Das Konzept der Proteasom‐Inhibition zählt zu den jüngsten Errungenschaften der Blutkrebstherapie und stellt eine vielversprechende Strategie zur Regulierung von Autoimmunerkrankungen dar. Diese ...Arbeit beschreibt die selektive Hemmung der katalytischen β5‐Untereinheit des Immunoproteasoms durch peptidische Sulfonylfluoride, die nur geringen zytotoxischen Effekt haben. Strukturelle und massenspektrometrische Analysen offenbarten einen neuartigen Inhibitionsmechanismus, der zu einer Umpolung und irreversiblen Vernetzung des proteasomalen aktiven Zentrums führt. Hierdurch identifizierten wir die Sulfonylfluorid‐Kopfgruppe für die Weiterentwicklung von Immunoproteasom‐spezifischen Verbindungen und ihren möglichen Einsatz zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen.
Peptidische Sulfonylfluoride wurden mit klinisch erprobten Immunoproteasom‐Inhibitoren, die eine α′,β′‐Epoxyketon‐Kopfgruppe tragen, bezüglich Inhibitionsmechanismus, Selektivität und Zytotoxizität verglichen. Die peptidischen Sulfonylfluoride entfernen das katalytisch aktive Nukleophil und vernetzen das Katalysezentrum. Zellbasierte Aktivitäts‐ und Viabilitätsexperimente empfehlen diese Kopfgruppe für die Entwicklung selektiver Immunoproteasom‐Inhibitoren.
Abstract
Das Konzept der Proteasom‐Inhibition zählt zu den jüngsten Errungenschaften der Blutkrebstherapie und stellt eine vielversprechende Strategie zur Regulierung von Autoimmunerkrankungen dar. ...Diese Arbeit beschreibt die selektive Hemmung der katalytischen β5‐Untereinheit des Immunoproteasoms durch peptidische Sulfonylfluoride, die nur geringen zytotoxischen Effekt haben. Strukturelle und massenspektrometrische Analysen offenbarten einen neuartigen Inhibitionsmechanismus, der zu einer Umpolung und irreversiblen Vernetzung des proteasomalen aktiven Zentrums führt. Hierdurch identifizierten wir die Sulfonylfluorid‐Kopfgruppe für die Weiterentwicklung von Immunoproteasom‐spezifischen Verbindungen und ihren möglichen Einsatz zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen.
Proteolytischer Abbau ist ein essenzieller zellulärer Vorgang, der hauptsächlich durch das 20S‐Proteasomkernpartikel (CP), eine Protease von 720 kDa und 28 einzelnen Untereinheiten, bewerkstelligt ...wird. Wegen seiner zentralen Funktion ist das Proteasom ein vielversprechendes Angriffsziel für Wirkstoffe, das nach intensiven Untersuchungen im letzten Jahrzehnt mit der Zulassung von Bortezomib durch die US Food and Drug Administration (FDA) auch validiert worden ist. Gegenwärtig werden mehrere verbesserte Proteasominhibitoren der zweiten Generation in klinischen Studien als Krebswirkstoffe untersucht, und die meisten von ihnen hemmen sowohl das konstitutive Proteasom (cCP) als auch das Immunoproteasom (iCP). Allerdings scheint die selektive Inhibition des iCP, einer speziellen Proteasomklasse, die vorrangig in Immunzellen exprimiert wird, eine erfolgversprechende therapeutische Maßnahme für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu sein. Auch wenn bereits wenige selektive Substanzen identifiziert worden sind, unterstützt die kürzlich bestimmte Kristallstruktur des iCP die Entwicklung und Optimierung iCP‐selektiver Verbindungen.
Abbaustopp: Kürzlich wurden die ersten Immunoproteasom‐spezifischen Inhibitoren entwickelt. Da der affinste Hemmstoff bei Autoimmunerkrankungen therapeutisch wirksam ist, erschließt dies neue Anwendungsgebiete für Proteasominhibitoren. Struktur‐Affinitäts‐Studien mit den Kristallstrukturen des Immunoproteasoms (siehe Bild) und des konstitutiven Proteasoms erleichtern zukünftige Wirkstoff‐Entwicklungen.
Abstract
Proteolytischer Abbau ist ein essenzieller zellulärer Vorgang, der hauptsächlich durch das 20S‐Proteasomkernpartikel (CP), eine Protease von 720 kDa und 28 einzelnen Untereinheiten, ...bewerkstelligt wird. Wegen seiner zentralen Funktion ist das Proteasom ein vielversprechendes Angriffsziel für Wirkstoffe, das nach intensiven Untersuchungen im letzten Jahrzehnt mit der Zulassung von Bortezomib durch die US Food and Drug Administration (FDA) auch validiert worden ist. Gegenwärtig werden mehrere verbesserte Proteasominhibitoren der zweiten Generation in klinischen Studien als Krebswirkstoffe untersucht, und die meisten von ihnen hemmen sowohl das konstitutive Proteasom (cCP) als auch das Immunoproteasom (iCP). Allerdings scheint die selektive Inhibition des iCP, einer speziellen Proteasomklasse, die vorrangig in Immunzellen exprimiert wird, eine erfolgversprechende therapeutische Maßnahme für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu sein. Auch wenn bereits wenige selektive Substanzen identifiziert worden sind, unterstützt die kürzlich bestimmte Kristallstruktur des iCP die Entwicklung und Optimierung iCP‐selektiver Verbindungen.
Zusammenfassung
Funktionsstörungen des Proteasoms können zu schweren Beeinträchtigungen des angeborenen Immunsystems führen. Diese neuen Interferonopathien mit autosomal-rezessivem Erbgang werden ...inzwischen als ein Erkrankungsspektrum angesehen und unter dem Oberbegriff der Proteasomen-assoziierten autoinflammatorischen Syndrome (PRAAS) zusammengefasst. In der Pathogenese werden eine Akkumulation von ubiquitinierten Proteinen und die Induktion von Typ-I-IFN-Genen angenommen. Zu den typischen klinischen Manifestationen gehören Lipodystrophie, Haut-, Gelenk- und Muskelbeteiligung mit einer bemerkenswerten Variabilität weiterer assoziierter Symptome. Dieser Beitrag gibt einen Überblick zu den aktuell bekannten molekularen Veränderungen sowie zu klinischen Gemeinsamkeiten und Unterschieden bei PRAAS. Weiterhin wird auf bisher eingesetzte immunsuppressive Therapieansätze eingegangen.
El proteasoma es un complejo proteico grande, el cual se encuentra fundamentalmente en todas las células eucariotas ya que juega un rol muy importante en los procesos celulares, tales como: la ...diferenciación celular, la progresión del ciclo celular, el desarrollo y la apoptosis celular. Existen varios tipos de proteasomas como el constitutivo, los intermedios, el inmunoproteasoma y el timoproteasoma, los cuales están presenten en las células del cuerpo en dependencia de la estructura y función de ellas. Sin embargo, se encuentran en las células del sistema inmune donde no solo juegan un papel muy importante en el procesamiento antigénico para la respuesta inmune, sino en los mecanismos de tolerancia central durante el proceso de ontogenia de los linfocitos T en el timo. Así, las células epiteliales tímicas corticales son células presentadoras de antígenos, las cuales presentan características intrínsecas únicas al presentar el timoproteasoma, la catepsina L y la proteasa serin específica del timo. Además, se ha observado una alta tasa de macroautofagia en comparación a las otras células del cuerpo, por lo que serán esenciales en la obtención de un repertorio de linfocitos T CD4+ y CD8+ que tendrán la capacidad de discriminar lo propio y lo no propio. Por lo que se debería considerar que la tolerancia central no está únicamente definida por el mecanismo de selección negativa, sino que a su vez la selección positiva juega un papel muy importante en la definición del repertorio de clones de linfocitos T no autorreactivos. El objetivo es discutir acerca del proteasoma, los tipos de proteasomas y sus implicaciones en la tolerancia central de los linfocitos T.
Abstract Idiopathic inflammatory myopathies (IIMs) are diseases with muscle weakness, morphologically characterized by inflammatory infiltration and increased expression of MHC class I molecule on ...myofibers. Immunoproteasome, as a proteolytic complex that shapes the repertoire of antigenic peptides, has been previously demonstrated to be over-expressed in IIMs at mRNA level. In this study, we investigated the expression and the function of the immunoproteasome in IIMs in more detail. As shown by immunofluorescence staining, expression of relevant players of the immunoproteasome was detectable in the inflamed skeletal muscle tissue from IIM patients. In fact, two subunits of the immunoproteasome, β1i or β5i were upregulated in sporadic inclusion body myositis, immune-mediated necrotizing myopathies and dermatomyositis muscle biopsies and co-localized with the MHC class I expressing myofibers. Double immunofluorescence revealed that both myofibers and muscle infiltrating cells, including CD8+ T-cells and CD68 + macrophages in IIMs expressed β1i or β5i. In addition, we have also investigated the role of the immunoproteasome in myoblasts during in vitro inflammatory conditions. Using human primary myoblasts cultures we found that pro-inflammatory cytokines, TNF-α or IFN-γ upregulate β1i or β5i. Selective inhibition or depletion of β5i amplified the TNF-α or IFN-γ mediated expression of cytokines/chemokines (myokines) in myoblasts. Furthermore, we demonstrated that specific inhibitors of β1i or β5i reduced the cell surface expression of MHC class I in myoblasts induced by IFN-γ. Taken together, our data suggest that the immunoproteasome is involved in pathologic MHC class I expression and maintenance of myokine production in IIMs. Thus, induction of the immunoproteasome was identified as a pathomechanism underlying inflammation in IIMs.
Le protéasome et l’immunoprotéasome possèdent trois activités catalytiques différentes et dégradent une grande variété de protéines. Leur rôle central dans de nombreux processus tels que le contrôle ...du cycle cellulaire et circadien, la régulation des voies de défense contre le stress font d’eux des cibles majeures dans le processus de vieillissement et dans le traitement des cancers. Aussi, le lien établi entre l'horloge circadienne et les défenses anti-oxydantes suggère que l'homéostasie redox des protéines et leur élimination par le protéasome soient modulées par l'horloge circadienne. L’étude d’inhibiteurs bivalents et non covalents du protéasome a montré que de cibler deux sites actifs à la fois permet d’augmenter l’efficacité et la sélectivité. Nous avons également effectué l'évaluation de la pénétration cellulaire de ces molécules à l’aide de sondes fluorescentes non covalentes conçues par le laboratoire. Nous avons montré que les activités peptidases du protéasome présentent une rythmicité circadienne en antiphase avec le taux de protéines carbonylées. L'expression circadienne de NRF2 et de l'activateur PA28 expliquerait cette stimulation de l'activité du protéasome. De plus, contrairement aux fibroblastes jeunes, aucune modulation circadienne du protéasome et du niveau de ROS n’a été mise en évidence dans les fibroblastes sénescents. Des résultats préliminaires de nos inhibiteurs sur le modèle cellulaire HEK293 synchronisé montrent que leur efficacité varie en fonction du rythme circadien et qu’elle est meilleure lorsque les activités du protéasome sont minimales. Ces résultats suggèrent que le protéasome puisse être une nouvelle cible pour la chronothérapie.
Proteasome and immunoproteasome have three different catalytic activities, and degrade a wide variety of proteins. Their central role in many pathways such as control of cellular and circadian cycles, regulation of the defense pathways against stress make them major targets in the aging process and in the treatment of cancer. Also, the link between the circadian clock and antioxidant defenses suggests that the redox homeostasis of proteins and their removal by the proteasome could be modulated by the circadian clock.Studying non-covalent and bivalent proteasome inhibitors showed that targeting two active sites at the same time results in increasing their efficiency and selectivity. We also carried out the evaluation of the cell penetration of these molecules using non-covalent fluorescent probes designed in the laboratory.We have shown that the peptidase activities of proteasome exhibit circadian rhythmicity in antiphase with protein carbonyl intracellular content. The circadian expression of NRF2 and PA28 activator can explain this stimulation of proteasome activity. Moreover, in contrast to young fibroblasts, no circadian modulation of the proteasome and the level of ROS have been observed in senescent fibroblasts.Preliminary results obtained with our inhibitors on the synchronized HEK293 cell model suggest that their effectiveness varies depending on the circadian rhythm and they are more efficient when proteasome activities are minimal. These results suggest that the proteasome could be a new target for chronotherapy.
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