To study the effect of freezing, in vitro culture (IVC) and grafting to chorioallantoic membrane (CAM) on follicle outcomes in human ovarian tissue. An experimental study. University-based research laboratory. Fresh and cryopreserved ovarian tissue from 10 patients was donated to research with their consent and institutional review board approval. Fresh and frozen-thawed ovarian cortical pieces were in vitro-cultured and compared (fresh-IVC vs FT-IVC). The FT-IVC fragments were then examined against fragments grafted to CAM (FT-CAM). After both IVC and CAM grafting, ovarian cortical pieces (4×2×1 mm3) were analyzed on days 0, 1, and 6. Follicle analyses included histology (count and classification) and immunohistochemistry (Ki67 proliferation, caspase-3 apoptosis, 1A and 1B light chain 3B autophagy, p-Akt, FOXO1, and p-rpS6 PI3K activation). Droplet digital polymerase chain reaction further explored expression of PI3K pathway- and oocyte-related genes in tissue sections. No major differences were detected between fresh-IVC and FT-IVC tissues in any conducted analyses. Although a significant drop was observed in primordial follicle (PF) proportions in the fresh-IVC and FT-IVC groups (d0 vs. d6, P<.002), they held steady in the FT-CAM group (d0 vs. d6, P>.05). The PF rates were also significantly higher in the FT-CAM group than the FT-IVC group on d6 (P=.02). Importantly, avian erythrocytes were already present in 30% of implants from d1. Apoptotic and autophagic follicle rates increased during IVC (P<.008), but remained significantly lower in the FT-CAM group (P<.01), confirming superior follicle preservation in CAM-grafted tissue. Upregulation of the PI3K/FOXO pathway was established in the IVC groups, demonstrating PF activation, whereas significant pathway downregulation was detected in the FT-CAM group (P<.03). The droplet digital polymerase chain reaction tests confirmed oocyte growth during IVC and follicle autophagy in all groups; however, the PI3K pathway appeared to be differentially modulated in tissues and follicles. In vitro culture induces PF depletion with no additional impact of freezing. Grafting to CAM preserves the PF pool by curbing follicle activation, apoptosis, and autophagy, probably thanks to rapid graft revascularization and/or the circulating embryonic antimüllerian hormone. These findings highlight the importance of enhancing neoangiogenesis in ovarian grafts and investigating the potential benefits of administering antimüllerian hormone to prevent PF burnout. Resultados de folículos en tejido ovárico humano: efecto del congelamiento, cultivo y trasplante. Estudiar el efecto del congelamiento, cultivo in vitro (IVC) y trasplante en la membrana corioalantoidea (CAM) sobre los resultados de folículos en tejido ovárico humano. Estudio experimental. Laboratorio Universitario de investigación básica. El tejido ovárico fresco y criopreservado de 10 pacientes fueron donados para investigación con su consentimiento y aprobación por el comité de revisión institucional. Se compararon piezas de corteza ovárica cultivadas in vitro en fresco (Fresco-IVC) y cultivadas in vitro luego de congelamiento-descongelamiento (FT-IVC). Los fragmentos FT-IVC fueron luego evaluados contra fragmentos trasplantados en CAM (FT-CAM). Los trasplantes de piezas corticales de ovario (421 mm) de IVC y CAM fueron analizados en los días 0, 1 y 6. El análisis folicular incluyó la histología (conteo y clasificación) e inmunohistoquímica (Ki67 proliferación, caspasa 3 apoptosis, cadena ligera 3B de proteínas 1A y 1B autofagia, p-Akt, FOXO1 y p-rpS6 activación PI3K). Posteriormente se usó PCR digital para la explorar de la expresión de la vía PI3K- y genes relacionados a ovocitos de las secciones ováricas. No se encontraron mayores diferencias entre tejidos fresco-IVC y FT-IVC en ninguno de los análisis realizados. Aunque se observó una disminución significativa de la proporción de folículos primordiales (PF) en los grupos fresco-IVC y FT-IVC (d0 vs. D6, P<.002), estos se mantuvieron estables en el grupo FT-CAM (d0 vs. D6, ns). Las tasas de PF fueron significativamente mayores en el grupo FT-CAM en comparación al grupo FT-IVC en d6 (P1/4.02). De forma importante, eritrocitos aviares se encontraban presentes en un 30% de los trasplantes desde d1. Las tasas de apoptosis y autofagia incrementaron durante IVC (P<.008), pero se mantuvieron significativamente bajas en el grupo FT-CAM (P<.01), confirmando una mejor preservación en los trasplantes de tejidos CAM. Se estableció una regulación río arriba de la vía PI3K/FOXO en los grupos IVC, demostrando una activación PF, mientras que se detectó una regulación río abajo en el grupo FT-CAM (P<.03). La prueba de PCR confirmó el crecimiento ovocitario durante la IVC y la autofagia folicular en todos los grupos, sin embargo, la vía PI3K parecía estar modulada diferencialmente en tejidos y folículos. El cultivo in vitro induce a la depleción de PF sin un impacto adicional del congelamiento. Injertar en CAM mantiene el conjunto de PF frenando la activación folicular, apoptosis, y autofagia, probablemente gracias a la rápida re-vascularización y/o a la hormona anti-mulleriana embrionaria circulante. Estos hallazgos resaltan la importancia de mejorar la neo-angiogénesis en los trasplantes de ovario e investigar los potenciales beneficios de administrar la hormona anti-mulleriana para prevenir el agotamiento de PF.