U ovom preglednom članku detaljno je opisan utjecaj angiogenih i antiangiogenih čimbenika na razvoj posteljice. Razvoj posteljice u prvom tromjesečju trudnoće jedan je od glavnih činitelja o kojima ...ovisi daljnji tijek i ishod trudnoće. Čimbenici rasta endotela krvnih žila (VEGF) i rasta placente (PlGF) su ključni čimbenici i u fiziološkim i patološkim uvjetima. VEGF i PlGF ispoljavaju svoje djelovanje preko svojih receptora (tirozin kinaze) VEGFR-1 (Flt-1) i VEGFR-2 (KDR) koji se nalaze u endotelnim stanicama. Kisik je glavni regulator ravnoteže VEGF i PlGF. Hipoksija smanjuje djelovanje PlGF, a hiperoksija povećava. Topljivi VEGFR-1 (Flt-1) je povišen u trudnice koja će razviti preeklampsiju. Uspješna placentacija dovodi do niskog otpora krvnih žila zbog transformacije spiralnih arterija.
Uvod: Peritumoralne retrakcijske pukotine više se ne smatraju samo artefaktom, već dodatnim pokazateljem ponašanja invazivnih karcinoma mnogih organa. One predstavljaju morfološki odraz promjena u ...građi i sastavu tumorske strome, a možda i jedan od stadija limfangiogeneze tumora. Hipoteza istraživanja bila je da su u tkivu invazivnog duktalnog karcinoma dojke peritumoralne retrakcijske pukotine povezane s povećanom gustoćom limfnih žila što doprinosi lakšem rasapu
tumorskih stanica i lošijoj prognozi. Materijal i metode: Analizirano je 100 invazivnih duktalnih karcinoma dojke u žena, 41% bez, a 59% s metastazama u limfne čvorove aksile. Osim rutinski, analizirana je imunohistokemijska izraženost CD34, vimentina, glatkomišićnog aktina (SMA) i CD2-40 (podoplanina). Rezultati: Peritumoralne pukotine su nađene u 92% karcinoma, a u okolnom zdravom tkivu i oko žarišta duktalnog karcinoma in situ nisu nađene. Proširenost pukotina bila je 5% do 100%. Gustoća malih limfnih žila unutar tumora i peritumoralno nije pokazala statistički značajnu povezanost s apsolutnim postotkom peritumoralnih pukotina, kao niti s izraženošću peritumoralnih pukotina s obzirom na graničnu vrijednost od 30%. U bolesnica s metastazama peritumoralna limfovaskularna invazija (LVI) je nađena 2 puta češće, a intratumoralna LVI skoro 5 puta češće nego u bolesnica bez metastaza, što je statistički značajno različito. Ni peritumoralna, niti intratumoralna
LVI nisu pokazale statistički značajnu povezanost s apsolutnim postotkom peritumoralnih pukotina, kao niti s izraženošću
peritumoralnih pukotina s obzirom na graničnu vrijednost od 30%. Zaključak: U invazivnom duktalnom karcinomu dojke peritumoralne pukotine predstavljaju morfološki odraz promijenjenih osobina tumorske strome, ali nisu povezane s gustoćom malih krvnih žila kao odrazom limfangiogeneze, čija je patogeneza vjerojatno drugačija.
Cijeljenje rane dinamičan je proces koji se odvija u više međuovisnih faza koje uključuju reguliranu interakciju među različitim vrstama stanica, izvanstaničnog matriksa, proteaza i njihovih ...supstrata. Rastući znanstveni dokazi naglašavaju važnost proteaza u regulaciji ključnih procesa cijeljenja rane. Dipeptidil-peptidaza IV (DPP IV/CD26, EC 3.4.14.5), glavni je član obitelji DPP IV proteina. Riječ je o ubikvitarnom multifunkcionalnom transmembranskom glikoproteinu koji je prisutan i u topljivom obliku, a djeluje kao proteolitička i kostimulacijska molekula te vezni protein. Izražena je na površini različitih vrsta stanica, uključujući epitelne, endotelne stanice i limfocite. Pokazano je da ima značajnu ulogu u različitim fiziološkim i patološkim procesima. DPP IV/CD26 je u velikoj mjeri istraživana zbog svoje sposobnosti održavanja homeostaze glukoze. Štoviše, budući na utvrđene pozitivne učinke inhibicije DPP IV/CD26 u cijeljenju kroničnih dijabetičkih ulkusa, kao i uključenosti u drugim patološkim procesima, ova je molekula od rastućeg znanstvenog interesa u cilju razjašnjavanja mehanizama njezinog djelovanja. Poznato je da DPP IV/CD26 sudjeluje u regulaciji stanične adhezije, migracije i apoptoze stanica kao i angiogenezi te razgradnji ekstracelularnog matriksa, ključnim procesima u cijeljenju rana. Prethodne studije pokazale su da DPP IV/CD26 ima posebno važnu ulogu u regeneraciji kože, gdje je utvrđeno da može posredovati upalne procese i utjecati na epitelizaciju ranjenog tkiva. Stoga je cilj ovog preglednog rada sažeti ključna otkrića u procesima cijeljenja rana te prikazati nove spoznaje o ulozi DPP IV/CD26 u procesima regeneracije tkiva.
Bevacizumab neutralizes a key stimulation factor in tumour angiogenesis - vascular endothelial growth factor (VEGF). The origin of VEGF is related to platelets, and the basic stimulus for its ...production is hypoxia. By neutralizing VEGF, changes occur in the blood that are manifested at the platelet and haemoglobin levels. Study results indicate that proteinuria is a side effect of bevacizumab treatment. The aim of the present study was to examine the percentages of proteinuria in patients with metastatic colorectal cancer after the administration of bevacizumab. The correlation between the degree of proteinuria and changes in the number of platelets and concentration of haemoglobin in patients, as well as in relation to the age (< 60 i ≥ 60) and gender of the patients, was examined.
The study group of respondents included 20 patients with metastatic colorectal cancer (9 men and 11 women) ranging in age from 43 to 73 years. Proteinuria was tested using “Laboquick” test strips. The levels of platelets and haemoglobin were measured using an autoanalyser, the type Cell Dyn 3700 – Abbott, according to the protocol prescribed by The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC).
Statistically significant differences were recorded for the platelet measurements before and after therapy in the overall group of respondents (p= 0.025). Statistically significant decreases in platelet counts and increases in haemoglobin concentrations were also noted in women (Plt: p=0.0036; Hb: p=0.0286) and in patients < 60 years old (Plt: p=0.0270; Hb: p=0.0553). No significant differences were identified in men or in patients ≥ 60 years of age. Proteinuria was detected in one case in which demonstrating an increase in only the recorded number of platelets and a decrease in the level of haemoglobin.
Platelets and haemoglobin may serve as prognostic biomarkers of the risk of proteinuria. Based on the initial values of these parameters, we can predict the target group, in terms of gender and age, that may obtain the most benefit from bevacizumab therapy.
Cilj: Istražiti utjecaj angiogenih parametara, izražaja osteopontina (OPN) i vaskularnog endotelnog čimbenika rasta (VEGF; engl. vascular endothelial growth factor) u koštanoj srži na odgovor na prvu ...liniju terapije u pacijenata s multiplim mijelomom (MM). Ispitanici i metode: U istraživanje je uključeno 68 pacijenata s MM-om, liječenih na Odjelu hematologije Kliničkog bolničkog centra u Rijeci. Za kvantifikaciju angiogenih parametara uz klasičnu metodu utvrđivanja gustoće krvnih žila (MVD; engl. microvessel density) koristili smo i računalno potpomognutu analizu slike koja nam je omogućila izračunavanje broja krvnih žila po mm2, površine krvnih žila po mm2, srednjeg promjera krvnih žila i ukupne vaskularne površine (TVA; engl. total vascular surface) na bioptičkim uzorcima koštane srži obojanim s anti-CD34. Za određivanje izražaja OPN-a i VEGF-a u plazma stanicama korištena je dvostruka imunohistokemijska metoda CD138+OPN i CD138+VEGF. Rezultati: Utvrđeno je da su viši angiogeni parametri, MVD (P = 0,004) i broj krvnih žila po mm2 (P = 0,028) značajni negativni prognostički pokazatelji odgovora na prvu liniju terapije u pacijenata s MM-om. Zaključak: Objektivna metoda procjene angiogeneze u uzorcima koštane srži mogla bi postati dio rutinske patohistološke obrade pacijenata koja bi pomogla u prepoznavanju podskupina pacijenata s eventualnim agresivnijim tijekom i lošijim odgovorom na terapiju.
Cilj: Primarni cilj ove studije bio je istražiti značaj određivanja bazičnog čimbenika rasta fibroblasta (bFGF) u urinu u razli-čitim fazama rasta infantilnih hemangioma (IH) u djece.Materijali i ...metode: Provedena je studija istraživanja parova (case-control study). Za potrebe istraživane ciljne skupine kori-šteni su uzorci od pedeset (N=50) djece s IH. Kontrolnu skupinu činilo je stotinu (N=100) zdrave djece usporedive dobi i spola bez IH i vaskularnih malformacija. Za potrebe ovog istraživanja kontrolna skupina bila je podijeljena na fazu 1, koja je odgovarala proliferaciji ispitivane skupine, i fazu 2, koja je odgovarala involuciji ispitivane skupine. Imunotest (ELISA) korišten je za određi-vanje urinskih vrijednosti bFGF-a.Rezultati: Usporedba vrijednosti bFGF-a u fazama proliferacije i involucije u skupini bolesnika s IH nije pokazala statistički značajnu razliku (p=0,893). U kontrolnoj skupini tijekom 1. faze značajno više ispitanika imalo je vrijednosti bFGF u urinu ≥0,31 u odnosu na 2. fazu (P=0,003). Mjereno u fazi proliferacije IH, odnosno u fazi 1 kontrole, u kontrolnoj skupini značajno je više ispitanika imalo vrijednosti bFGF-a u urinu ≥0,31 (najniža vrijednost koja je bila detektabilna na uređaju): 24,0% prema 4,0%; P=0,008. Vrijednosti bFGF-a u urinu u fazi involucije IH u usporedbi između ispitivane i kontrolne skupine (faza 2) nisu pokazala statističku značajnu razliku (P=0,617).Zaključak: Iako se smatra da rast IH nastaje pod utjecajem angiogenih čimbenika, ova studija nije pokazala značaj i korisnost određivanja bFGF-a u urinu u dijagnostici, liječenju i praćenju djece s IH.
Objective: The primary objective of this study was to investigate the significance of determination of urinary basic fibroblast growth factor (bFGF) at different stages of growth of infantile hemangiomas (IH) in children.Materials and methods: A case-control study was conducted. For the purposes of the researched target group, samples of fifty (N=50) children with IH were used. The control group consisted of one hundred (N=100) healthy children of comparable age and gender without IH and vascular malformations. The control group was divided into phase 1, corresponding to the proliferation of the examined group, and phase 2, corresponding to the involution of the examined group. An immunoassay (ELISA) was used to determine urinary bFGF values.Results: Comparison of bFGF values in the phases of proliferation and involution in the group of IH did not show a statistically significant difference (p=0.893). In the control group during the 1st phase significantly more subjects had urinary bFGF values ≥0.31 compared to the 2nd phase (P=0.003). In proliferation phase of IH, i.e. in phase 1 of the control, significantly more subjects in the control group had urinary bFGF values ≥0.31 (the lowest value that was detectable on the device): 24.0% vs. 4.0% ; P=0.008. The urinary bFGF level in the involution phase IH compared to the examined and control group did not show statistically significant difference (P=0.617).Conclusion: This study did not show the significance of the urinary bFGF determination in the diagnosis, treatment and follow-up children with IH.
Cilj ove studije bio je pokazati ulogu angiogeneze i CD44 u glioblastomu (glioblastoma multiforme, GBM). Kao što su recentne studije pokazale da izraženost CD44 u nekim tumorima ima prognostičku ...vrijednost, postoje pojedini dokazi da je povećana izraženost CD44 povezana s lošijom prognozom bolesnika s glioblastomom. Poznato je da je CD44 široko izražen transmembranski stanični protein uključen u mnoge fi ziološke i patološke procese (adhezija matriksa, navođenje i aktivacija limfocita, cijeljenje rana, stanični rast, preživljavanje i migracija stanica, rast i metastaziranje tumora I dr.). Postoji veći broj potencijalnih mehanizama kojima CD44 može promicati malignost, npr. CD44 modulira čimbenike koji mogu dopustiti pokretanje tumora i metastatsku kaskadu (prianjanje, pokretljivost, degradacija matriksa, proliferacija i stanično preživljavanje). Specifi čno gledano, CD44 veže nekoliko izvanstaničnih tvari (hijaluronska kiselina, kolagen, fibronektin, osteopontin) što može olakšati vezanje i naknadni rast tumorskih stanica na drugim mjestima i izraženost CD44. S druge strane, pronađeno je da manja izraženost CD44 može biti povezana s većom vjerojatnošću recidiva i posljedično lošijim ishodom, što je potkrijepljeno praćenjem bolesnika s recidivom glioblastoma koji imaju bolje preživljavanje kod veće izraženosti CD44. Prema tome, veća izraženost CD44 vidljiva je u težim oblicima tumora, dok niže razine CD44 mogu ukazivati da su maligne stanice rezistentnije na kemoterapijske tvari.
Human SOX18 gene belongs to the family of SOX genes that encode DNA-binding
proteins, which display properties of both transcription factors and
architectural components of chromatin. SOX18 gene ...plays important role in
vascular development, endothelial cell specification and differentiation,
angiogenesis and lymphangiogenesis. Mutations in human SOX18 gene are
associated with Hypotrichosis-Lymphedema-Talengiectasia syndrome,
characterized by defects in hair, vascular and lymphatic development. Despite
the mounting evidence that SOX18 gene is an important player in
vasculogenesis, angiogenesis and lymphangiogenesis, little is known about
molecular mechanisms involved in the regulation of its expression. The aim of
this study was to investigate transcriptional regulation of the human SOX18
gene expression, as well as the effecs of pro- and anti-angiogenic factors on
SOX18 expression in endothelial cells. Analyses of transcriptional regulation
included identification of transcription factors that are involved in
regulation of SOX18 promoter activity, as well as in regulation of endogenous
SOX18 expression. Two model systems were used: HeLa cells, as a tumor model
system, and EA.hy926 cells, as an endothelial model system. Several putative
transcription factor binding sites were identified by in silico analysis of
the SOX18 promoter sequence. Transcription factors Sp3, ZBP-89, NF-Y and EGR1
were selected for further functional analysis. By in vitro binding assays,
functional/mutagenesis assays and analyses of endogenous SOX18, it has been
shown that transcription factors Sp3 and ZBP-89 act as negative regulators,
while NF-Y and EGR1operate as positive regulators of SOX18 gene expression.
These results gave first functional link between Sp3, ZBP-89, NF-Y and EGR1
transcription factors and SOX18 gene, thus providing better understanding of
transcriptional regulation of SOX18 gene expression. Considering that
processes of vasculogenesis and angiogenesis are under control of many
various factors including growth factors, cytokines, adhesion molecules and
endogenous inhibitors , further investigation included analysis of the effect
of selected pro- and anti-angiogenic factors on SOX18 expression in
endothelial model system. Treatment of endothelial cells with selected
factors, followed by Western blot analyses revealed that vascular endothelial
growth factor (VEGF) and tumor necrosis factor (TNF), increases the level of
SOX18 protein. By this it has been shown that SOX18 expression is under
control of VEGF and TNF signaling pathways. On the other hand, treatment with
selected non-steroidal anti-inflamatory drugs (NSAID), led to strong decrease
in SOX18 protein level. Taken together, these results open the possibility of
pharmacological manipulation of SOX18 gene expression.
Humani SOX18 gen pripada familiji SOX gena koji kodiraju DNK-vezujuće
proteine koji imaju ulogu transkripcionih faktora i arhitektonskih komponenti
hromatina. SOX18 gen ima važnu ulogu u regulaciji vaskularnog razvića, i
učestvuje u specifikaciji i diferencijaciji endotelijalnih ćelija,
angiogenezi i limfangiogenezi. Mutacije u SOX18 genu kod čoveka su povezane
sa sidromom Hipotrihoza-Limfedem-Talengiektazija (eng.
Hypotrichosis-Lymphedema-Talengiectasia) čije su karakteristike poremećaji u
razviću dlake, vaskularnog i limfnog sistema. Iako do danas ima dosta
podataka o ulozi SOX18 gena u procesima vaskularogeneze, angiogeneze i
limfangiogeneze, još uvek se malo zna o molekularnim mehanizmima uključenim u
regulaciju ekspresije ovog gena. Osnovni ciljevi, istraživanja predstavljenog
u ovoj tezi, bili su analiza transkripcione regulacije ekspresije humanog
SOX18 gena, kao i analiza uticaja pro-angiogenetskih faktora i inhibitora
angiogeneze na ekspresiju ovog gena u endotelijalnim ćelijama. Ispitivanja
transkripcione regulacije su obuhvatala analizu uloge određenih
transkripcionih faktora u regulaciji aktivnosti SOX18 promotora, kao i u
regulaciji endogene ekspresije SOX18 gena. Transkripciona regulacija je
ispitivana u dva model sistema: HeLa ćelijama, koje su korišćena kao tumorski
model sistem i EA.hy926 ćelijama, koje su korišćene kao endotelijalni model
sistem. In silico analizom su identifikovana potencijalna vezivna mesta za
različite transkripcione faktore koji mogu biti uključeni u regulaciju
ekspresije SOX18 gena. Za dalju funkcionalnu analizu odabrani su
transkripcioni faktori Sp3, ZBP-89, NF-Y i EGR1. Na osnovu eksperimenata
smanjene elektroforetske pokretljivosti, funkcionalnih/mutacionih analiza, i
analiza ekspresije u nativnom kontekstu, pokazano je da su transkripcioni
faktori Sp3 i ZBP-89 negativni, a NF-Y i EGR1 pozitivni regulatori
transkripcije humanog SOX18 gena. Na ovaj način pokazana je funkcionalna veza
između transkripcionih faktora Sp3, ZBP-89, NF-Y i EGR1 i SOX18 gena i
omogućeno je bolje razumevanje, dela, transkripcione kontrole ekpresije ovog
gena. Polazeći od predpostavke da su procesi vaskularogeneze i angiogeneze
kontrolisani velikim brojem različitih faktora, uključujući faktore rasta,
citokine, adhezione molekule i endogene ihibitore, deo istraživanja se
odnosio na analizu uticaja odabranih pro- i anti-angiogenetskih faktora na
ekspresiju SOX18 proteina u endotelijalnom model sistemu. Tretman
endotelijalnih ćelija sa određenim faktorom, a potom analiza uticaja na nivou
SOX18 proteina, pokazao je da su vaskularni endotelijalni faktor rasta (еng.
vascular endothelial growth factor-VEGF ) i tumorski faktor nekroze (еng.
tumor necrosis factor-TNF) odgovorni za povećanje nivoa SOX18 proteina u
endotelijalnim ćelijama. Na ovaj način je pokazano da je SOX18 pod uticajem
VEGF i TNF signalnih puteva, koji stimulišu angiogenezu. Sa druge strane,
nesteroidni antiinflamatorni lekovi (eng. nonsteroidal antiinflamatory
drugs-NSAID) dovode do izraženog smanjenja u nivou SOX18 proteina u
endotelijalnim ćelijama. Dobijeni rezultati otvarajući mogućnost za
potencijalnu farmakološku manipulaciju ekspresijom SOX18 gena.
Brown adipose tissue (BAT) is highly specialized mammalian organ and is more
abundant in hibernating, cold-acclimated and newborn mammals, where it plays
key role in thermogenesis. The BAT function ...is related to uncoupling protein
1 (UCP1), located in the inner mitochondrial membrane. Cold expossure
activates sympathetic nervous system which triggers BAT thermogenic program.
This complex process on biochemical, morphological and cell levels includes:
increased UCP1 expression, precursor cells proliferation and differentiation,
mitochondrial and peroxisomal biogenesis, and angiogenesis. Those events
rapidly transform ,,dormant" tissue into a hyperplastic, active adipose
organ. All changes are controled by numerous transcription factors which
coordinate expression of many proteins responsible for acquiring of mature
brown adipocyte phenotype. The aims of this study were to determine the
molecular mechanisms that underlie the process of BAT activation,
transcription factors and proteins involved in the early stages of
proliferation and differentiation in rats exposed to cold, as well during BAT
development. Mill Hill rats were exposed to cold (4±1°C) for 3, 6, 12, 24,
48 and 72 hours. Interscapular BAT was isolated and prepared for qRT-PCR,
Western blot analisys, light and transmision electron microscopy. To study
the expression of transcription factors and proteins involved in BAT
development, tissue samples from human fetuses XV-XXIII weeks old were
prepared for Western blot analisys, light and transmision electron
microscopy. The result showed that BAT hiperplastic response is based on the
proliferation of brown adipocyte precursors and endothelial cells, and that
this process is under tight control of many transcription factors. Morever,
this process is strongly coordinated by expression of key regulators of BAT
thermogenic respons: UCP1, PPARγ (peroxisome proliferator activated receptor
γ) and PGC-lα (PPARγ coactivator-lα) in both rats and human BAT. In addition,
there is evident synchronization of gene and protein expression involved in
adipogenesis and angiogenesis with ultrastructural changes observed in the
tissue. All of the above changes were followed by structural changes of
extracellular matrix, to ensure proper tissue growth and expansion. Taken
together, the results show that BAT amazing plasticity which enables rapid
tissue termogenic response is strongly controlled by transcription factors
network in both, cold-induced BAT hyperplasia and fetal BAT development.
Mrko masno tkivo {engl, brown adipose tissue, BAT) je specijalizovano za
produkciju toplote zahvaljujući prisustvu dekuplujućeg proteina engl
uncoupling protein 1, UCPl) koji se nalazi u unutrašnjoj membrani
mitohondrija. Kada je stimulisano, BAT se transformiše vz neaktivnog,
dormantnog oblika u hiperplastični, termogeno aktivni organ. Izlaganje
hladnoći dovodi do biohemijskih, morfoloških i citoloških promena u tkivu.
Povećava se ekspresija UCPl, sinteza proteina i DNK, kao i proces biogeneze
mitohondrija i peroksizoma. Pored toga, indukcija termogeneze dovodi do
povećanja mase BAT, pre svega na račun njegove hiperplazije. Proces
adipogeneze, usko povezan sa procesom angiogeneze se odvija kroz nekoliko
stupnjeva i podrazumeva proliferaciju i diferencijaciju prekusorskih ćelija
prisutnih u BAT. Sve navedene promene su pod kontrolom mreže transkripcionih
faktora koji koordinišu ekspresiju brojnih proteina odgovornih za stvaranje
krajnjeg fenotipa mrkih adipocita. Iako su do sada identifikovani brojni
transkripcioni faktori uključeni u proces hiperplastičnog odgovora, nema
dovoljno podataka o njihovoj ekspresiji tokom ranih faza izlaganja hladnoći.
Cilj ovog istraživanja je bio da utvrdi molekulske mehanizme koji se nalaze u
osnovi procesa aktivacije BAT, transkripcione faktore i proteine uključene u
rane faze proliferacije i diferencijacije BAT kod pacova izlaganih hladnoći
kao i tokom u razvoja humanog BAT u fetalnom periodu. U tu svrhu, pacovi soja
Mill Hill su podeljeni u sedam eksperimentalnih grupa, od kojih je jedna bila
kontrolna dok je preostalih šest izlagano hladnoći (4 ± 1°C) u periodu od 3,
6, 12, 24, 48 i 72 sata. Interskapularni depo BAT pacova je izolovan i
pripremljen za RT-PCR i Western blot analizu, svetlosnu i elektronsku
mikroskopiju. Za ispitivanje ekspresije transkripcionih faktora i
proteina ukljućenih u razvoj BAT čoveka korišćeni su uzorci humanih fetusa
starosti XV-XXIII nedelje, pripremljeni za Western blot analizu, svetlosnu i
elektronsku mikroskopiju. Rezultati su pokazali da se u osnovi povećanja mase
tkiva najvećim delom nalazi hiperplazija prekursorskih i endotelskih ćelija i
da je ovaj proces pod strogom kontrolom transkripcionih faktora. Šta više,
pokazana je stogo koordinisana ekspresija ključnih regulatora termogenog
odgovora UCPl, PPARγ {engl peroxisome proliferator-activated receptor γ) i
PGC-la (engl. PPARγ -coactivator lα) u BAT pacova i humanih fetusa. Pored
toga, uočena je sinhronizacija genske i proteinske ekspresije regulatornih
proteina procesa adipo- i angiogeneze, što je praćeno odgovarajućim
strukturnim promenama tkiva. Sve napred navedene promene praćene su
ultrastrukturnim promenama vanćelijskog matriksa u cilju omogućavanja rasta
tkiva.
PDF
