This paper presents optimization of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time-of-flight (TOF) mass spectrometer (MS) instrumental parameters for the analysis of ...chloro(2,2'',2"-terpyridine)palladium(II) chloride dihydrate complex applying design of experiments methodology (DoE). This complex is of interest for potential use in the cancer therapy. DoE methodology was proved to succeed in optimization of many complex analytical problems. However, it has been poorly used for MALDI-TOF-MS optimization up to now. The theoretical mathematical relationships which explain the influence of important experimental factors (laser energy, grid voltage and number of laser shots) on the selected responses (signal to noise ? S/N ratio and the resolution ? R of the leading peak) is established. The optimal instrumental settings providing maximal S/N and R are identified and experimentally verified.
This paper presents optimization of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time-of-flight (TOF) mass spectrometer (MS) instrumental parameters for the analysis of ...chloro(2,2',2"-terpyridine)palladium(II) chloride dihydrate complex applying design of experiments methodology (DoE). This complex is of interest for potential use in the cancer therapy. DoE methodology was proved to succeed in optimization of many complex analytical problems. However, it has been poorly used for MALDI-TOF-MS optimization up to now. The theoretical mathematical relationships which explain the influence of important experimental factors (laser energy, grid voltage and number of laser shots) on the selected responses (signal to noise-S/N ratio and the resolution-R of the leading peak) is established. The optimal instrumental settings providing maximal S/N and R are identified and experimentally verified. Keywords: MALDI-TOF-MS, design of experiments (DoE), optimization, metallo-drugs. IZVOD (Naucni rad) U okviru ovog rada ispitane su mogucnosti koriscenja matematicke metodologije dizajniranja eksperimenta (Design of Experiments (DoE) methodology) za optimizaciju instrumentalnih parametara kod spektroskopije masa sa laserskom desorpcijom i jonizacijom uz pomoc "matrice" (MALDI-MS), za analizu Pd(terpy)ClCl x 2H.sub.2O kompleksa. Navedeni metalni kompleks predstavlja potencijalni lek u antikancer terapiji, tako da povecanje efikasnosti razvoja metoda njegove analize/karakterizacije, kao i uspostavljanje uslova za analizu proizvoda njegove interakcije sa biomolekulima, predstavljaju vazan zadatak. DoE metodologija obezbeduje sistematsko ispitivanje uticaja izdvojenih instrumentalnih parametara (predstavljaju ulazne promenljive ili faktore) na kljucne karakteristike kvalitetnog spektra (tzv. "odgovor") u cilju dobijanja pouzdane identifikacije. Eksperimentalno, spektar je poznat samo na tacno odabranim vrednostima instrumentalnih parametra (u odredenom rangu), ali se ne dobijaju informacije o spektru za vrednosti izmedu pomenutih parametra. Ispitivanje uticaja vrednosti instrumentalnih parametara, izmedu onih vec ispitanih, na kvalitet spektra, eksperimentalno predstavlja izuzetno komplikovan postupak, zbog velikog broja kombinacija. DoE metodologija uspostavlja matematicke relacije izmedu odabranih faktora i "odgovora", na osnovu malog broja pazljivo isplaniranih eksperimenata (Box-Behnken design-pristup). U analitickoj hemiji, ova metodologija uspesno je primenjena za optimizaciju hemijskih faktora kod hromatografskih, elektroana-litickih, termogravimetrijskih i drugih metoda. DoE pristup, do sada, primenjen je za optimizaciju instrumentalnih parametara u slucaju, atomske apsorpcione spektrometrije sa grafitnom kivetom, indukovano kuplovane plazme opticke emisione spektrometrije, indukovano kuplovane plazme spektrometrije masa, kod MALDI spektrometrije masa, ali ne za detekciju kompleksnih jedinjenja. Analiza kompleksa prelaznih metala uz pomoc MALDI-TOF-MS je poseban izazov zbog velikog broja signala koji poticu od izotopa prelaznih metala, tako da je rezolucija koju treba postici od velikog znacaja. Ulazni faktori (promenljive) u ovom radu bili su: intenzitet lasera, broj udaraca lasera i napon na "gridu", a vazne karakteristike spektara, kao sto su odnos signal/sum i rezolucija, predstavljaju trazeni "odgovor". Raspon vrednosti ulaznih faktora odreden je na osnovu preliminarnih eksperimentalnih podataka. Rezultati su pokazali da vrednosti odnosa signal/sum pokazuju jaku kvadratnu zavisnost od intenziteta lasera i umereno zavise od napona na "gridu" i broja udaraca lasera. Rezolucija linearno zavisi od intenziteta lasera i napona na "gridu". Medu nekoliko potencijalnih resenja izabrani inetenzitet lasera od 1220, napon na "gridu" od 79% i 360 udaraca lasera predstavljaju optimalne uslove za dobijanje kvalitetnog spektra Pd(terpy)ClCl x 2H.sub.2O kompleksa, sto je kasnije i eksperimentalno potvrdeno. Kljucne reci: MALDI-TOF-MS * DoE metodologija * Optimizacija * Lekovi na bazi metala
Ova disertacija se bavi ispitivanjem interakcija tri potencijalna antitumorska kompleksa Ru(II) opšte formule mer-Ru(Cl-tpy)(N-N)ClCl (Cl-tpy - 4′-hloro-2,2′:6′,2″-terpiridin; N-N - 1,2-diaminoetan ...(en), 1,2-diaminocikloheksan (dach) ili 2,2′-bipiridin (bipy)) sa transportnim proteinima seruma, humanim serum albuminom (HSA) i transferinom (Tf). Odabrani kompleksi Ru(II) pripadaju novoj klasi terpiridinskih kompleksa meridionalne geometrije, koji pokazuju visoku rastvorljivost u vodi. Do sada je u literaturi pokazana sposobnost ovih kompleksa da grade monofukcionalne adukte sa derivatima guanina, istiĉući njihov potencijal za vezivanje za DNK molekul. MeĊutim, interakcije sa proteinima do sada nisu ispitane. Kako se antikancerski agensi na bazi metala u organizam unose intravenozno, vezivanje kompleksa za transportne proteine seruma je izuzetno vaţno jer moţe znaĉajno uticati na njihovu biodistribuciju i efikasnost.Rezultati su pokazali da se sva tri kompleksa vezuju za HSA i Tf, ali u razliĉitoj meri (dach˃en˃˃bipy). U poreĊenju sa Tf, HSA pokazuje znaĉajno veći vezivni kapacitet za sva tri kompleksa. Konstante vezivanja kompleksa sa en i dach ligandima su u sluĉaju HSA reda veliĉine 104 -105 M -1 , dok je vezivanje za Tf slabije, reda veliĉine 101 -102 M -1. Vrednosti konstanti vezivanja kompleksa sa bipy ligandom su zanemarljive i ukazuju na slabe interakcije. Vezivanje kompleksa nema znaĉajnog uticaja na sekundarnu strukturu proteina, dok se na tercijarnoj strukturi uoĉavaju blage promene koje su izraţenije kod Tf. Detaljnim ispitivanjem vezivnih mesta na Tf je pokazano da na proteinu postoji pet ostataka histidina za koje se kompleksi sa en i dach ligandima mogu vezati koordinativno kovalentno. Jedan od njih, His585, ulazi u sastav vezivnog mesta za gvoţĊe, dok su ostala mesta nespecifiĉna i ukljuĉuju površinske ostatke histidina. Kompleks sa bipy ligandom se za Tf vezuje u maloj meri, najverovatnije preko nekovalentnih interakcija. U okviru vezivnih mesta na HSA, identifikovano je pet ostataka histidina i jedan ostatak asparaginske kiseline, za koje se kompleksi sa en i dach ligandima mogu vezati koordinativno kovalentno. Od toga, samo tri His i jedan Asp mogu biti mete za vezivanje kompleksa sa bipy ligandom. Prema doking studiji, ovi ostaci ulaze u sastav pet vezivnih mesta za en i dach, odnosno dva za bipy kompleks. Pokazano je da se kompleksi za HSA mogu vezati i nekovalentno, kao i da vezivna mesta diktira oblik kompleksa (hloro, hidrokso ili akva).Pored navedenog, razvijena je i optimizovana metoda za poboljšanje negativne jonizacije peptida upotrebom nano-elektrosprej masene spektrometrije (ESI MS). Metoda podrazumeva dodatak rastvora formaldehida u izopropanolu, nakon elucije uzoraka sa hromatografske kolone. Primenom metode za identifikaciju vezivnih mesta ispitivanih kompleksa proteomskim “bottom-up” pristupom, omogućena je negativna jonizacija peptida koji na sebi nose vezane komplekse rutenijuma. Primećena je redukcija naelektrisanja detektovanih jona (1-) u odnosu na pozitivni jonski mod (3+). Zbog karakteristiĉne izotopske raspodele rutenijuma, prisustvo jednostruko naelektrisanih vrsta olakšava identifikaciju ciljnih vezivnih peptida, bez fragmentacije liganada karakteristiĉne za analizu matriksom-pomognutom laserskom desorpcijom i jonizacijom (engl. matrix-assisted laser desorption and ionization, MALDI).Iz dobijenih rezultata se moţe zakljuĉiti da kompleksi sa bidentatnim helatnim ligandima koji poseduju sposobnost graĊenja jakih vodoniĉnih veza (en i dach) pokazuju znaĉajno veći afinitet za vezivanje transportnih proteina, nego što je to sluĉaj sa bipy kompleksom. Pored toga, ova osobina pozitivno korelira i sa ispitanom citotoksiĉnošću kompleksa.
PDF
