Sekvenciranje cijeloga genoma (eng. Whole genome sequencing – WGS) postaje sve zastupljeniji genetički dijagnostički test u svakodnevnoj kliničkoj praksi. Inicijativa za medicinski genom (eng. ...Medical Genome Initiative – MGI), prepoznala je WGS kao prioritetnu dijagnostičku metodu za otkrivanje rijetkih genetskih bolesti. Jedna od ključnih prednosti WGS-a u odnosu na sekvenciranje cijelog egzoma (eng. Whole exome sequencing – WES) jest mogućnost analize nekodirajućih dijelova genoma, koji čine oko 98,5% naše DNA, a sadrže ponavljajuće sekvence, sekvence koje kodiraju za nekodirajuće molekule RNA, te brojne regulatorne elemenate ključne za kontrolu genske ekspresije. Primjena WGS-a ima značajan potencijal u pedijatriji i budućnost je dijagnostike genetskih bolesti u djece. Implementacija WGS-a u rutinsku pedijatrijsku praksu pruža nove mogućnosti za razvoj personalizirane medicine i poboljšanje zdravlja dječje populacije, uključujući i preventivno djelovanje radi sprječavanja razvoja multifaktorijalnih bolesti poput dijabetesa, astme i pretilosti. U farmakogenomici, WGS omogućuje personalizirano doziranje lijekova na temelju genetičkog profila, smanjujući nuspojave i povećavajući učinkovitost terapije. U području dječje onkologije, WGS omogućuje, pravodobnu dijagnostiku, personaliziranu terapiju i praćenje napredovanja maligne bolesti. Kontinuirani razvoj tehnologije sekvenciranja genoma i smanjenje troškova omogućit će sve veću dostupnost i primjenu WGS-a u svakodnevnoj kliničkoj praksi te otvoriti nove mogućnosti za individualiziranu medicinu i poboljšanje zdravlja dječje populacije.
Sekvenciranje cijeloga genoma (eng. Whole genome sequencing – WGS) postaje sve zastupljeniji genetički dijagnostički test u svakodnevnoj kliničkoj praksi. Inicijativa za medicinski genom (eng. ...Medical Genome Initiative – MGI), prepoznala je WGS kao prioritetnu dijagnostičku metodu za otkrivanje rijetkih genetskih bolesti. Jedna od ključnih prednosti WGS-a u odnosu na sekvenciranje cijelog egzoma (eng. Whole exome sequencing – WES) jest mogućnost analize nekodirajućih dijelova genoma, koji čine oko 98,5% naše DNA, a sadrže ponavljajuće sekvence, sekvence koje kodiraju za nekodirajuće molekule RNA, te brojne regulatorne elemenate ključne za kontrolu genske ekspresije. Primjena WGS-a ima značajan potencijal u pedijatriji i budućnost je dijagnostike genetskih bolesti u djece. Implementacija WGS-a u rutinsku pedijatrijsku praksu pruža nove mogućnosti za razvoj personalizirane medicine i poboljšanje zdravlja dječje populacije, uključujući i preventivno djelovanje radi sprječavanja razvoja multifaktorijalnih bolesti poput dijabetesa, astme i pretilosti. U farmakogenomici, WGS omogućuje personalizirano doziranje lijekova na temelju genetičkog profila, smanjujući nuspojave i povećavajući učinkovitost terapije. U području dječje onkologije, WGS omogućuje, pravodobnu dijagnostiku, personaliziranu terapiju i praćenje napredovanja maligne bolesti. Kontinuirani razvoj tehnologije sekvenciranja genoma i smanjenje troškova omogućit će sve veću dostupnost i primjenu WGS-a u svakodnevnoj kliničkoj praksi te otvoriti nove mogućnosti za individualiziranu medicinu i poboljšanje zdravlja dječje populacije.
Farmakogenomika i farmakovigilancija Božina, Nada
Medicus (Zagreb, Croatia : 1992),
07/2017, Letnik:
26, Številka:
1 Farmakovigilancija
Journal Article
Recenzirano
Odprti dostop
Razvoj nove discipline farmakogenetike/farmakogenomike omogućio je bolje razumijevanje genetičke predispozicije za razvoj neočekivanih reakcija na primijenjeni lijek i posljedično unaprijedio ...individualizaciju farmakoterapije. Postoje genetički određene interindividualne razlike u metaboličkom i transportnom kapacitetu, a time i kinetici lijekova i drugih ksenobiotika. Osim nuspojava lijekova koje su ovisne o dozi važne su nuspojave posredovane imunosnim reakcijama, a povezane su s varijabilnosti u sustavu HLA. Individualna osjetljivost prema toksičnim učincima farmakoterapije, ovisna o biotransformacijskim procesima, povezuje se s genskim polimorfizmima enzima faze I. i II. te transporterima ABC i SLC. Genski polimorfizmi također mogu imati ključnu ulogu u interakcijama lijekova. Povezivanje farmakogenomike s farmakovigilancijom ima važnu ulogu i u praćenju pojavnosti nuspojava poslije stavljanja lijeka na tržište. Regulatorna tijela uvođenjem farmakogenomičkih informacija (informacije o genomskim biljezima) u Sažetku o proizvodu (SPC) nastoje istaknuti ulogu i važnost genomskih varijabilnosti u farmakoterapiji. Također se navodi kojoj kategoriji te farmakogenetičke informacije pripadaju, tj. smatra li se testiranje obvezatnim, ima li ulogu preporuke ili je informativnog karaktera. Radi prikupljanja i implementacije znanja ustanovljeni su i različiti konzorciji među kojima prednjači Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium – CPIC, kao zajednički projekt The Pharmacogenomics Knowledge Base (PharmGKB) i The Pharmacogenomics Research Network koji je okupio eminentne stručnjake iz područja farmakogenetike/farmakogenomike. Glavni je cilj CPIC-a izdavanje recenziranih, ažuriranih, temeljenih na dokazima, slobodno dostupnih uputa i smjernica za primjenu lijeka prema rezultatu farmakogenetičkih analiza. Te će smjernice svakako ubrzati prijenos znanja u kliničku primjenu.
The introduction of antipsychotic medication in the 1950s forever changed the outlook on the treatment of schizophrenia, although there is still a large proportion of patients who do not reach ...functional recovery. At least 30% of patients do not respond to clozapine, the tricyclic dibenzodiazepine with complex pharmacological actions, which was proven to be more effective than any other antipsychotic in the treatment of schizophrenia. According to most of the therapeutic guidelines for schizophrenia, clozapine is the third line therapy for patients who did not respond to other antipsychotics. Large inter-individual variability exists for clozapine bioavailability and plasma steadystate concentrations and clearance. Clozapine is metabolized by the cytochrome P450 oxidase enzyme family (CYP450). Cytochrome P450 1A2 (CYP1A2), which is polymorphically expressed in humans, is the main enzyme of clozapine metabolism. This case report addresses the influence of CYP1A2*1F genetic polymorphism on cloza - pine metabolism, explains the primary non-response of a young patient with schizophrenia due to increased gene expression in homozygous genotype *1F/*1F (increased metabolism of clozapine) and underlies the importance of personalizing schizophrenia treatment by means of genetic and other molecular tools, at least in the cases of »treatment resistance«.
Početak primene antipsihotika pedesetih godina prošlog veka zauvek je promenio perspektivu lečenja shizofrenije, mada značajan broj pacijenata sa ovom bolešću još uvek ne postiže funkcionalni oporavak. Klozapin, triciklični di- benzodijazepin sa kompleksnim tarmakološkim profilom, koji se u tretmanu shizofrenije pokazao efikasnijim od osta- lih antipsihotika, uglavnom je treča linija terapijskog izbora. Međutim, u najmanje 30% slučajeva obolelih od shizofreni- je stanje se ne poboljšava ni na terapiji klozapinom, pa se zbog toga pristupa polifarmaciji i odstupa od racionalne primene psihofarmaka. Postoji velika interindividualna vari- jabilnost u bioraspoloživosti klozapina, stabilnoj koncentra- ciji u plazmi i njegovom klirensu. Klozapin se metaboliše preko sistema citohrom P450 oksidaza (СYР450). Cito- hrom P450 1A2 (СYР1А2), koji se u humanoj populaciji odlikuje genskim polimorfizmima, glavni je enzim u meta- bolizmu klozapina. Aktuelni prikaz slučaja ilustruje uticaj polimorfizma CYP1A2*1F na metabolizam klozapina, gde je primarni izostanak odgovora na terapiju kod mlade paci- jentkinje sa shizofrenijom objašnjen povećanjem ekspresije gena kod homozigotnog genotipa *1F/*1F (povišen meta- bolizam klozapina), i naglašava značaj personalizacije tret- mana shizofrenije uz pomoć genetike i drugih molekularnih parametara, posebno u slučajevima »terapo-rezistence«.
The study was undertaken to assess the influence of functional -308G/A TNF-α (rs 1800629) and -174G/C IL-6 (rs1800795) promoter polymorphisms on the therapeutic response to etanercept, a TNF-α ...blocker, in patients with rheumatoid arthritis (RA).
Seventy-three patients suffering from active RA were studied, at baseline and 6 and 12 months after therapy. The therapeutic response was estimated according to the European League Against Rheumatism response criteria. Patients were genotyped for -308G/A TNF-α and -174G/C IL-6 polymorphisms by the PCR-RFLP method, and the influence of genotype on etanercept response was assessed.
No difference in the percentage of responders (patients who had DAS28 improvement > 1.2) between patients with the TNF-α-308GG and GA and AA genotype was detected after 6 and 12 months of treatment. After 12 months of treatment the percentage of responders was significantly increased in patients with the IL-6 -174GG genotype compared with those with the GC or CC genotype (p=0.006 by Chi-square test). Evaluation of the patients according to their combined IL-6/TNF-α genotypes showed that patients with the IL-6 -174GG / TNF-α -308GG genotype were more frequent among the responders compared to those with other combined genotypes (p=0.022 by Chisquare test). More precisely, all patients with the combined IL-6 -174GG / TNF-α -308GG genotype were responders after 12 months of etanercept treatment.
The study suggests that patients who are genetically low TNF-α and IL-6 producers are the best responders to etanercept therapy.
Personalizirana medicina, odnosno individualizirana terapija lijekovima prema bolesnikovoj genetici očekivano se trebala razviti iz projekta humanoga genoma. Farmakogenomika proučava interakciju ...između ljudskoga genoma i kliničkog odgovora na lijek. Međutim, složenost interakcija između lijeka i pacijenta ne ovisi samo o bolesnikovu genomu već i o mnogima drugim čimbenicima, kao okolišnim faktorima, interakcijama lijek – lijek, polimorfizmu u transporterima i receptorima. U djece je situacija još složenija jer u obzir treba uzeti ontogenomiku, gdje je razvoj ključnih tjelesnih enzima vezan uz kronološku dob djeteta, koja stvara varijabilnost i u farmakokinetici i u farmakodinamici.
The term »personalized medicine« (PM) was coined in the late 1990s, but was not introduced to general US public until about a decade later, through Genomics and Personalized Medicine Act. According ...to this act, PM is defined as any clinical practice model that utilizes genomic and family history information to customize diagnostic and therapeutic interventions and improve health outcomes. One of the emerging disciplines essential for implementation of PM is clinical pharmacogenomics (PGx), where patient’s genetic information is utilized to personalize drug therapy. PGx testing includes mostly detection of small DNA variations, such single nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions, and deletions in the genes encoding the drug transporters, receptors and metabolizing enzymes. By providing the right drug at the optimal dose to each patient, PGx promises to significantly improve drug efficacy and prevent adverse drug reactions. In the early 2000s, the US Food and Drug Administration joined scientists and laboratorians in their efforts to translate recent genetic advances into clinical practice by requiring the drug manufacturers to include genetic information on their product labels. To date several drugs including irinotecan, warfarin, abacavir and clopidogrel are labeled with the information relating different enzymatic polymorphisms with the adverse drug effects or the impaired drug efficacy. The majority of PGx testing involves SNP detection within the family of Cytochrome (CYP) P450 enzymes responsible for metabolism of most drugs, such as anti-depressants (e.g. CYP2D6) and anticoagulants (e.g. CYP2C9, 2C19) to name a few. PGx tests are still very low volume tests and it is not clear how and to what extent genotyping information is being utilized in the clinical practice, mostly due to the lack of outcome studies demonstrating the clinical utility of PGx testing. For instance, it is well known that approximately 30% of Caucasian population carries a polymorphic CYP2C9 allele that predisposes them to higher warfarin sensitivity and thus to increased bleeding risk. How - ever, there are no large, randomized outcome studies that conclusively demonstrate reduction of bleeding events or decrease in hospitalization rates in population dosed based on genotype information. The clinicians are thus reluctant to incorporate warfarin genotyping into their practice. Despite the attention PGx has received in recent years, the adoption of PGx into routine clinical testing is still far from being commonplace. The barriers to wider adoption and implementation of PGx include lack of education and understanding by prescribing physicians regarding the available tests, lack of consensus guidelines on interpretation and use of genotype results and scarcity of randomized controlled trials demonstrating the clinical utility of PGx testing. However, as ge netic testing is becoming increasingly patient driven thought di - rect-to-consumer testing, clinicians and laboratorians must continue to work toward full implementation of PGx testing into routine clinical practice.
Izraz »personalizovana medicina« (PM) je nastao kasnih 1990-ih, ali je uveden u op{tu upotrebu u SAD tek deceniju kasnije, kroz Akt o genomici i personalizovanoj medicini. Prema ovom aktu, PM je definisana kao bilo koji model klini~ke prakse koji koristi genomi~ke i informacije iz porodi~ne istorije za prilago|avanje dijagnosti~kih i terapeutskih intervencija i pobolj{anje ishoda. Jedna od novih disciplina esencijalnih za implementaciju PM je klini~ka farmakogenomika (PGx), gde se geneti~ke informacije pacijenta koriste za personalizaciju farmakoterapije. PGx ispitivanja uklju~uju uglavnom detekciju malih varijacija DNK, takvih polimorfizama pojedina~nih nukleotida (SNP), insercija i delecija u genima koji kodiraju transportere za lekove, receptore i metaboli{u}e enzime. Davanjem odgovaraju}eg leka svakom pacijentu u optimalnoj dozi, PGx obe}ava zna~ajno pobolj{anje efikasnosti leka i spre~avanje ne`eljenih efekata. U ranim 2000.-im, Ameri~ka administracija za hranu i lekove se pridru`ila nau~nicima i laboratorijskim stru~njacima u njihovim naporima da prevedu nedavna otkri}a na polju genetike u klini~ku praksu zahtevom da proizvo|a~i lekova uklju~e genetske informacije u prate}e podatke za svoje proizvode. Do sada su za nekoliko lekova, uklju~uju}i irinotekan, varfarin, abakavir i klopidogrel dodate informacije koje povezuju razli~ite enzimske polimorfizme sa ne`eljenim efektima ili smanjenom efikasno{}u. Ve}ina PGx ispitivanja uklju~uje detekciju SNP unutar familije enzima citohroma (CYP) P450 odgovornih za metabolizam ve}ine lekova, kao {to su na primer antidepresivi (npr. CYP2D6) i antikoagulansi (npr. CYP2C9, 2C19). Zahtevi za PGx testovima su jo{ uvek vrlo retki i nije jasno kako i u kom stepenu }e se informacije o genotipu koristiti u klini~koj praksi, uglavnom zbog nedostatka studija ishoda koje pokazuju klini~ku korist PGx ispitivanja. Na primer, dobro je poznato da oko 30 % populacije belaca poseduje polimorfni alel CYP2C9 koji predstav - lja predispoziciju za ve}u osetljivost prema varfarinu i time za pove}ani rizik od krvarenja. Me|utim, ne postoje velike, randomizirane studije ishoda koje pokazuju redukciju krvarenja ili smanjenje stope hospitalizacije u populaciji u kojoj je do - ziranje zasnovano na genotipskim informacijama. Zato klini~ari nerado inkorporiraju genotipizaciju varfarina u svoju praksu. Uprkos pa`nji posve}enoj PGx poslednjih godina, uvo |enje PGx u rutinska klini~ka ispitivanja je daleko od uobi ~ajenog. Prepreke {irem prihvatanju i implementaciji PGx uklju~uju i nedostatak edukacije i razumevanja raspo - lo`ivih testova od strane lekara, nedostatak konsenzus smernica za interpretaciju i upotrebu rezultata genotipizacije i osku dica randomiziranih kontrolisanih ispitivanja koja poka - zuju klini~ku korist PGx ispitivanja. Me|utim, kako geneti~ka ispitivanja postaju sve vi{e usmerena ka pacijentu, iako spa - daju u ispitivanja »direktno do potro{a~a«, klini~ari i labo - ratorijski stru~njaci moraju da nastave da rade na potpunoj implementaciji PGx ispitivanja u rutinsku klini~ku praksu.
Nowadays, genetics and genomics are fully integrated into medical practice. Personalized medicine, also called genome-based medicine, uses the knowledge of the genetic basis of disease to ...individualize treatment for each patient. A number of genetic variants, molecular genetic markers, are already in use in medical practice for the diagnosis, prognosis and follow-up of diseases (monogenic hereditary disorders, fusion genes and rearrangements in pediatric and adult leukemia) and presymptomatic risk assessment (BRCA 1/2 for breast cancer). Additionally, the application of pharmacogenomics in clinical practice has significantly contributed to the individualization of therapy in accordance with the patient’s genotype and gene expression profile. Genetic testing for several pharmacogenomic markers (TPMT, UGT1A1, CYP2C9, VKORC1) is mandatory or recommended prior to the initiation of therapy. The most important achievement of genome-based medicine is molecular-targeted therapy, tailored to the genetic profile of a disease. Testing for gene variants in cancer (BCR-ABL, PML/RARa, RAS, BCL-2) is part of the recommended evaluation for different cancers, in order to achieve better management of the disease. The ultimate goal of medical science is to develop gene therapy which will fight or prevent a disease by targeting the disease causing genetic defect. Gene therapy technology is rapidly developing, and has already been used with success. Although medicine has always been essentially »personal« to each patient, personalized medicine today uses modern technology and knowledge in the field of molecular genetics and genomics, enabling a level of personalization which leads to significant improvement in health care.
Genetika i genomika su danas potpuno integrisane u medicinsku praksu. Personalizovana medicina, poznata i kao medicina zasnovana na genomu, koristi znanja o genetičkoj osnovi bolesti da bi se individualizovalo lečenje svakog pacijenta. Veliki broj genetičkih varijanti, molekularno-genetičkih markera, već se koristi u kliničkoj praksi za dijagnozu, prognozu i praćenje bolesti (monogenska nasledna oboljenja, fuzioni geni i rearanžmani u pedijatrijskim i adultnim leukemijama) i presimptomatsku procenu rizika od obolevanja (BRCA1/2 za kancer dojke). Osim toga, primena farmakogenomike u kliničkoj praksi značajno je doprinela individualizaciji terapije u skladu sa genotipom i profilom ekspresije gena pacijenta. Genetičko testiranje za nekoliko farmakogenomičkih markera (TPMT, UGT1A1, CYP2C9, VKORC1) obavezno je ili se prepo ručuje pre započinjanja terapije. Najvažniji doprinos medicine za snovane na genomu je ciljana molekularna terapija, prilagođ ena genetskom profilu bolesti. Testiranje genetičkih varijanti u malignim oboljenjima (BCR-ABL, PML/RARa, RAS, BCL-2, KIT, PDGFR, EGF) doprinosi tačnijoj stratifi kaciji različitih kancera i adekvatnom izboru terapije. Krajnji cilj medicinske nauke je da primeni gensku terapiju koja bi eliminisala uzrok bolesti ili prevenirala bolest, ciljajući genetički defekt koji leži u osnovi bolesti. Tehnologija koja pra ti gensku terapiju veoma se brzo razvija i već se uspešno primenjuje. Iako je medicina oduvek suštinski bila »personalizovana «, prilagođena svakom pacijentu, perso nalizovana medicina danas koristi modernu tehnologiju i znanja iz oblasti molekularne genetike i genomike, omo gućujući stepen personalizacije koji vodi ka značajnom napretku medicinske prakse.
High incidence and poor prognosis of lung cancer make it a major health problem worldwide. Although smoking is a major cause of lung cancer, only some smokers develop lung cancer, which suggests that ...there is a genetic predisposition in some individuals. 8-OHG is an important oxidative base lesion and may elevate due to cancer and smoking. It is repaired by 8-hydroxyguanine DNA glycosylase 1 (OGG1), which has several polymorphisms. Although the Ser326Cys polymorphism is consistently associated with a range of cancers, findings about this polymorphism and lung cancer risk are contradictory. To date, no study has examined this association in the Turkish population. We conducted a case-control study to investigate the association between OGG1 Ser326Cys polymorphism and the risk of lung cancer using PCR-RFLP. We also evaluated gene-smoking interaction and excretion of urinary 8-OHdG. Our results suggest that the OGG1 Ser326Cys polymorphism is not a genetic risk factor for lung cancer, and that the heterozygous genotype is associated with a significantly reduced risk for lung cancer. The levels of 8-OHdG did not correlate with the polymorphism and smoking. Larger association studies are needed to validate our findings, and mechanistic studies are needed to elucidate the underlying molecular mechanisms of this association.
Karcinom pluća velik je javnozdravstveni problem u čitavom svijetu zbog svoje visoke učestalosti i loše prognoze. Premda je navika pušenja jedan od glavnih uzročnika karcinoma pluća, od ove bolesti oboli samo dio populacije pušača, što govori u prilog postojanju genetske predispozicije za njezin nastanak. 8-OHG je oksidativno oštećenje baze u molekuli DNA čija se učestalost može povećati zbog zloćudnih tumora i pušenja. U popravku tog oštećenja sudjeluje enzim 8-hidroksigvanin DNA-glikozilaza (OGG1) za koji je dokazano postojanje polimorfizma. Iako se polimorfizam Ser326Cys često dovodi u vezu s različitim vrstama zloćudnih bolesti, dosadašnji su rezultati o vezi između polimorfizma tog enzima i rizika od pojave karcinoma pluća kontradiktorni. Do danas na turskoj populaciji nisu provedena istraživanja koja bi dala jasne odgovore o toj povezanosti. Ovo je istraživanje usporedo provedeno u bolesnika i u zdravoj populaciji primjenom metode PCR-RFLP s ciljem utvrđivanja moguće povezanosti polimorfizma OGG1 Ser326Cys i rizika od karcinoma pluća. Nadalje, istražena je interakcija gena i navike pušenja te ekskrecija 8-OHdG u mokraći. Dobiveni rezultati pokazuju da polimorfizam OGG1 Ser326Cys nije genetski čimbenik rizika od pojave karcinoma pluća, a pokazalo se da je heterozigotni genotip povezan sa značajno nižim rizikom od karcinoma pluća. Razine 8-OHdG izmjerene u mokraći nisu bile u korelaciji ni s polimorfizmom ni s navikom pušenja. Zaključujemo da su za vrednovanje dobivenih rezultata potrebna istraživanja na još većem broju ispitanika te mehanistička istraživanja koja bi mogla razjasniti molekularne mehanizme koji su u pozadini ove povezanosti.
Bez sumnje je da budućnost medicine stremi ka vrhunskim metodama rane dijagnostike
i individualno dizajniranom liječenju, stoga je Komisija EU 2016. među svoje ključne prioritete
u zdravstvu uvrstila ...koncept personalizirane medicine i osnavala Internacionalni
konzorcij za personaliziranu medicinu (International Consortium of Personalized Medicine,
ICPerMed), sa zadaćom da sinkronizira rad svih članica EU na standardiziranju dijagnostičkih
i terapijskih postupaka vezanih uz personaliziranu medicinu u čijem radu sudjeluje
i Republika Hrvatska. Ključna područja personalizirane medicine su identifikacija gena i
molekularnih biljega povezanih s bolestima; farmakogenomika (procjena omjera koristi i
rizika pri odabiru i doziranju pojedinih lijekova, predviđanje nuspojava) te procjena rizika
za nastanak najčešćih bolesti moderne civilizacije i posljedično liječenje. Primjena rezultata
farmakogenomike u konceptu personalizirane medicine ovisi o sposobnosti kliničkih laboratorija
da kliničaru u pravom trenutku podastre precizne, točne, korisne informacije, koje
bi omogućile propisivanje pravog lijeka u pravoj dozi za svakog pojedinog bolesnika. Ovaj
pregled pobliže će prikazati domete farmakogenomike koja predstavlja značajnu kariku u
personaliziranoj medicini i omogućuje transformaciju medicine od reaktivne ka proaktivnoj
medicini te predstaviti preporuke CIPC-a (Clinical Pharmacogenetics Implementation
Consortium) za testiranje odnosa gen/lijek 19 najčešćih lijekova koji se koriste u Hrvatskoj
a u svrhu osiguranja odgovarajučeg liječenja.
PDF
