Abstract Natural products have been touted as important tools because of their vast potential for the development of compounds with antimicrobial activity and the possible inhibitory activity and/or adjuvant resistance mechanisms. Propolis has been empirically used for many years for the treatment of diseases, mainly due to its antioxidant, anti inflammatory and antimicrobial activities. This study aimed to evaluate the in vitro antimycobacterial activity of the ethanol extract of propolis alone and in combination with rifampicin (RIF), amikacin (AMI) and ciprofloxacin (CIP). The ethanol extract of propolis showed antibacterial activity against Mycobacterium chelonae and M. kansasii and was capable of increasing AMI, RIF and CIP activity in combination. On the other hand, compared to M. absecessus, M. fortuitum and M. avium, the extract was not active at 200 µg/mL and did not show pronounced adjuvant capacity when evaluated in association with the drugs. Based on these results, it can be concluded that the ethanol extract of propolis could be an alternative in the development of new drugs and can be used complementary with the current mycobacteriosis treatment. Resumo Os produtos naturais têm sido apontados como ferramentas importantes devido ao seu vasto potencial para o desenvolvimento de compostos com atividade antimicrobiana e a possível atividade inibitória e/ou adjuvante de mecanismos de resistência. O própolis é utilizado empiricamente há muitos anos no tratamento de doenças, principalmente devido às suas atividades antioxidantes, anti-inflamatórias e antimicrobianas. Este estudo teve como objetivo avaliar a atividade antimicobacteriana in vitro do extrato etanólico de própolis isoladamente e em associação com rifampicina (RIF), amicacina (AMI) e ciprofloxacina (CIP). O extrato etanólico de própolis mostrou atividade antibacteriana frente Mycobacterium chelonae e M. kansasii e foi capaz de aumentar a atividade de AMI, RIF e CIP em associação. Por outro lado, frente a M. absecessus, M. fortuitum e M. avium, o extrato não foi ativo a 200 µg/mL e não apresentou capacidade adjuvante pronunciada quando avaliado em associação com os fármacos. Com base nesses resultados, pode-se concluir que o extrato etanólico de própolis pode ser uma alternativa no desenvolvimento de novos fármacos e pode ser utilizado complementarmente com o atual tratamento das micobacterioses.