U Hrvatskoj je selekcijom plus stabala u jednoj matičnoj populaciji pokrenuto oplemenjivanje obične smreke kao božićnoga drvca. Idući je cilj toga procesa utrđivanje optimalne procedure kloniranja ...izabranih plus stabala radi masovne proizvodnje reprodukcijskoga materijala (sadnica). Pretpostavka je da će se takvim načinom stvoriti kvalitetan reprodukcijski materijal koji će se odlikovati stabilnošću ciljnih fenotipskih svojstava. U radu su predstavljeni prvi rezultati istraživanja mogućnosti kloniranja plus stabala obične smreke metodom zakorjenjivanja odrvenjelih reznica.
Glavni cilj istraživanja bio je utvrđivanje uspješnosti primjene raznovrsnih hormonskih tretmana na zakorjenjivanje odrvenjelih reznica starijih (10–12 godina) stabala obične smreke uzetih u ranoproljetnom i kasnojesenskom razdoblju s različitih visinskih etaža krošanja (gornja, srednja i donja trećina krošnje). Provedena su dva eksperimenta. U prvom je po 270 reznica odrezano u rano proljeće iz svake od triju visinskih etaža krošanja, na uzorku od 10 stabala. Po 10 reznica iz svake etaže tretirano je s 27 različitih tretmana (2 tipa hormona × 4 koncentracije otopine × 3 vremena trajanja tretiranja + Clonex + kontrola 1 + kontrola 2). Drugo je istraživanje provedeno na po 80 reznica odrezanih iz donje trećine krošanja od 13 izabranih plus stabala u kasnu jesen. Po 30 reznica tretirano je u trajanju od 10 sekundi sa: (i) hormonom IBA koncentracije 2500 ppm, (ii) hormonom IBA koncentracije 500 ppm. Ostatak od 20 reznica poslužio je kao kontrola. Nakon tretiranja hormonom reznice su pikirane u tzv. »paper pot saća« (sadrže 80 heksagonalnih otvora dubine 15 cm, napunjenih supstratom treset : pijesak u omjeru 3 : 1). U listopadu nakon pikiranja obavljena je determinacija uspješnosti zakorjenjivanja svake pojedine reznice, utvrđivanje broja korijenskih žila zakorijenjenih reznica te izmjere duljine najdulje razvijene korijenske žile na svakoj zakorijenjenoj reznici.
Rezultati su pokazali da se stabla obične smreke u dobi od desetak godina u prosjeku mogu relativno uspješno klonirati metodom zakorjenjivanja odrvenjelih reznica uzetih iz donje trećine krošanja u kasnu jesen ili rano proljeće, i to bez ikakva tretiranja (50 %-tni uspjeh). Postotak zakorijenjenih reznica i kvaliteta novostvorenoga korijena mogu se poboljšati jeftinim, ali čini se učinkovitim tretiranjem baze reznica destiliranom vodom u trajanju od dva sata. Međutim, rezultati su pokazali da bi se tretiranjem baze odrvenjelih reznica uzetih u rano proljeće hormonskom otopinom IBA koncentracije 500 ppm u trajanju od 10 s postotak uspješnoga zakorjenjivanja mogao značajno povećati (u prosjeku do 80 %-tne zakorijenjenosti). Odrvenjele reznice uzete iz donje trećine krošanja najbolje se zakorjenjuju, čak i bez ikakvih tretiranja (50 % kontrolnih reznica, u usporedbi s 40 % kontrolnih reznica iz srednje i 20 % zakorijenjenih kontrolnih reznica iz gornje trećine krošnje). Rezultati su otkrili izrazite individualne razlike u uspjehu zakorjenjivanja reznica uzetih iz donje etaže (postotak zakorjenjivanja kretao se od 0 % do 100 %).
By selecting plus trees in a base population, a breeding process of Norway spruce as Christmas trees was initiated in Croatia. The next stage of the process is the optimization of the cloning procedure of selected plus trees for the mass production of their reproductive material (seedlings). The assumption is that qualitative reproductive material exhibiting stability of targeted phenotypic traits will be created in such a way.
The main aim of the research was to determine the success of various hormonal treatments on rotting of hardwood cuttings of older Norway spruce trees (10–12 years). Two experiments were carried out. In the first, 270 cuttings were cut off in early spring from each of the three crown levels (upper, middle and lower third of a crown), on a sample of 10 trees. The cuttings from each level were treated with 24 different treatments (dipped in IBA and NAA hormone solutions of 250, 500, 2500 and 5000 ppm for 10s, 1h and 2h). In addition to these treatments, 10 cuttings from each crown level were treated with a commercial hormone product named Clonex (a gel). Additional 10 cuttings were treated with distilled water for 2h and the remaining 10 were not treated. The last two groups of cuttings served as a control of the success of the analyzed hormonal treatments. Another study was conducted on 80 cuttings cut off in late fall from the lower third of a crown of the 13 selected plus trees. Thirty cuttings were treated for 10s with: (i) 2500 ppm IBA solution, and (ii) 500 ppm IBA solution. The remaining 20 cuttings served as the control. Afterwards, the cuttings were placed in containers filled with peat, sand and perlite substrate. The rooting success, the number of roots per cutting, and the length of the longest developed root were determined later in October.
The results showed that, on average, spruce trees at the age of 10+ years could be relatively successfully cloned (50% rooted cuttings on average) by rooting hardwood cuttings taken in late autumn or early spring from the lower third of a tree crown, without any treatment. The percentage of rooted cuttings and the quality of newly created roots can be improved at low cost and high effectiveness by treating cuttings with distilled water for 2 hours. However, the results indicated that by treating the base of cuttings taken in early spring with a hormonal solution of 500 ppm IBA for 10s, the percentage of successful rooting could be significantly increased (up to an average of 80% rooting). Hardwood cuttings taken from the lower third of crowns were most successfully rooted, even without any treatment (50% control cuttings, compared to 40% control cuttings from the middle and 20% rooted cuttings from the top third of crowns). The results also indicated marked individual differences in the success of rooting of cuttings taken from the lower parts of a crown (percentage of rooting ranged from 0% to 100%).
Rad donosi pregled pojmova i spoznaja o genetičkom inženjerstvu te njegova razvoja u drugoj polovici XX. stoljeća do danas u svijetu i u Hrvatskoj. Genetičko inženjerstvo je naziv koji je pretrpio ...najveće pojmovne deformacije u biologiji i stoga su u radu jednoznačno objašnjeni važni pojmovi. Kako podatci i dokumentacija o genetičkom inženjerstvu u širem opsegu nisu dostupni javnosti, u radu se donosi sustavan pregled njegova razvoja u Hrvatskoj te su prikazane uloge pojedinaca, njihove interakcije i doprinosi. Već su u 1970-ima hrvatska farmaceutska industrija, kao i istraživačke institucije u Hrvatskoj, bile poprište zamaha biotehnologije i genetičkoga inženjerstva u istraživanju i razvoju proizvoda. Različite istraživačke grupe, većinom okupljene oko sastavnica Sveučilišta u Zagrebu (napose Prehrambeno-biotehnološkoga fakulteta i Prirodoslovno-matematičkoga fakulteta), Instituta Ruđer Bošković i PLIVE, rabe tehnologiju rekombinantne DNA za svoja osnovna istraživanja. Osim kronologije zbivanja povezanih s temom genetičkoga inženjerstva, rad opisuje i zasluge znanstvenika (M. Demereca, V. Johanides, M. Alačević, Ž. Trgovčevića, Ž. Kućana, S. Jelaske, V. Gamulin, V. Delića, I. Weygand-Đurašević, Z. Zgage, S. Jelenića, i dr.) u području genetičkoga inženjerstva.
The paper provides an overview of concepts and knowledge about genetic engineering and its development in Croatia and abroad from the second half of the 20th century to the present day. Genetic engineering is the biological term that has undergone the greatest conceptual deformations,
and therefore some important concepts are unambiguously explained in the paper. As data and documentation on this are not widely available to
the public, a systematic overview of the development of genetic engineering in Croatia as well as the roles of individuals, their interactions and contributions is also presented. As early as the 1970s,
the Croatian pharmaceutical industry and research institutions in Croatia produced a wave of biotechnological and genetic engineering research and product development. Various research groups, mostly gathered around the constituents of the University of Zagreb (especially
the Faculty of Food Technology and Biotechnology and the Faculty of Science), the Ruđer Bošković Institute and PLIVA, use recombinant DNA technology for their basic research. In addition to a chronology of events related to genetic engineering, the paper also describes the work
and merits of scientists M. Demerec, V. Johanides, M. Alačević, Ž. Trgovčević, Ž. Kućan, S. Jelaska, V. Gamulin, V. Delić, I. Weygand-Đurašević, Z. Zgaga, S. Jelenić, and others in the field of genetic engineering.
Više od pet desetljeća istraživanja re- produktivne biologije omogućilo je razvoj biotehnoloških postupaka koji povećavaju učinkovitost mesnog i mliječnog govedar- stva. Ovi postupci omogućuju ...manipulaciju gametama i zametcima u svrhu poboljšanja plodnosti i genetskog napretka. Usvajanje i primjena postupaka asistirane reproduk- cije u rasplođivanju krava ima dalekosežne posljedice u komercijalnom uzgoju stoke. Umjetno osjemenjivanje, embriotransfer i proizvodnja zametaka in vitro tehnologije su koje se sustavno primjenjuju u uzgojnim pro- gramima diljem svijeta omogućavajući brzi genetski napredak, skraćenje generacijskog intervala, kontrolu zaraznih bolesti i sman- jenje proizvodnih troškova. Umjetno os- jemenjivanje desetljećima je najisplativiji i najkorišteniji način širenja poželjnog geno- ma. Embriotransfer je tijekom posljednjih 30 godina postao međunarodno prihvaćena metoda rasplođivanja s preko 500 000 zam- etaka proizvedenih in vivo godišnje. Propisi Međunarodnog društva za embriotransfer vezani uz sanitarnu kontrolu proizvodnje za- metaka omogućuju siguran transport in vivo proizvedenih zametaka, bez rizika od širenja zaraznih bolesti. Od ukupnog broja zametaka, oko 15% godišnje ih se proizvodi in vitro. Ova tehnologija omogućuje dobivanje zametaka od plotkinja visoke genetske vrijednosti koje ne mogu dati potomstvo prirodnim putem, a zbog veće učinkovitosti s vremenom bi mo- gla zamijeniti klasične programe MOET-a. Postupci asistirane reprodukcije poput em- briotransfera i in vitro proizvodnje zametaka zajedno s krioprezervacijom, od izuzetne su važnosti u očuvanju izvornih i ugroženih pasmina goveda. Njihova primjena nezaobi- lazna je u programima uspostave banke gena koji pomažu u očuvanju farmskih genetskih resursa. Osim navedenog, ove biotehnologi- je povećavaju ponudu visokokvalitetne stoke te primjenu naprednih biotehnologija. Određivanje spola spermija i zametaka nudi stočarima mogućnost odabira spola teleta, a time i isplativiju proizvodnju mesa i mli- jeka. Napredne biotehnologije poput kloni- ranja i transgeneze imaju veliki potencijal u rasplođivanju, no zbog troškova i loših rezultata one se uglavnom koriste u istraživanjima te u farmaceutskoj industriji.
Cilj je istraživanja bio utvrđivanje uspješnosti primjene raznovrsnih hormonskih tretmana na zakorjenjivanje odrvenjelih reznica obične jele (20+ godina). Provedena su dva pokusa. U prvom su reznice ...odrezane u rano proljeće iz triju visinskih etaža krošanja. Baze su reznica umakane u hormonske otopine IBA i NAA koncentracije 250, 500, 2500 i 5000 ppm u trajanju od 10 s, 1 h i 2 h. Dio je reznica tretiran komercijalnim preparatom Clonex. Drugi je pokus proveden s reznicama uzetim iz donje trećine krošanja u kasnu jesen koje su tretirane 10 s sa: (i) hormonom IBA koncentracije 2500 ppm, (ii) hormonom IBA koncentracije 10 000 ppm, te (iii) kombinacijom hormona IBA 2500 ppm + NAA 500 ppm. Nakon tretiranja reznice su pikirane u kontejnere napunjene supstratom od treseta, pijeska i perlita. U listopadu je determinirana uspješnost zakorjenjivanja reznica, utvrđen je broj korijenskih žila te izmjerena duljina najdulje razvijene korijenske žile. Kloniranje stabala obične jele metodom zakorjenjivanja odrvenjelih reznica imalo je vrlo nisku uspješnost (0–20 %). Primijenjene metode nisu se pokazale učinkovitima za potrebe masovnoga kloniranja stabala u dobi od 20 i više godina, premda je hormonsko tretiranje povećalo uspješnost zakorjenjivanja i kvalitativna svojstva korijena. Najveći je uspjeh postignut primjenom hormona IBA u koncentraciji 2500 ppm u trajanju od 10 s, i to na reznice uzete u rano proljeće iz donje trećine krošanja. Reznice se uglavnom nisu zakorijenile bez hormonskoga tretiranja. Međutim, identificirani su genotipovi čije su se reznice zakorijenile i bez hormonskoga tretiranja, premda u vrlo niskom postotku. Utvrđena je velika međugenotipska varijabilnost i u sposobnosti zakorjenjivanja netretiranih reznica, i u reakciji na hormonsko tretiranje.
U ovom radu analiziraju se argumenti za i protiv reproduktivnog i terapeutskog kloniranja te pravna regulacija reproduktivnog i terapeutskog kloniranja na međunarodnoj i nacionalnoj razini.
Rezultati ...analize pokazuju kako su terapeutsko i reproduktivno kloniranje otvorila dva vrlo osjetljiva pitanja koja se odnose na stvaranja ljudskih klonova i uporabu ljudskog embrija u terapeutske svrhe. U pogledu reproduktivnog kloniranja prevladava stav kako ono narušava osnovna načela na kojima su utemeljena ljudska prava, te se na međunarodnoj, regionalnoj i nacionalnoj razini donose instrumenti o njegovoj zabrani. S druge strane, oko zabrane terapeutskog kloniranja nije postignuta suglasnost, pa to pitanje nacionalna zakonodavstva rješavaju različito.
Republika Hrvatska zabranila je reproduktivno kloniranje i propisala ga kao kazneno djelo. U pogledu terapeutskog kloniranja ne postoji odgovarajuća regulativa, te se u tom smislu predlažu mogući pristupi za razjašnjenje pravnog statuta terapeutskog kloniranja u RH.
Salmonella Typhimurium glavni je gastrointestinalni patogen koji je globalna prijetnja ljudskome zdravlju. Javnozdravstveni problemi povezani s ovim organizmom povećali su se do te mjere da je postao ...glavno pitanje na koje se traže brojni odgovori. Bakterija postaje otporna na najčešće dostupne antibiotike, a ograničavajuća uporaba cjepiva povezana je s kratkotrajnim imunitetom. Zbog toga postoji hitna potreba za razvoj učinkovitog cjepiva. Vanjske bjelančevine membrane (engl. Outer membrane proteins, Omps) salmonele dokazale su svoju sposobnost kandidata za razvoj cjepiva koje bi se koristilo u prevenciji salmoneloze. S tim je ciljem u ovom radu, pod uvjetima IPTG indukcijskog sustava, provedeno umnažanje i kloniranje te provjerena izražajnost gena za Omp28 iz Salmonelle Typhimurium. Tako dobivena rekombinantna bjelančevina pročišćena je i testirana s obzirom na antigenu sposobnost. Antigena sposobnost pročišćene bjelančevine potvrđena je uporabom Western blot metode s antiserumom protiv Omps-a iz S. Typhimurium dobivenim od zeca. Genom Omp28 umnožen je kao 330bp produkt. Bjelančevina je imala približno 28 kDa i Western blot analizom pokazala je izraženost jakog signala. Ovim je istraživanjem zaključeno da Omp28 može poslužiti kao učinkoviti kandidat za razvoj r-DNA cjepiva protiv salmoneloze.
Paraflagelarni štapić glavna je strukturna komponenta tripanosomskog biča i dio je kompleksa filamenaza koji teku paralelno s aksonemom duž biča. Istraživanje je provedeno kako bi se ispitalo ...postojanje paraflagelarnog gena Rod 2 (PFR2) u bičaša Trypanosoma evansi koji invadira goveda u Indiji. Lokalni izolat T. evansi prikupljen od prirodno invadiranih krava umnožen je u Wistar štakora. Komplementarna DNA (cDNA) sintetizirana je iz RNA obrnutom transkripcijom iz stanica neinvadiranih nositelja T. evansi parazita. Pročišćeni PCR produkt (gen PFR2 bičaša T. evansi) kloniran je u vektorski sustav pTZ57R/T. Nukleotidna sekvencija gena PFR2 bičaša T. evansi, izolat S.V.V.U. (pristupni broj KT277497) dobivena u ovom istraživanju pokazala je 100 %-tnu sličnost s izolatom T. evansi China i 99 %-tnu s izolatom T. evansi Izatnagar i Bikaner. Rekombinantni protein ponovno je kloniran u sustavu pET 32a i prikazan u sustavu BL21 (DE3) pLysS. Gen PFR2 bičaša T. evansi, izolat S.V.V.U. dalje je karakteriziran određivanjem proteinskog profila metodama SDS-PAGE i Western blotting. Indirektni test ELISA optimiziran je za dokaz titra specifičnih protutijela za rekombinantni protein gena PFR2 bičaša T. evansi. U kinetoplastida gen PFR2 izrazito je očuvan. Stoga bi se gen PFR2 mogao upotrijebiti za cjepivo te kao dijagnostički antigen.
U ovom clanku autor analizira razlicite metode kloniranja, a
osobiti naglasak stavlja na terapeutsko kloniranje covjeka i s time
povezano manipuliranje s embrionalnim maticnim stanicama.
U prvom ...poglavlju elaboriraju se znanstveni aspekti kloniranja,
s naglaskom na kloniranje covjeka, kao i probleme s kojima je
kloniranje povezano.
U drugom poglavlju rijec je o terapeutskom kloniranju i
manipuliranju embrionalnim maticnim stanicama covjeka.
U trecem poglavlju autor analizira eticke aspekte terapeutskoga
kloniranja te manipuliranja embrionalnim maticnim stanicama
(EMS). Autor iznosi glavne eticke probleme koji proizlaze iz novih
tehnologija, te nudi odgovore koji proizlaze iz pomnog promatranja
ljudskog subjekta od trenutka njegova zaceca. Moralno je
nedopustivo za dobivanje EMS služiti se živim ljudskim embrijima
jer je svaki ljudski embrij, od trenutka spajanja ljudskih spolnih
gameta, ljudski subjekt. Kao ljudski individuum, on ima pravo na
vlastiti život. Stoga je va$enje unutarnje stanicne mase blastociste,
koja teško oštecuje ljudski embrij time što prekida njegov razvoj,
teško nemoralan i potpuno nedopušten cin. Iz tog proizlazi da
svaka vrsta terapeutskog kloniranja koja ukljucuje proizvodnju
ljudskih embrija kao i njihovo uništavanje, kako bi se dobile
embrionalne maticne stanice, eticki nije dopuštena. Dakle, nijedna
svrha, ma kako dobronamjerna bila, ne može opravdati zahvat kao
što je upotreba embrionalnih maticnih stanica u terapeutske svrhe.
Naime, nikakva dobra svrha ne opravdava loša sredstva.
Autor naglašava da mogucnost korištenja odraslih maticnih
stanica u istu svrhu kao i EMS stoji kao cinjenica, premda su
potrebni još mnogi koraci na oba podrucja prije negoli se budu
mogli vidjeti jasni i sigurni rezultati. Ova mogucnost pokazuje
najrazumniji i najcovjecniji put kojim treba ici ako se želi postici
istinski napredak na ovom podrucju.
Neposredni povod za nastanak ovog članka je vijest o navodnom rođenju »prvog ljudskog klona«, koju su krajem 2002. godine pustili u eter raelijanci ili pripadnici najbrojnije »UFO religije« u ...svijetu. Daljnji povod je činjenica da se tema kloniranja čovjeka već dugi niz godina provlači kroz stručnu biomedicinsku i bioetičku literaturu te kroz raznovrsne medijske rasprave. U svemu tome se uočavaju mnoge nejasnoće glede tumačenja i razumijevanja biomedicinskih danosti povezanih s kloniranjem, osobito u javnom diskursu. Zbog toga članak ide za tim da ukloni nejasnoće u svrhu kasnijih (II. i III. dio) što jasnijih i britkijih vrijednosnih određenja prema biomedicinskom fenomenu kloniranja čovjeka. U tu svrhu detaljno se opisuju povijesni pomaci u razvoju raznih tehnika kloniranja te se analiziraju sve relevantne biomedicinske danosti koje stavljaju na uvid pravu narav pojedinih tehnika i metoda kloniranja. Budući da svako iznošenje biomedicinskih danosti uključuje određenu interpretaciju koja proizlazi iz načina osobnog razumijevanja stvari, prethodno valja upozoriti na postojanje nekih nužnih i neminovnih vrijednosnih, to jest, ne-biomedicinskih prosudbi i konstatacija. No, one nisu tu ni zbog toga da bi umanjile vrijednost biomedicinskim danostima ni zbog nepažnje glede jasnog razlikovanja između činjenica i vrijednosnih sudova, nego su tu zbog neizbježnog vrednovanja što se javlja, htjeli ne htjeli, u svakoj interpretaciji. Naime, svaka interpretacija je svojevrsno vrednovanje. To ne znači da se u članku činjenice svode na vrijednosti ili vrijednosti na činjenice, nego da je ponekad neizbježno postavljanje problema ili pitanja na način koji jasno aludira na vrijednosni sud, a koji po svojoj prirodi ne spada na biomedicinu, nego na etiku. Usprkos tim poteškoćama, u članku se nastoji razumljivo i dokumentirano iznositi neke važne biomedicinske danosti, nastojeći pritom što je moguće sustavnije posredovati ono bitno i relevantno za kasnije što bolje razumijevanje etičke prosudbe pojedinih metoda i tehnika kloniranja čovjeka.
PDF
