La régulation de l’expression des gènes a soulevé de nombreux espoirs pour la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il en est ainsi des petits ARN interférents (ARNi) capables de moduler ...l’expression d’un grand nombre de gènes. Cependant, malgré leur potentiel, les ARNi sont peu stables dans les fluides biologiques. De plus, ces molécules hydrophiles et chargées négativement doivent être chimiquement modifiées ou vectorisées pour pouvoir pénétrer au sein des cellules cibles et atteindre le cytoplasme afin d’induire l’inhibition génique. Des modifications chimiques ont été apportées aux structures de base des ARNi qui, malheureusement, favorisent les effets hors cible. Des conjugués lipidiques adressés vers le foie ou encore des nanotechnologies lipidiques à tropisme hépatique sont les plus avancés en clinique. La présente revue se concentre sur ces différentes stratégies et met en relief des approches nouvelles et prospectives pour adresser les ARNi vers d’autres tissus de l’organisme que le foie.
The regulation of gene expression has raised many hopes for the discovery of new therapeutic strategies. This is the case of small interfering RNA (siRNA) that can modulate the expression of various genes. However, despite their potential, siRNA are unstable in biological fluids. Moreover, due to their hydrophilicity and overall negative charge, these molecules must be chemically modified or addressed by nanotechnologies to be able to penetrate target cells and reach the cytoplasm to induce gene inhibition. Chemical modifications have been made to the basic structure of siRNA, which have unfortunately been accompanied by off-target effects. Lipid conjugates addressed to the liver or lipid nanotechnology with liver affinity are the most advanced systems in the clinic. This review focuses on these different strategies and highlights new and prospective approaches to address siRNA to other tissues of the body than the liver.
Les antibiotiques ituriniques, produits par Bacillus subtilis, représentent une famille qui comprend l’iturine A, la mycosubtilline, les bacillomycines D, F et Lc. Ce sont des lipopeptides cycliques ...possédant des acides gras β-aminés reliés à un peptide formé par sept acides α-aminés avec une séquence chirale invariable dont la configuration type est LDDLLDL. Ils possèdent tous en commun les trois premiers acides α-aminés incluant le résidu tyrosyl. Ils sont connus essentiellement par leur pouvoir antifongique et ils ont également des propriétés antibactériennes et hémolytiques. Ces propriétés proviennent de leur nature amphiphile qui leur permet d’interagir avec différents constituants membranaires. Les stérols, qui se trouvent dans les membranes plasmiques, constituent le partenaire privilégié d’interaction de ces antibiotiques. Aussi, le groupement phénol du résidu tyrosine des antibiotiques est supposé avoir un rôle important pour la fixation des antibiotiques au niveau de la membrane plasmique. La finalité de cette fixation est souvent la lyse cellulaire. Il existe, au sein de la membrane plasmique, des régions particulières contenant une forte concentration en stérol. Ces microdomaines membranaires diffèrent du reste de la membrane plasmique par leur composition ; ils sont également enrichis en certains lipides et en certaines protéines. Les microdomaines interviennent dans divers processus cellulaires clés, leur perturbation peut donc engendrer de nombreuses conséquences. Du fait de leur composition, ces microdomaines peuvent constituer la cible des activités biologiques des antibiotiques ituriniques. Cette revue a pour but de faire la synthèse des travaux réalisés sur les antibiotiques ituriniques au niveau de leurs activités biologiques en focalisant sur la compréhension de celles-ci à l’échelle moléculaire avec une discussion sur leurs groupements chimiques clés et sur le potentiel des microdomaines membranaires en tant que cible privilégiée pour ces molécules.
Interactions of iturinic antibiotics with plasma membrane. Contribution of biomimetic membranes. Iturinic antibiotics are produced by Bacillus subtilis strains and constitute a family including iturin A, mycosubtilin and bacillomycins D, F and Lc. These are cyclic lipopeptides with β-amino fatty acids linked up to a peptide constituted by seven α-aminoacids with an invariable LDDLLDL chiral sequence. The first three α-aminoacids containing the tyrosyl residue are the same for all members. They are well known for their strong antifungal activities but they also have antibacterial and hemolytic properties. These biological properties are due to their amphiphilic nature, allowing interactions with different membrane components. Sterols found in plasma membranes are the privileged interaction partners of these lipopeptides. Moreover, the tyrosyl residue of the iturinic antibiotics seems to play an important role during their fixation to the plasma membrane, the result of which is often cellular lysis. Within plasma membranes, there are particular regions with a high sterol content. These microdomains have a different composition compared to the rest of the membrane; they are rich in certain lipids and proteins and are involved in many key cellular processes. The perturbation of these microdomains could therefore have an important impact on the cell. Due to their composition, these microdomains may constitute the preferential target of iturin antibiotics. This review aims to summarize the studies relating to the biological activities of iturinic antibiotics. It focuses in particular on the existing knowledge regarding iturin antibiotics at the molecular level and discusses both the key chemical groups of these drugs and the potentiality of microdomains to constitute a target for these molecules.
Les systèmes théranostiques associant des propriétés thérapeutiques et des propriétés d'imagerie sont développés pour permettre le suivi de traitement in vivo. La stratégie que nous proposons dans ...cette thèse est de formuler des liposomes magnétiques thermosensibles chargés en principe actif pour traiter des tumeurs murines superficielles du côlon CT26. Ces nanovecteurs peuvent être accumulés dans les tumeurs par ciblage magnétique et le relargage du principe actif peut être déclenché par HIFU (Ultrasons Focalisés de Haute Intensité). Ces liposomes sont développés par co-encapsulation de nanoparticules de maghémite (?-Fe2O3) et de Combrétastatine A4 Phosphate (CA4P) dans des liposomes thermosensibles. La forte encapsulation des nanoparticules magnétiques dans les Liposomes Ultra-Magnétiques (LUM) permet à la fois le ciblage magnétique et leur suivi in vivo par IRM. Le chauffage par HIFU in vitro à la température de transition des membranes des LUM a permis une amélioration du relargage de la CA4P. La biodistribution des LUM in vivo a été évaluée par IRM dynamique de contraste de susceptibilité avec une résolution temporelle adaptée à la cinétique de capture des nanovecteurs, notamment par le foie. L'efficacité du ciblage magnétique a été démontrée grâce à une nouvelle méthode de traitement de l'histogramme des intensités IRM. Enfin, l'ajustement in vivo des séquences d'HIFU permet le relargage du principe actif. L'efficacité du traitement est ensuite suivie par IRM multiparamétrique anatomique, pondérée T2* de diffusion et de perfusion pour évaluer l'impact sur la fonctionnalité vasculaire et l'évolution tumorale, ainsi que par histologie.
Theranostic systems with imaging and therapeutic properties are developed to monitor treatments in vivo. The strategy we propose here is to design thermosensitive drug-loaded magnetic liposomes to treat superficial colon tumors CT26 on mice. These nanocarriers can be accumulated in the tumor by using a magnetic field gradient and the drug release can be triggered by a local heating induced by HIFU (High Intensity Focused Ultrasounds). They have been developed by co-encapsulation of magnetic nanoparticles and the antitumoral drug CA4P (Combretastatin A-4 Phosphate) in thermosensitive liposomes. The high loading of maghemite (γ-Fe2O3) magnetic nanoparticles enables both magnetic targeting and in vivo monitoring by MRI of this Ultra-Magnetic Liposomes (UML). In vitro HIFU heating at the UML membrane transition temperature improved the drug release. In vivo UML biodistribution was evaluated with dynamic susceptibility contrast imaging adjusted in time acquisition in MRI and the magnetic targeting efficiency was shown with a new MRI imaging processing. Adjustments of in vivo HIFU sequences to locally heat the tumor at the UML transition temperature allowed the triggering of drug release. Treatment efficiency was monitored by multiparametric diffusion, T2* weighted, anatomical and perfusion MRI and histology.
L'incorporation d'ingrédients bioactifs dans les produits alimentaires est en plein essor. Il a été démontré que ces ingrédients possèdents des propriétés biologiques importantes permettant ...l'amélioration de la santé et la prévention des maladies dites de civilisations. Toutefois, l'ajout de ces molécules bioactives est dans la plupart des cas impossible ou insuffisant, du fait que ces composés ne sont que peu solubles dans les systèmes aqueux et présentent i) une stabilité limitée contre les dégradations chimique ou physique, ii) une libération non contrôlée ou une faible biodisponibilité. Face à ces contraintes, les recherches actuelles visent à élaborer des systèmes d'encapsulation efficaces pour résoudre ces problèmes de formulation. Dans notre étude, deux représentants d'ingrédients alimentaires ont été choisi : le sesquiterpène nérolidol (Ner) et le flavonoïde quercétine (Quer) présentant diverses activités biologiques mais des propriétés physicochimiques problématiques. Ainsi, l'objectif de notre travail a été d'encapsuler ces composés actifs dans les cyclodextrines (CDs), les liposomes conventionnels (LCs) et le système mixte cyclodextrine-liposomes (DCLs) afin de développer des systèmes naturels et éco-compatibles ayant des applications potentielles dans les domaines alimentaires.Trois axes ont été abordés. Le premier axe a porté sur la préparation et la caractérisation des complexes d'inclusion CD/invité en solution et à l'état solide. Les techniques de spectroscopie UV-visible, Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP), Carbone Organique Total (TOC), ¹H Résonance magnétique nucléaire (RMN), 2D ROESY RMN et de la modélisation moléculaire ont été utilisées comme outils pour la caractérisation des complexes obtenus. Des études de phase de solubilité ont également été réalisées. Le deuxième axe a porté sur la préparation des LCs et DCLs par la méthode d'injection éthanolique et leur caractérisation. Les préparations des LCs encapsulant la quercétine a été réalisée à partir de phospholides naturels de jaune d'oeuf (Lipoid E80) et de soja insaturés (Lipoid S100) ou saturés (Phospholipon 90H) afin d'étudier l'effet de la composition lipidique que les caractéristiques des liposomes. La formulation optimale a été par la suite appliquée pour préparer des LCs encapsulant le nérolidol et des DCLs encapsulant les deux molécules. Ce dernier est produit par l'incorporation des complexes d'inclusion HP-β-CD/Ner (à différents rapport moléculaire CD:Ner) et SBE-β-CD/Quer dans la cavité aqueuse des liposomes. Le dernier axe a été orienté vers l'évaluation de l'effet de l'encapsulation sur les propriétés physicochimiques du nérolidol et de la quercétine (libération in vitro, photostabilité, stabilité dans les milieux gastro-intestinales, stabilité de stockage) et leur activité antioxydante. Les résultats ont montré que les CSs ont été capables d'encapsuler les composés actifs étudiés, d'augmenter leur solubilité, leur photostabilité ainsi que leur activité antioxydante. En outre, les liposomes à base de Lipoid E80 ont été trouvés majoritairement de taille nanométrique et ont conféré aux molécules une efficacité d'encapsulation (EE) élevée ainsi qu'une meilleure stabilité par rapport aux deux autres types de liposomes. De plus, la taille des DCLs ains que leur EE ont été prouvées dépendante du rapport moléculaire CD:invité. Par rapport aux LCs, les DCLs ont assuré une libération prolongée du nérolidol, ont augmenté la photostabilité des composés et la stabilité de la quercétine dans les milieux biologiques. Les résultats de cette étude suggèrent que ces systèmes peuvent être considérés comme outils prometteurs pour l'optimisation des formulations alimentaires incorporant le nérolidol et/ou la quercétine.
Phytochemicals are widely distributed secondary metabolites, divided into three major classes : terpenoids, flavonoids and alkaloids. They are shown to possess important biological properties such as anti-cancer, anti-inflammatory and anti-microbial properties. Therefore, increasing the use of these bioactive molecules in food products may reduce the risk of widespread diseases referred to as "diseases of civilization". However, their low solubility, susceptibility to degradation and their rapid release reduce their bioavailability in the human body and thus their biological effect. To solve the aforementioned physicochemical drawbacks, encapsulation systems were developed to allow the incorporation of phytochemicals in food. In this study, two food ingredients : the sesquiterpene nerolidol and the flavonol quercetin were selected du to their potent biological activities but their problematic physicochemical properties.Therfore, the aim of this work was to encapsulate these molecules into cyclodextrins (CDs), conventional liposomes (CLs) and the double systeme drug-in-cyclodextrin-in-liposomes (DCLs), in order to develop nztural and biocompatible formulations that may find applications in food fields. This project was built around three main research axes. The first part dealt with the preparation and the characterization of CD/guest inclusion complexes both in solution and in solid state. Characterizations were performed with UV-visible spectroscopy, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Total Oragnic Carbon (TOC), ¹H NMR, 2D ROESY NMR, and molecular modeling. These investigations were complemented with phase solubility studies.The second axis addressed the preparation of CLs ans DCLs by ethanol injection method and characterization of the vesicles. CLs encapsulating quercetin were prepared from three different types of phospholipids (Lipoid E80, Lipoid S100, Phospholipon 90H) in order to study the effect of lipid composition on the characteristics of liposomes. The optimal formulation was then selected to prepare nerolidol loaded-CLs and DCLs encapsulating the two compounds. HP-β-CD/Ner (at different CD:Ner molar ratios) and SBE-β-CD/Quer inclusion complexes were used as the aqueous phase in the DCL system. The last part focused on the effect of encapsulation on the physicochemical properties of nerolidol and quercetin (in vitro release, photostability, stability in gastro-intestinal fluids, storage stability) and their antioxidant activities. Results demonstrated that CDs could successfully encapsulate bioactive compounds, enhance their solubility , photostability and antioxidant activity. Furthermore, Lipoid E80-liposomes were nanometric in size, exhibited a high entrapment efficiency and higher stability in comparison to the other formulations. Moreover, CD:guest molar ratio influenced the size of DCLs and their encapsulation efficiency. When compared to CLs, DCLs extended the release of neridol, enhanced the photostability of both compounds ans increased the stability of quercetin in biological fluids. These results could be considered as a promising tool to achieve an optimized and efficient formulation incorporating nerolidol and quercetin in food industry.
Nous avons optimisé des liposomes thermosensibles, encapsulant un principe actif anticancéreux, le 5-Fluorouracile (5-FU), afin de déclencher sa libération par une hyperthermie locale modérée ...(39-42°C) induite par des ultrasons focalisés. L'hyperthermie sera appliquée au niveau de la tumeur, afin d'améliorer l’efficacité thérapeutique et de réduire la toxicité systémique. Les liposomes ont été formulés par hydratation du film lipidique en mélangeant la 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC) pour sa thermosensibilité à 41,5 ± 0,5°C, le cholestérol (CHOL) pour favoriser la stabilité des liposomes vis-à-vis des composants du sang, et le 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-méthoxy(polyéthylène glycol)-2000 (DSPE-PEG) pour assurer la furtivité de la formulation. Les expériences ont confirmé que les liposomes formulés à base de DPPC/CHOL/DSPE-PEG dans un ratio molaire 90 : 5 : 5 mol% sont thermosensibles. Des liposomes composés du même mélange lipidique dans un rapport 65 : 30 : 5 mol% ont été considérés comme contrôle négatif non thermosensible. L’optimisation de l’encapsulation passive du 5-FU a permis d’obtenir une efficacité d’encapsulation (5-FU encapsulé/5-FU total) de 13%, mais le 5-FU est très faiblement retenu (12%) dans la cavité aqueuse des liposomes du fait du gradient osmotique à la dilution. La rétention du 5-FU a été optimisée (93%) par la technique d’encapsulation active basée sur la complexation intraliposomale du 5-FU avec le complexe cuivre-polyéthylèneimine préalablement encapsulé dans les liposomes. Cette technique a également permis d’améliorer l’efficacité d’encapsulation d’un facteur trois environ (37%), avec un taux de charge (ratio final 5-FU/lipides, mole/mole) de 50% environ. Nous avons alors obtenu des liposomes thermosensibles d'un diamètre hydrodynamique de 65 nm et de charge de surface de -10 mV. Les liposomes non thermosensibles, ont été caractérisés par un diamètre hydrodynamique de 105 nm et une charge de surface de -4,9 mV. La libération du 5-FU déclenchée par une hyperthermie induite par des ultrasons focalisés a été mesurée in vitro. En réponse à une hyperthermie de 42°C, les liposomes thermosensibles libèrent 68% de leur contenu, au bout de 10 min, alors que les liposomes non thermosensibles en libèrent moins de 20%. En outre, la cytotoxicité des liposomes encapsulant le complexe 5-FU-cuivre-polyéthylèneimine a été évaluée vis-à-vis de la lignée cellulaire HT-29 du carcinome colorectal humain. Les résultats ont révélé que les lipides à une concentration de 800 µM ne sont pas cytotoxiques (80% de viabilité). De plus, la complexation du 5-FU n’influence pas sa cytotoxicité ce qui prouve que la toxicité provient du 5-FU et non des excipients. En revanche, l’encapsulation du complexe 5-FU-cuivre-polyéthylèneimine dans les liposomes induit une diminution de la concentration inhibitrice médiane de 115 (solution du complexe) à 49 µM environ, corrélée à leur internalisation cellulaire. La pharmacocinétique chez des souris porteuses d’un modèle de tumeur colorectale HT-29 xénogreffée a montré que les liposomes permettent de prolonger d’un facteur 1,4 la demi-vie plasmatique de distribution du 5-FU. De plus, les aires sous la courbe des concentrations plasmatiques sur 24 h sont 1,9 et 2,9 fois plus élevées lorsque le 5-FU est administré sous forme de liposomes thermosensibles et non thermosensibles, respectivement, par rapport à la solution de 5-FU. Enfin, les liposomes non thermosensibles augmentent significativement d'un facteur 2 l'accumulation du 5-FU dans la tumeur par rapport à la solution de 5-FU. En conclusion, les liposomes thermosensibles développés présentent un fort intérêt pour une application thérapeutique en combinaison avec des ultrasons focalisés.
We optimized thermosensitive liposomes encapsulating an anticancer drug, 5-Fluorouracil (5-FU), in order to trigger the release upon focused ultrasound-mediated mild hyperthermia at the tumor. This approach would improve drug efficacy and would lower side effects. Liposomes were prepared by the lipid hydration method by mixing 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) for its temperature sensitivity at 41.5 ± 0.5°C, cholesterol (CHOL) to promote liposome stability towards blood components, and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxy(polyethylene glycol)-2000 (DSPE-PEG) to confer stealthiness to the formulation. The experiments confirmed that the liposomes formulated with DPPC/CHOL/DSPE-PEG in a molar ratio 90:5:5 mol% are thermosensitive, while liposomes composed of the same lipid mixture in a ratio 65:30:5 mol% were considered non thermosensitive negative control. The optimization of passive encapsulation of 5-FU yielded an encapsulation efficacy (encapsulated 5-FU/total 5-FU) of 13%. 5-FU was, however, very weakly retained (12%) in the aqueous core of liposomes following dilution due to the generation of an osmotic gradient. The retention of 5-FU has been optimized (93%) by the active encapsulation technique based on the intraliposomal complexation of 5FU with copper-polyethylenimine complex encapsulated beforehand into liposomes. This technique also improved 5-FU encapsulation efficacy by 3-fold (37%), yielding a loading efficiency (final drug/lipid ratio, mol/mol) of approximately 50%. The resulting thermosensitive liposomes and non thermosensitive liposomes have a hydrodynamic diameter and a surface charge around 65 nm and -10 mV, and 105 nm and -4.9 mV, respectively. Heat-triggered drug delivery was evaluated using focused ultrasound, and showed a release of 68% of the encapsulated 5-FU from thermosensitive liposomes, within 10 min, whereas release remained below 20% for the non thermosensitive formulation. Furthermore, the cytotoxicity of 5-FU-copper-polyethylenimine complex-loaded liposomes towards HT-29 human colorectal carcinoma cell line was evaluated. Results revealed that lipids at a concentration of 800 µM are not cytotoxic (80% viability). Moreover, 5-FU complexation has no impact on its cytotoxic activity, disclosing that liposomes toxicity arose from 5-FU and not from the excipients. Nevertheless, 5-FU-copper-polyethylenimine complex-loaded liposomes exhibited a lower half maximal inhibitory concentration of 49 µM compared to 115 µM for complex solution. This enhancement of cytotoxicity was attributed to the cellular internalization of liposomes. Pharmacokinetics in mice bearing HT-29 xenograft tumor showed that liposomes can extend the plasma distribution half-life of 5-FU by a factor 1.4. Furthermore, areas under the concentration-time curve over 24 h were higher by 1.9- and 2.9-fold when the drug was encapsulated into thermosensitive and non thermosensitive liposomes, respectively, compared to free 5-Fluorouracil. Finally, non thermosensitive liposomes significantly increased 5-FU accumulation in tumor by 2-fold, compared to 5-FU solution. In conclusion, these 5-FU-loaded thermosensitive liposomes represent valuable carriers to investigate the therapeutic efficacy following focused ultrasound-mediated heat application.
La métalloenzyme multimérique membranaire NADPH oxydase du neutrophile (NOX2), est impliquée dans plusieurs fonctions physiologiques vitales incluant la réponse immunitaire, en contribuant fortement ...à la destruction des pathogènes ou autres envahisseurs du corps humain. Les fonctions physiologiques de NOX2 sont assurées par sa fonction chimique de catalyseur de la production d’anions superoxyde via la réduction monoélectronique du dioxygène à une face de la membrane, simultanément à l’oxydation biélectronique du NADPH à l’autre face de la membrane. L’étude des caractéristiques biochimiques de l’enzyme entière, incluant ses mécanismes d’activation et de régulation, en lien avec l’assemblage macromoléculaire, est réalisée in vitro en utilisant des fractions membranaires de neutrophile (FM), petites vésicules contenant NOX2, ainsi que les protéines cytosoliques recombinantes (p67phox, p47phox et Rac1/2) indispensables à sa fonction, en présence d’une molécule activatrice comme l’acide arachidonique (AA), un acide gras. La technique historiquement privilégiée de mesure de l’activité enzymatique de NOX2 implique la détection des anions superoxyde par une sonde protéique, le Cytochrome c (Cytc). Dans ce système, les anions superoxyde, dont la production est catalysée par NOX2 vers l’intérieur des vésicules de FM, sont détectés à l’extérieur. En corrélation avec la littérature, ces recherches montrent que l’activité enzymatique déterminée via la détection des anions superoxyde par le Cytc est plus faible que lorsqu’elle est déterminée via la mesure de la consommation du NADPH. L’origine du problème inclut potentiellement des contraintes de perméabilité membranaire, de structure de la membrane et des protéines, d’interactions des protéines entre-elles et avec les lipides membranaires, de pertinence de la sonde utilisée et de réactions secondaires. Ces hypothèses ont été testées par différents moyens incluant notamment des mesures de cinétiques globales et de l’activité de NOX2 dans différentes conditions et avec différentes observables (NADPH, Cytc, dioxygène), en présence de détergent ou d’ionophore, en faisant varier la température de mesure, la concentration en Cytc, la concentration en substrat, la concentration en AA ou le temps de préincubation. La présence de réactions secondaires a également été testée par électrochimie. Cette étude montre que la mesure de la production des anions superoxyde est limitée par la perméabilité membranaire et par les réactions secondaires. Il a aussi été mis en exergue que la concentration en Cytc usuelle pour ces mesures n’est pas saturante et de façon inattendue que les FM catalysent intrinsèquement la dismutation du peroxyde d’hydrogène à l’aide d’un composant thermolabile. Il est aujourd’hui très compliqué de mesurer de façon concomitante l’activité de la NADPH oxydase et son assemblage. Le deuxième objectif de cette thèse était donc la mise au point de vésicules géantes unilamellaires (GUV) intégrant NOX2 dans leur membrane, ce qui permettrait d’observer par microscopie de fluorescence l’assemblage du complexe NADPH oxydase et de simultanément mesurer la production des anions superoxyde par électrochimie sous microscope. La formation de GUV possédant des FM (FM-GUV) à leur membrane est un succès mais sans confirmation de l’intégration de NOX2 à la membrane des GUV. L’assemblage des protéines cytosoliques à la face externe de la membrane a été étudié sur GUV et sur FM-GUV, ce qui a permis de montrer que l’ancrage membranaire de ces protéines est possible seulement en présence d’AA et dû de façon prépondérante aux lipides et que NOX2 joue un rôle minoritaire. L’étude des interactions entre les protéines cytosoliques et la face interne de la membrane des GUV reste à optimiser. Il a été possible de détecter en GUV qualitativement une activité de NOX2 par électrochimie et par fluorescence (Amplex-Red), mais ce point reste aussi à optimiser.
The membrane multimeric metalloenzyme NADPH oxidase (NOX2) from neutrophil is implied in several essential physiological functions including the immune response, by strongly contributing to the destruction of pathogens or other invaders of the human body. Physiological functions of NOX2 are fulfilled by its chemical function of catalyst of superoxide anion production via the monoelectron dioxygen reduction on one face of the membrane, simultaneously to the NADPH bielectron oxidation on the other face of the membrane. Studies of biochemical features of the whole enzyme, including its activation and regulation mechanisms linked to the macromolecular assembly, is done in vitro by using neutrophil membrane fractions (MF), which are small vesicles containing NOX2, and by using the recombinant cytosolic proteins (p67phox, p47phox, p40phox and Rac1/2) essential for its function, in presence of an activator molecule such as arachidonic acid (AA), a fatty acid. The historical technics to measure the NOX2 enzyme activity is the superoxide anion detection by a protein probe, the Cytochrome c (Cytc). In this system, NOX2 catalyses the production of superoxyde anions towards the inside of MF vesicles and the superoxide anions are detected outside. In correlation with literature, the present research shows that the enzyme activity determined via the detection of superoxide anions by the Cytc is lower that the activity determined from NADPH consumption measurement. The source of the problem includes potentially constraints of membrane permeability, of membrane and protein structure, of protein-protein and protein-membrane interactions, of the relevance of the probe and of secondary reactions. These hypotheses have been tested by various means including notably global kinetics measurements and NOX2 activity measurements in various conditions with three different observables (NADPH, Cytc, dioxygen), in presence of detergent or ionophore, by varying temperature, Cytc concentration, substrate concentration, AA concentration or still preincubation time. Secondary reactions existence has also been probed by electrochemistry. This study shows that the measurement of the superoxide anion production is limited by membrane permeability and secondary reactions and that the usual Cytc concentration is non-saturating, and unexpectedly that the MF catalyses the disproportionation of hydrogen peroxide by a thermolabile component. It is currently very hard to measure simultaneously the NADPH oxidase activity and the assembly of the whole complex. The second objective of my thesis was consequently to develop giant unilamellar vesicles (GUV) with NOX2 integrated into their membranes. This to be able to observe the complex assembly by fluorescence microscopy and simultaneously to measure the superoxide anion production by electrochemistry under microscope. The development of GUV with MF at the membrane (MF-GUV) has been successful, but without confirmation of NOX2 integration in the GUV membrane. The assembly of cytosolic proteins on the external face of the membrane was studied on GUV and on MF-GUV, leading to the discovery that membrane anchor of these proteins is possible only in presence of AA and is mostly due to lipids, NOX2 playing a minor role. Study of interactions between cytosolic proteins and internal face of the GUV membrane must be optimised. It was possible in GUV to detect qualitatively NOX2 activity by electrochemistry and by fluorescence, (Amplex-Red), but this point should still be optimised.
Amaç: Çalışmamızda, antioksidan moleküllerin değişik lipozom hazırlama yöntemleri ile lipozomlanması ve lipozom yapısında iken aktivitelerini koruyup korumadıklarının incelenmesi amaçlanmıştır. ...Ayrıca, lipozom elde etme yöntemleri karşılaştırılarak suda ve yağda çözünen antioksidanların lipozomlanması için en uygun yöntemin belirlenmesi hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntemler: İnce-tabaka, dondurma-çözme, ters-faz buharlaştırma ve sonikasyon yöntemleriyle lipozom eldesi yapıldıktan sonra bu yöntemler antioksidan moleküllere uygulandı ve elde edilen sonuçlar antioksidan aktivite açısından karşılaştırıldı. Hazırlanan lipozomların karakterizasyonunda ışık mikroskobu, floresan mikroskop ve parçacık boyut analizöründen yararlanıldı ve lipozomların büyüklük, dağılım ve şekilleri incelendi. Bulgular: Suda çözünür antioksidanlardan C vitamini ile polifenol ekstresi ve yağda çözünür özellikteki E vitamini değişik yöntemlerle lipozomlandı. Lipozomlanmış ve lipozomlanmamış moleküllerin ayrımı Sephadex G-25 kolon kromatografisi ile gerçekleştirildi. Elde edilen lipozomların antioksidan aktiviteleri karşılaştırıldığında aşamalı sonikasyon yöntemiyle elde edilen E vitaminli lipozomların en yüksek aktiviteye sahip olduğu bulundu. Sonuç: Çalışmamızda kullandığımız yöntemlerden sonikasyon yöntemi en uygun yöntem olarak değerlendirildi. Bu yöntemin diğer yöntemlere göre avantajları kısa sürede sonuçlanması ve organik çözücü gerektirmemesi olarak değerlendirildi. Sonikasyon yöntemi ile hem suda çözünen hem de yağda çözünen antioksidanların lipozomlanabildiği ve antioksidanların lipozom yapısında aktivitelerini korudukları gösterildi.
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