A la recherche d’innovations, l’industrie cosmétique est constamment en quête de nouvelles matières premières. Les ingrédients naturels sont particulièrement en vogue. Ces travaux de thèse ont ...poursuivis trois objectifs. Tout d’abord, une étude a permis d’évaluer l’impact des formulations cosmétiques sur les développements microbiens. En second lieu, le développement d’un ingrédient antimicrobien naturel pour les cosmétiques a été engagé dans le cadre d’un projet collaboratif : Natubaval. Un extrait végétal a tout particulièrement été étudié. Il a été optimisé pour une incorporation en formulation simplifiée. L’activité antimicrobienne de l’extrait optimisé a été validée grâce au challenge test. Ayant noté que l’un des métabolites contenus dans l’extrait antimicrobien participant fortement à l’activité pouvait présenter une instabilité dans certaines circonstances. De plus, les conservateurs naturels sont connus pour présenter une activité moins durable que ceux issus de la synthèse. Nous avons donc développé un système d’encapsulation et vectorisation d’actifs naturels. Les extraits végétaux étant des mélanges très complexes, il nous à paru judicieux, dans un premier temps, de développer le modèle d’encapsulation à partir de deux analytes modèles : la rutine et la naringénine. Un système vésiculaire a été développé et optimisé. Des mesures granulométriques, des rendements d’encapsulation et d’adsorption, une cinétique de fuite, un test d’activité biologique et des essais d’incorporations en formulations cosmétiques ont été réalisés pour valider le modèle. Une fois développé, Celui-ci a été appliqué avec succès à l’extrait végétal antimicrobien.
Looking for innovation, cosmetic industry used even more new materials. Natural products are specially used. Our study evaluated the impact of cosmetic formulations on microbial developments. Then, a natural antimicrobial ingredient for cosmetics was developed. One vegetal extract was particulary studied. It was optimized for an easy introduction in cosmetic products. Antimicrobial activity of the natural extract was confirmed with challenge test. As some metabolites of the interesting extract could be instable in specific conditions and as natural preservatives are often less actives than the synthetics ones, an encapsulated system was developed. Vegetal extracts are complex mix of differents molecules. that is why, the encapsulated system was first developed with the standards: rutin and naringenin. A multilamellar vesicles system was developed and optimized. Particles sizes, encapsulation and adsorption yields, leak kinetik, biological test of activity and cosmetic incorporation were done to validate the model. Finally, the encapsulated system was applied with success for the encapsulation of the natural extract.
Un nouveau modèle de biomembrane de type liposome a été développé à partir de lipides synthétisés comportant une unité biphényle sur leur chaînes sn2 et une chaîne aliphatique sn1 de longueur et ...insaturation variables. L’anisotropie de susceptibilité magnétique positive de ces molécules induit une déformation en oblate de ces liposomes dits « biphényles » dans le champ magnétique B0. Cette déformation spécifique a été caractérisée par RMN des solides 31P et 2H en faisant varier différents paramètres : l’intensité de B0, l'élasticité membranaire, la température et la taille des liposomes (Helfrich, 1973). Ces vésicules déformées ont pu être observées par microscopies optiques et électroniques et la rémanence de la déformation en dehors de B0 a pu être analysée par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS). Enfin, les premières applications des liposomes biphényles comme nouveau modèle de biomembrane pour analyser la structure et l’orientation (par RMN des solides 15N) de peptides ou protéines membranaires, ont été étudiées.
A new model of biomembrane (liposome) was developed from synthesized lipids containing a biphenyl unit on the sn2 aliphatic chain and possessing a sn1 aliphatic chain which varies in length and unsaturation. The positive magnetic susceptibility anisotropy of these molecules induces an oblate deformation of these «biphenyls » liposomes under the magnetic field B0. This particular deformation has been characterized by 31P and 2H solid state NMR by varying different parameters: the intensity of B0, the membrane elasticity, the temperature and the size of the liposomes (Helfrich, 1973). These deformed vesicles were observed by optical and electron microscopy and the remanence of the deformation outside B0 has been analyzed by Small angles X-ray scattering (SAXS).Finally, the first applications of biphenyls liposomes as new biomembrane model to analyze the structure and orientation of membrane proteins or peptides were studied by 15N solid state NMR
Les triterpènes sont un groupe important et structurellement diversifié de produits naturels issus du squalène. Les progestatifs et les glucocorticoïdes sont des triterpènes oxygénés ayant un ...squelette tétracyclique et reconnus pour leurs diverses propriétés thérapeutiques. Par ailleurs, l'érythrodiol et l'uvaol sont des triterpènes pentacycliques reconnus pour leurs effets bénéfiques dans l'alimentation humaine. Dans ce travail, l'interaction avec les membranes des vésicules lipidiques et la liaison à la sérum albumine humaine de ces molécules sont étudiées dans le but de mieux comprendre leurs propriétés pharmacologiques. Les vésicules lipidiques ont été caractérisées par DSC, spectroscopie Raman, FTIR et polarisation de fluorescence du DPH pour comprendre l'effet des molécules sélectionnées sur la fluidité membranaire.Également, nous avons étudié la liaison du cholestérol, d'une série de progestatifs et de glucocorticoïdes à l'albumine humaine par la spectroscopie de fluorescence.Les résultats ont démontré que les progestatifs, les glucocorticoïdes, l'érythrodiol et l'uvaol altèrent les propriétés physiques de la bicouche lipidique.Les progestatifs et les glucocorticoïdes démontrent un attachement modéré à l'albumine. Par ailleurs, la dydrogestérone présente la constante de liaison la plus importante. Enfin, notre étude a démontré que la constante de liaison du cholestérol à l'albumine est faible en comparaison avec les autres molécules étudiées. Notre étude a conduit à une connaissance approfondie des mécanismes moléculaires et des caractéristiques structurales impliqués dans l'interaction des triterpènes avec les protéines et les membranes synthétiques
The triterpenoids are a large and structurally diverse group of natural products derived from squalene. Progesterone derivatives and glucocorticoids are a group of oxygenated triterpenes having a tetracyclic skeleton and identified for their therapeutic properties. Whereas, erythrodiol and uvaol are pentacyclic triterpenes, known for their beneficial effects on human diet. In this thesis, we studied their interaction with the membranes of lipid vesicles and with human serum albumin to better understand their pharmacological properties. DSC, Raman spectroscopy, FTIR and fluorescence polarization of DPH were used to investigate the effect of triterpenes on the membrane fluidity. Besides, we used fluorescence spectroscopy to study the binding of cholesterol, a series of progesterone derivatives and another series of glucocorticoids to albumin. The results revealed that progesterone derivatives, glucocorticoids, erythrodiol and uvaol changed the physical properties of the bilayers. Progesterone derivatives and glucocorticoids have been proven to bind moderately to albumin. Dydrogesterone showed the highest binding constant. Finally, our study demonstrated that cholesterol exhibited a much weaker interaction with albumin compared to progesterone derivatives and glucocorticoids.Our work has led to a better understanding of triterpenes molecular mechanisms of their interaction with proteins and biological membranes and structural features controlling these interactions
Les liposomes, vésicules à base de phospholipides, sont des systèmes colloïdaux utilisés en recherche et dans différents domaines industriels (pharmaceutique, cosmétique, nutrition). Néanmoins, leur ...développement se heurte au manque de diversité des sources de phospholipides (soja et jaune d’oeuf). Parallèlement, les méthodes industrielles d’extraction des phospholipides sont basées essentiellement sur l’utilisation de solvants organiques. Dans ce contexte, mon sujet de thèse a eu pour but d’étudier l’extraction de PL, par le CO2 supercritique, à partir de différentes sources avec comme objectif final la formulation de ces PL en liposomes. La démarche a consisté à explorer différents sous-produits de l’huilerie (tourteau d’oléagineux) et de la pêche (sous-produit de la coquille Saint Jacques), potentiellement riches en phospholipides, puis à mettre en place différentes techniques analytiques pour discriminer et quantifier les types de lipides. Parallèlement, l’influence de différents paramètres de l’extraction par CO2 supercritique sur la pureté des fractions obtenues est abordée ainsi qu’une première approche de formulation de PL en liposomes et la caractérisation de ces vésicules.
Liposomes, phospholipids vesicles, are colloidal systems used in search and different industrial fields (pharmaceutical, cosmetic, nutrition). Nevertheless their development face lack of phospholipid sources (soya and egg yolk). At the same time, industrial methods to extract phospholipids use organic solvents. In this context, the phospholipid extraction were studied using a green technology from new different sources in order to formulate liposomes. Oil mill and fishery by-products (seed cake and scallop) were studied to know phospholipid quantities. Analytical techniques were established to discriminate and quantify lipid types. Simultaneously, varying the operating conditions of CO2 supercritical extraction allowed obtaining extracts with different purities and contents in phospholipids and a first study of liposome formulation was carried out.
Avec l’identification des antigènes tumoraux et la compréhension de la réponse immunitaire mucosale, la vaccination par voie respiratoire est devenue un champ d’investigation prometteur pour le ...traitement du cancer. L’objectif de cette thèse était de concevoir des vaccins peptidiques nanoparticulaires à base de liposomes, destinés à la vaccination antitumorale par voie respiratoire ou nasale. Ainsi, nous avons formulé des liposomes vectorisant un épitope peptidique TCD8+ dérivé de l’oncogène ErbB2, un épitope TCD4+ et une molécule adjuvante. Cette construction a ensuite été optimisée en faisant varier les caractéristiques physicochimiques du vecteur liposomique (taille, structure, composition) ou de la formulation (viscosité). L’efficacité antitumorale des différents vaccins ainsi obtenus a été évaluée après administration respiratoire ou nasale, prophylactique ou thérapeutique, dans un modèle de tumeurs pulmonaires ou de tumeurs sous-cutanées chez la souris. L’ensemble de ces travaux a montré un intérêt indéniable des vaccins peptidiques à base de liposomes dans la vaccination antitumorale par voie respiratoire et nasale, ouvrant de nouvelles perspectives pour le traitement du cancer.
With the identification of tumor antigens and the better understanding of the mucosal immune response, the vaccination by the respiratory route has become a promising field of investigation for cancer treatment. The purpose of this study was to develop nanoparticulate peptide-based liposomal vaccines for antitumor vaccination by respiratory or nasal route. Thus, we have prepared liposomes associating ErbB2 TCD8+ and HA TCD4+ peptide epitopes with an adjuvant molecule. This construct was then optimized by varying its physicochemical characteristics (size, structure, composition) or its formulation (viscosity). The antitumor efficacy of the various vaccines obtained thereby was evaluated in a model of pulmonary or subcutaneous tumors in mice after prophylactic or therapeutic, nasal or respiratory immunization. All our data showed an undeniable interest of peptide vaccines based on liposomes in the antitumor vaccination by the respiratory and nasal routes, opening new perspectives for cancer treatment.
Cette thèse est une étude théorique et expérimentale sur la formation de liposomes par des procédés utilisant le dioxyde de carbone (CO2) supercritique. Les liposomes sont des vésicules sphériques ...nano- ou micrométriques dont la paroi est composée d’une ou plusieurs bicouches concentriques de phospholipides séparant un milieu aqueux d’un autre. L’efficacité des procédés supercritiques, comme alternative aux méthodes conventionnelles pour former des liposomes, a déjà été démontrée. Une synthèse critique des résultats de la littérature a été réalisée au cours de ce travail. Parallèlement, une étude fondamentale sur le comportement des systèmes ternaires CO2/eau/surfactant sous pression a été menée et il a été démontré qu’en fonction du type d’émulsions formées au cours du procédé sous pression, les caractéristiques des liposomes produits lors de la dépressurisation sont différentes. Le procédé Supercritical Anti-Solvent a été utilisé pour microniser des phospholipides. Des liposomes sphériques, multilamellaires et de tailles comprises entre 0,1 et 1µm ont ensuite été formés de manière reproductible par hydratation des phospholipides micronisés. Dans les mêmes conditions (même solvant), la méthode conventionnelle de Bangham n’a pas donné des résultats reproductibles et les liposomes formés n’étaient pas tous sphériques. Le résultat majeur de ce travail est la mise au point d’un procédé supercritique innovant. Innovant car continu et en une seule étape, le procédé Continuous Anti-Solvent permet de former de manière reproductible des liposomes sphériques, multilamellaires et de tailles comprises entre 10 et 100µm.
The present thesis is dedicated to liposome formation using supercritical carbon dioxide (CO2). Liposomes are spherical vesicles composed of one or more concentric phospholipid bilayers surrounding an aqueous core. Dense gas processes offer reliable alternatives to conventional methods in liposome formation. We present a review of the literature and we summarized all of the results in a discussion section, with particular attention to emulsion formation under pressure. As it has been shown, the phase behaviour of the ternary CO2/water/surfactant system under pressure greatly influences liposome formation during depressurization. The Supercritical Anti-Solvent process has been used to micronized phospholipids. Then, the micronized particles were hydrated to form spherical and multilamellar liposomes with diameters between 0.1 and 1µm in a reproducible way. Using the same conditions (the same solvent), the conventional Bangham method did not provide reproducible assay results and formed liposomes were not all spherical. The main result of this work is the design of a new supercritical process dedicated to liposome formation. Unlike the current dense gas technologies, the Continuous Anti-Solvent method breaks new ground because it is a single step and continuous process. Liposomes prepared with the Continuous Anti-Solvent method are spherical and multilamellar with diameters between 10 and 100µm.
Ce sujet se situe dans le cadre de la mise au point de systèmes de délivrance de composés thérapeutiques ou d’imagerie, c’est à dire d’objets qui doivent transporter des composés dans un organisme et ...posséder une spécificité pour une zone à traiter ou à imager. Les objectifs de mon travail de thèse étaient l’addition d’une spécificité aux liposomes grâce à la liaison ou l’utilisation de protéines dérivées de l’Annexine 5 (Anx5) et l’encapsulation dans l’espace interne des vésicules de composés permettant le suivi de ces vecteurs. Nous avons tout d’abord mis au point des liposomes pour lesquels l’Anx5 est couplée à l’extrémité d’un lipide-PEG et sert d’élément d’adressage vers des cellules en apoptose. La liaison Anx5 / lipide-PEG a été caractérisée par SDS-PAGE de façon à contrôler la densité de ligand en surface des vésicules. L’influence de cette densité de ligand sur l’efficacité de liaison des vecteurs à des membranes cibles et sur l’agrégation des vésicules a été évaluée par QCM-D et DLS. Il apparait qu’une densité de 60 Anx5 / liposome est un optimum vis-à-vis de ces facteurs. Enfin l’encapsulation de fluorophores a permis d’imager l’interaction des liposomes-Anx5 avec des cellules en apoptose. Pour former des magnétoliposomes nous avons mis au point et caractérisé l’encapsulation de particules d’oxyde de fer dans des liposomes neutres et anioniques. La procédure d’encapsulation passive ainsi que l’influence de la charge membranaire négative et la stabilité des magnétoliposomes ont été évaluées. Le nombre de particules d’oxyde de fer par vésicule a été déterminé par dosages et l’aspect des liposomes a été examiné par cryomicroscopie électronique à transmission. Un maximum d’environ 50 particules par liposome a été encapsulé dans des vésicules de 100nm de diamètre. La présence de lipides anioniques limite l’efficacité d’encapsulation et favorise la déstabilisation des magnétoliposomes. Enfin, la liaison d’anticorps en surface des liposomes grâce à l’Anx5ZZ a été caractérisée et optimisée de façon à utiliser ces anticorps comme éléments d’adressage pour cibler deux pathologies : l’athérosclérose et l’inflammation. La composition lipidique a été optimisée pour encapsuler de façon stable des fluorophores tout en liant des Anx5. Les expériences de caractérisation de la fonctionnalisation par DLS et FRET nous ont conduits à choisir une séquence pour l’association des anticorps qui consiste a associer les anticorps aux Anx5ZZ dans un premier temps à lier ce complexe en surface des liposomes. Deux anticorps ont été utilisés pour vérifier les capacités d’adressage des vecteurs vers des cibles biologiques, tout d’abord ex vivo sur des modèles de plaques d’athérome puis ex et in vivo sur des rats présentant des zones d’inflammation. L’ensemble de ces travaux ont donc consistés à mettre au point des liposomes fonctionnalisés avec des dérivés d’Anx5 et encapsulant des éléments dans l’espace interne des vésicules. Ces vecteurs ont étés utilisés pour imager des cibles biologiques.
This subject is in the framework of drug or imaging agent delivery system. This object must carry compound in an organism and selectively recognize a target area. The aims of my work were to add a targeting element to liposomes by use of Anx5 derivative and to encapsulate imaging compound inside the aqueous inner space. First we designed Anx5-bearing liposomes with the Anx5 protein covalently linked at the distal end of a PEG-lipid and used as targeting element. Anx5 conjugation was monitored by SDS-PAGE in order to control Anx5 density on the liposome surface. The influence of ligand density on the efficiency of binding to target membranes and on solutions dispersity was assessed by QCM-D and DLS. A density of 60 Anx5 / liposomes ensure the best target recognition efficiency and dispersity. Finally fluorescent dyes encapsulation was used to image the interaction between Anx5 bearing liposomes and apoptotic cells. To prepare magnetoliposomes we have synthesized and characterized the encapsulation of iron oxide nanoparticle inside neutral and anionic liposomes. The passive encapsulation procedure, the influence of the negative charge and the magnetoliposome stability were evaluated. The number of particle / vesicle was assayed and the liposomes aspect was examined using cryoelectron microscopy. An average of 50 particles / liposomes was encapsulated inside 100nm vesicles. Anionic lipids limit the encapsulation efficiency and promote liposomes destabilization. Finally the use of Anx5ZZ to anchor antibodies on the liposomes surface was characterized and optimized to use antibodies as homing device to target two diseases: atherosclerosis and inflammation. Lipid composition was optimized to stably entrap fluorescent dyes while Anx5 are bound on the membrane. To functionalize the vector, DLS and FRET experiment leads us to choose a sequence that consists in associating antibodies to the Anx5ZZ in a first time and then binding this complex on the liposome surface. Two antibodies were used to address the liposome toward biological targets, ex vivo on atherosclerosis models and in vivo on rats bearing inflammation areas.
Le travail présenté dans ce mémoire avait pour but d’étudier le potentiel de nouvelles sondes fluorescentes pour la mise au point d’agents d’imagerie optique et d’imagerie Cherenkov inédits. Le ...premier chapitre porte sur la synthèse de subphtalocyanines et phtalocyanines fluorescentes possédant des fonctions chimiques qui confèrent à la molécule des propriétés adaptées à une application en imagerie médicale. Les composés obtenus ont été étudiés pour déterminer s’ils possèdent les propriétés requises pour l’application visée, en considération du cahier des charges propre aux fluorophores. Dans un deuxième temps, certaines sondes fonctionnelles préparées ont été utilisées pour créer des agents d’imagerie inédits. Dans le cas des subphtalocyanines, la biovectorisation a été explorée par association directe de la sonde avec un peptide, ou indirecte grace à un liposome encapsulant la sonde. Dans le cas des phtalocyanines, les sondes fonctionnelles ont été engagées dans la préparation de nanohybrides constitués de nanoparticules d’oxyde de fer ou de nanotubes d’oxyde de titane, afin d’obtenir des agents bimodaux ou théranostiques. Le troisième chapitre présente l’étude du phénomène de transfert d’énergie (CRET) entre des radioéléments émetteurs Cherenkov et des fluorophores organiques a été étudié. La détermination des paramètres de transfert optimaux a ensuite guidé la mise au point d’une sonde CRET composée d’un fragment fluorescéine lié covalentement à un complexe d’yttrium-90. Pour finir, la possibilité d’émettre dans la fenêtre du proche infrarouge a été explorée par multi-transfert de type CRETFRET.
The goal of this work was to prepare and study new fluorescent probes, which could give rise to novel optical or Cherenkov imaging agents. The first section of this work describes the synthesis of fluorescent subphthalocyanines and phthalocyanines probes, which possess relevant chemicals groups suitable for optical imaging applications. The optical and physico-chemical properties of the new probes were carefully examined to ensure they comply with the specification of the fluorophores for the desired application. The second part focused on the subsequent development of a few selected probes into real imaging agents. The biovectorisation of subphtalocyanines was achieved upon conjugation of a peptide either with the probe or with a liposome that encapsulate the probe. Phthalocyanine-based functional probes were engaged in the synthesis of nanohybrides made of iron oxide nanoparticles or titania nanotubes, to afford bimodal or theranostic agents. In a final part, the energy transfer phenomenon (CRET) between Cherenkov emitting radionuclides and organic fluorophores was studied. The optimal transfer parameters were considered to prepare a CRET probe made of a fluorescein moiety covalently attached to an Yttrium-90 complex. Finally, the ability to emit in the near infrared window was explored by multi-CRET-FRET transfer.
Le sujet de cette thèse consiste à formuler et caractériser de nouveaux matériaux hybrides inorganique/organique pour la formulation et la libération de principes actifs. Ces matériaux sont ...constitués soit par des hydroxydes doubles lamellaires (HDL) et des phospholipides (PL) soit par des hydroxydes doubles lamellaires et du chitosane. Les matériaux hybrides hydroxydes doubles lamellaires/phospholipides ont été obtenus par échange anionique entre les anions du feuillet d'HDL et les phospholipides chargés négativement sous forme de liposomes. Les techniques d'analyse utilisées (DRX, ATG, UV et MET) ont permis de déterminer l'influence de la nature des anions de compensation des feuillets d'HDL et des phospholipides sur le taux de intercalation de PL dans les HDL et le taux de chargement d'un principe actif modèle : l'estradiol. Nous avons effectué ensuite des cinétiques de libération des phospholipides et de l'estradiol intercalés en faisant varier le pH et la composition du milieu pour déterminer les propriétés de ce matériau en tant que système de libération sous forme d'implant afin de libérer le principe actif sur des temps très longs. Les matériaux hybrides hydroxydes doubles lamellaires/chitosane ont ensuite été synthétisés sous forme de billes par un procède sol-gel nous permettant d'optimiser la morphologie et la texture des matériaux par le contrôle de la viscosité et le choix du mode de séchage (étuve ou spray-drying). Le chitosane a été choisi pour ses propriétés muco-adhésives afin d'envisager une application du matériau sur les muqueuses. Les techniques d'analyse utilisées ont permis de confirmer la présence de HDL dans le chitosane (DRX), de déterminer la morphologie des billes (MET, MEB) ainsi que leur composition (ATG). Des cinétiques de libération au cours de temps et en fonction de pH ont été réalisées sur de billes chitosane/ hydroxydes doubles lamellaires chargées en principe actif (ibuprofène ou phospholipides charge en estradiol) afin de déterminer leur potentiel de libération du PA. Ces nouveaux hybrides inorganique/organique s'avèrent donc être des matériaux très intéressants en tant que systèmes de libération contrôlée de principes actifs dans le domaine pharmaceutique.
The aim of this work involves the preparation and the characterization of new inorganic/ organic hybrids materials as drug delivery systems. These materials are composed of layered double hydroxide (LDH) and phospholipids (PL) or layered double hydroxide and chitosan. The layered double hydroxide/phospholipids hybrids materials were obtained by anionic exchange between the anions from the HDL layers and the liposome composed of phospholipids with negative charges. Different analysis were used such as XRD, TGA, TEM and fluorescence for the characterization of these materials and the determination of parameters such as the nature of the LDH anions nature, the kind of phospholipids as well the ratio of used model drug (17ƒÒ-estradiol) allowing the optimal method. Release kinetic studies of the phospholipids and of the drug were carried out in different release media (pH, nature of ions) to evaluate the potential sustained release properties of these hybrid materials. Layered double hydroxide/chitosan beads were developed by a sol-gel process. Chitosan was chosen for its muco-adhesive properties permitting to broaden the possibility of pharmaceutical applications. This method allowed us to improve the morphology and the texture of the material by controlling the viscosity and the drying process. Materials were characterized by XRD, TGA, SEM and TEM to determine: the presence of LDH, the encapsulated LDH yield and the morphology of the beads. Releases kinetic of a model drug (ibuprofen) encapsulated in layered double hydroxide/chitosan hybrid materials allowed us to test its potential release properties. Such new inorganic/ organic hybrids materials proved to be interesting as sustained release systems in pharmaceutical domain.
Ce travail, qui fait partie d’un projet européen, « NANOTHER », est focalisé sur la fonctionnalisation de nanoparticules polymériques et lipidiques fonctionnalisées par des anticorps Herceptine® pour ...cibler des cellules du cancer du sein HER2+. Deux stratégies de fonctionnalisation ont été étudiées : une a reposé sur l’utilisation de protéines de fusion, l’Anx5-ZZ, composée d’Annexine A5 et deux domaines Z homologues de la protéine A de Staphylococcus aureus qui peuvent se fixer des anticorps d’une manière orientée par leur fragment cristallisable ; l’autre a porté sur le couplage direct d’anticorps modifiés pour exposer des groupes sulfhydryles aux nanoparticules exposant des groupes maléimides.La première partie concerne le développement d’un agent de ciblage simplifié du complexe l’Anx5-ZZ-anticorps, à savoir l’Anx5-scFv (single-chain variable fragment). Puisque la cible n’avait pas été décidée au début de ce travail, deux scFvs ont été utilisé comme système modèle. L’expression de protéines de fusion a été essayée chez Escherichia Coli avec différentes constructions de protéines de fusion, différentes conditions d’expression et différentes souches bactériennes. Toutes les protéines sont soient agrégées soient non surexprimées.La deuxième partie consiste à fonctionnaliser les polymersomes par l’Herceptine® via l’Anx5-ZZ. D’abord, nous avons validé une méthode de modification de la surface de polymersome pour présenter des groupes maléimides. Ensuite, le couplage covalent de l’Anx5(SH)-ZZ aux polymersomes-maléimide a été réalisé et quantifié. Nous avons obtenu maximum 30 Anx5-ZZ par polymersome. Puis, la liaison d’affinité d’anticorps aux polymersomes-Anx5-ZZ a été caractérisée, réalisée et quantifiée. Pour 30 Anx5-ZZ par polymersome, nous avons 60 Herceptine® par polymersome. Cependant, l’efficacité de ciblage de ces systèmes est très faible.La troisième partie consiste à fonctionnaliser les liposomes par l’Herceptine® via couplage direct. Tout d’abord, la modification de l’Herceptine® pour présenter des groupes SH a été caractérisée et contrôlée. Ensuite, le couplage covalent d’Herceptine®-SH aux liposomes-maléimides a été réalisé et quantifié. L’étude de ciblage montre que les liposomes fonctionnalisés par une molécule d’Herceptine® sont capable de cibler les cellules HER2+.
This work, which is part of a European project "NANOTHER", focus on the functionalization of polymeric and lipidic nanoparticles by Herceptin® to target HER2+ cancer cells. Two functionalization strategies were studied: one was based on the use of a fusion protein, Anx5-ZZ, composed of Annexin A5 and two Z domains which are homologous with the protein A of Staphylococcus aureus that can bind antibodies by their crystallizable fragment in a oriented way; the other focused on the direct coupling of modified antibodies exposing sulfhydryl groups to nanoparticles exposing maleimid groups.The first part concerns the development of a targeting agent simplified from the Anx5-ZZ-antibody complex, namely Anx5-scFv (single-chain variable fragment). Since the target had not been decided at the beginning of this work, two scFvs were used as model system. The expression of fusion proteins was tested in Escherichia coli with different fusion protein constructions, different expression conditions and different bacterial strains. All proteins are either aggregated or non-overexpressed.The second part is to functionalize the polymersomes by Herceptin® via Anx5-ZZ. First, we validated a method for modifying the surface of polymersome to expose maleimid groups. Then, the covalent coupling of Anx5(SH)-ZZ to polymersomes-maleimid was performed and quantified. We obtained maximum 30 Anx5-ZZ per polymersome. Then, the affinity binding of antibodies to polymersomes-Anx5-ZZ was characterized, performed and quantified. For 30 Anx5-ZZ per polymersome, we have 60 Herceptin® per polymersome. However, the targeting efficiency of this system is very low.The third part consists in functionalizing the liposomes by Herceptin® via direct coupling. Firstly, the modification of Herceptin® to expose SH groups was characterized and controlled. Then, the covalent coupling of Herceptin®-SH to liposomes exposing maleimid groups was performed and quantified. The targeting study shows that liposomes functionalized with one Herceptin® are able to target HER2+ cells.
