY i stamp te izolata fitoplazmi ribosomske skupine 16SrV analizom gena map, secY, uvrB-degV i vmpA i izoliranih iz zaraženih trsova vinove loze (Vitis vinifera L.), kukaca-vektora i korovnih biljaka s područja Hrvatske te pritom istražiti varijabilnost spomenutih izolata. Premda prethodna istraživanja upućuju na značajnu gensku varijabilnost fitoplazmi unutar skupine 16SrXII-A (Langer i Maixner, 2004; Šeruga Musić et al., 2008; Cimerman et al., 2009; Fialova et al., 2009; Aryan et al., 2014) iznenađujuć je broj genotipova utvrđen analizom izolata fitoplazme BN (stolbur) u Hrvatskoj u okviru ove disertacije. Iako je variabilnost BN fitoplazme već bila predmet ranijih istraživanja (Šeruga Musić et al., 2011), ovako detaljna i opsežna tipizacija izolata fitoplazme BN provedena je po prvi put. Temeljem multigenske analize zabilježeno je 3 tuf, 5 secY, 7 vmp1 te čak 10 stamp filogenetskih skupina. Njihovom kombinacijom u pojedinim izolatima utvrđeno je čak sedamnaest različitih genotipova od čega su tri genotipa bila zastupljena većim brojem uzoraka. Najzastupljeniji genotip bio je S6-ST6-V18-tuf-b (24%), zatim S1-ST9-V4-tuf-b (15%) te S39-S46-V3-tuf-a (12%) koji zajedno obuhvaćaju više od polovice analiziranih izolata. Prisutnost drugih genotipova zabilježena je u znatno manjem broju izolata. Geni vmp1 i stamp ali i gen secY pokazali su se znatno varijabilnijim i informativnijim markerima u odnosu na gen tuf omogućivši preciznije razlučivanje između blisko povezanih izolata fitoplazme BN. Uspoređujući rezultate dobivene analizom pojedinih gena s rezultatima istraživanja drugih zemalja može se utvrditi epidemiološki značaj pojedinih tipova izolata. Tako prisutnost oba tuf tipa, tuf-a i tuf-b ukazuje na uključenost obe korovne biljke Urtica dioica L. i Convolvulus arvensis L. u BN epidemiologiju u Hrvatskoj. Analiza secY gena potvrdila je genotip S6 kao jedan od najučestalijih u Europi (Foissac et al., 2013b). Od dva prevladavajuća vmp1 profila u Hrvatskoj, V4, zabilježen je i kao prevladavajuć u Republici Makedoniji (Kostadinovska et al., 2014) te kao široko rasprostranjen genotip u Euro-Mediteranskom području (Foissac et al., 2013). Također je utvrđena podudarnost u povezanosti V3 i tuf a genotipa (Foissac et al., 2013) kao i u Španjolskoj (Sabaté et al., 2014). Uz to, pronalazak V2-TA profila, prvotno potvrđen u kukcu Reptalus panzeri i vinovoj lozi u Srbiji (Cvrković et al., 2014) a zatim i u Republici Makedoniji (Kostadinovska et al., 2014) sugerira nove mogućnosti rasprostranjenja BN fitoplazme. U pogledu analize gena stamp, izolati BN fitoplazme iz Hrvatske mogu se svrstati u dva od četiri velika genetska klastera – klaster IA u koje se ubrajaju i zemlje zapadne Europe: Španjolska, Italija i Francuska te klaster II u koje se ubraja središnja Europa i Balkan: Njemačka, Bugarska, Mađarska i Republika Makedonija. U sklopu ove disertacije po prvi puta je napravljena detaljna karakterizacija fitoplazme FD utvrđene u uzorcima vinove loze te u vektoru Scaphoideus titanus Ball. Provedene filogenetske analize nukleotidnih sljedova gena map fitoplazme FD pokazale su grupiranje u dvije FD skupine/klastera. Analize nukleotidnih sljedova gena uvrB-degV gena nisu u potpunosti pokazale pokazale podudarnost s rezultatima analize gena map i secY. Posebno interesantnom pokazala se analiza varijabilnog gena vmpA za čije istraživanje su u sklopu ove disertacije dizajnirane nove početnice. Sveukupno su utvrđena 2 map, 4 uvrB-degV i 5 secY genotipa. Filogenetska analiza vmpA gena pokazala je podjelu u 3 klastera demonstrirajući tako značajnu ulogu vmpA gena u istraživanju epidemiologije FD fitoplazme. Budući da se svaki map-FD klaster/skupina razlikuje po geografskoj rasprostranjenosti (map-FD2-Francuska i Italija; map-FD3 Italija, istočno europska regija), prisutnost map-FD2 i map-FD3 klastera u Hrvatskoj lakše je tumačiti u svjetlu podataka obivenih iz susjednih zemalja - Srbije gdje je utvrđen map-FD3 klaster (Kuzmanović et al., 2008) i Slovenije gdje je potvrđena prisutnost oba klastera (Mehle et al., 2011) koji sugeriraju moguće puteve unosa. Nalazi fitoplazme FD i BN, redom u vektorima S. titanus i Hyalesthes obsoletus Signoret. potvrdili su njihovu ulogu u rasprostranjivanju i prenošenju fitoplazmi u Hrvatskoj te dali uvid u kompleksnu ekologiju patosistema fitoplazma – vektor – biljka. U sklopu ove disertacije potvrđeni su prijašnji rezultati (Šeruga et al., 2000; Šeruga Musić et al., 2009) široke rasprostranjenosti fitoplazme BN u Hrvatskoj. Prisutnost fitoplazme FD u vinovoj lozi, prvi put utvrđena 2009. godine (Šeruga Musić et al., 2011) samo na jednoj lokaciji na području središnje Hrvatske, tijekom ovog istraživanja potvrđena je na nekoliko novih lokaliteta geografski udaljenih vinskih regija. U četiri godine istraživanja, uočena je tendencija širenja GY-bolesti a osobito pojavljivanja novih žarišta fitoplazme FD. Na pojedinim lokalitetima utvrđena je prisutnost obje fitoplazme, no pri analizama pojedinih izolata nije utvrđena zaraza iste biljke s oba uzročnika. Rezultati dobiveni u sklopu ove disertacije pružili su dublji uvid u raznolikost i rasprostranjenost, te epidemiološki značaj pojedinih tipova izolata fitoplazmi vinove loze prisutnih na teritoriju Republike Hrvatske. Prikupljeni molekularni podaci omogućili su usporedbu podataka sa studijama drugih zemalja na tom području i ukazali na mogući put unosa patogena u Hrvatsku što je osobito bitno za karantensku fitoplazmu FD. Dokazana je vrijednost multigenske analize kao učinkovite, ponovljive i pouzdane metode u diferencijaciji između srodnih sojeva fitoplazmi.
Phytoplasmas ('Candidatus Phytoplasma') are non-cultivable wall-less bacteria found in plant phloem and insect vector cells. Economically important Grapevine yellows (GY) diseases in Croatia are caused by phytoplasmas belonging to the ribosomal groups 16SrV-C and -D (flavescence dorée; FD) and 16SrXII-A (stolbur; bois noir; BN, ‘Candidatus Phytoplasma solani’) which cause similar symptoms but differ considerably in epidemiology. The aim of this thesis was to analyse BN and FD phytoplasma genetic variability through multilocus sequence typing (MLST) of molecular markers differing in conservation and evolution from infected grapevine (Vitis vinifera L.), wild plants and insect vectors collected in Croatia. MLST analysis of BN phytoplasma isolates revealed the presence of 17 different genotypes encompasing three tuf, five secY, seven vmp1 and ten stamp genotypes. The analysis of FD phytoplasma isolates demonstrated the existence of two map, four uvrB-degV and five secY genotypes. The vmpA gene analysis discriminated three clusters. This is the first multigene genotyping performed on FD phytoplasma isolates and first extensive research on BN phytoplasma isolates in Croatia. Results obtained through this comprehensive four-year research revealed considerable genetic diversity of epidemiological relevance and the geographical distribution of differentiated grapevine phytoplasmas strains. Furthermore, possible paths of pathogen introduction in Croatia are indicated.
ABC transporteri sudjeluju u očuvanju crijevne barijere, te utječu na biodostupnost lijekova. Promjene njihove ekspresije mogu doprinijeti narušavanju barijere i razvoju upale, kao što je slučaj u ...upalnim bolestima crijeva. Njihova uloga u patogenezi upalnih bolesti crijeva nije u potpunosti razjašnjena. U ovom istraživanju odredili smo ekspresiju triju transportera: MDR1, MRP1 i BCRP, kod odraslih i djece oboljele od Crohnove bolesti (odrasli; n=25, djeca; n=26) i ulceroznog kolitisa (odrasli; n=27, djeca; n=20). Paralelno smo odredili i ekspresiju proupalnih citokina interferona (IFN)-γ, interleukina (IL)-2, IL-6, IL-1β i IL-17A, kao i njihove negativne regulatore, SOCS1 i SOCS3. Ispitanici su podijeljeni u četiri grupe: neliječeni bolesnici dijagnosticirani de novo, grupa bolesnika pod terapijom, te grupa u remisiji odnosno grupa zdrave kontrole (odrasli; n=10, djeca; n=15). Ovo istraživanje pokazuje izmijenjene ekspresije transportera koji koreliraju s povišenim ekspresijama citokina u oboljelih ispitanika. Nadalje, povišena ekspresija proupalnih citokina, popraćena povišenim ekspresijama njihovih negativnih regulatora, potvrđuju upalni proces kao dominantni patološki mehanizam u upalnim bolestima crijeva. Dakle, promjene ekspresija ABC transportera mogle bi imati funkcionalnu važnost u progresiji bolesti i liječenju.
Efflux transporters are crucial for the maintenance of gut homeostasis and influence drug bioavailability. Changes in their expression can disrupt the barrier which consequently results with inflammatory response, as observed in inflammatory bowel diseases (IBD). Their exact role in IBD pathogenesis is inconclusive. We have measured the expression of transporeters MDR1, MRP1 and BCRP in pediatric and adult patients with Crohn's disease (adults; n=25, pediatric; n=26) and ulcerative colitis (adults; n=27, pediatric; n=20). In paralell, we have assessed the expression of inflammatory cytokines IFN-γ , IL-2, IL-6, IL-1β and IL-17A, as well as their negative regulators, SOCS1 and SOCS3. Subjects were grouped as: newly diagnosed/untreated, active disease/treated, remission and controls (adults; n=10, pediatric; n=15). We showed that altered expression of efflux transporters correlated with cytokine expressions in IBD patients compared to controls. Furthermore, high cytokine expression, followed by high expression of their matched negative regulators, confirmed inflammatory process as the dominant pathological mechanism in IBD. In conclusion, alterations in ABC transporter expression could have functional importance in disease progression and treatment.
