The replacement of fruit allergen extracts with component-resolved allergens
seems to be a promising concept. In this regard, the evaluation of allergenic
properties of a particular allergen ...candidate for component-resolved
diagnosis needs to be performed. In this study evaluation of the biochemical
and allergenic properties of cysteine proteinase inhibitor purified from
green kiwifruit (nCPI) was performed. The IgE reactivity was detected both in
vitro (dot blot) and in vivo (skin prick test and basophile activation
assay), while IgG rectivity in both Western blot analysis nd ELISA test.
Biological activity was assesed by examining the growth inhibition of three
plant pathogenic bacterial strains (A.tumefaciens, B. cepacia and, to a
lesser extent, E. carotovora) and two phytopathogenic fungi (A. radicina and
B. cinerea) both in vitro and in vivo. Due to low abundance of nCPI molecule
in kiwifruit the coding sequence of kiwi CPI was efficiently expressed in
Escherichia coli. Molecular identity of rCPI to its natural counterpart has
been clearly demonstrated in structural (mass fingerprint), immunological
(immunoblot and ELISA inhibition) and biological sense (inhibition of papain
proteolytic activity and antifungal activity). Based on the obtained results
it is clear that nCPI is a clinically relevant kiwifruit allergen, and as
such should be involved in the component-resolved diagnosis of kiwifruit
allergy. Standard immunotherapeutic approaches in food allergy are not
adequate due to unacceptably high risk-to-benefit ratio, however
hypoallergenic forms of molecules with reduced IgE binding potential seem to
be promising concept. Diversification of the gene encoding the mature form of
the actinidin was done via error prone PCR, followed by cloning of the
library into the Aga2 yeast surface display expression system. After three
rounds of sorting by FACS, randomly picked colonies were further analyzed by
dot blot and ELISA using pool of 6 kiwifruit allergic patients. Compared to
both natural and recombinant wild type actinidin two of the mutants exhibited
diminished ability to activate basophils. This kind of mutational analysis
could be a useful technique in the development of vaccines for allergy
therapy, since substitution or deletion of amino acids within the IgE binding
epitopes could result in reduction or elimination of the anaphylactic
potential of the molecule.
SA Zamena alergenih ekstrakata pojedinačnim prirodnim i rekombinantnim
alergenima u dijagnostici alergije je obećavajući koncept i naziva se
dijagnostika razdvojena na komponente CRD (engl. component-resolved
diagnosis). U tom smislu, neophodno je proceniti alergeni potencijal svakog
pojedinačnog kandidata za primenu u CRD. U ovoj tezi ocenjivane su
biohemijske i alergene osobine cistein proteaznog inhibitora (nCPI) iz ploda
zelenog kivija. Prečišćeni nCPI pokazao je IgE reaktivnosti in vitro (dot
blot) i in vivo (kožne probe i aktivacija bazofila), dok je IgG reaktivnost
pokazana u Western blotu i ELISA-i. Biološka aktivnost je ocenjena
ispitivanjem antimikrobnog potencijala nCPI naspram tri soja fitopatogenih
bakterija (A. tumefaciens, B. cepacia i u manjem obimu bakterije E.
carotovora) kao i dva izolata fitopatogenih gljiva (A. radicina i B.cinerea),
kako in vitro, tako i in vivo. Zbog slabe zastupljenosti nCPI u plodu kivija
kodirajuća sekvenca nCPI je efikasno eksprimirana u Escherichia coli.
Molekulska identičnost rCPI u odnosu na prirodni molekul pokazana je
strukturnim (maseni otisak prsta) i imunohemijskim (imunoblot i ELISA) i
biološkim (inhibicija proteazne aktivnosti papaina i rasta fitopatogenih
gljiva) testovima. Na osnovu dobijenih rezultata jasno je da je CPI klinički
relevantan alergen i kao takav trebalo bi da bude uključen u dijagnostiku
alergije na kivi razdvojenu na komponente. Standardni imunoterapijski pristup
u tretmanu alergije na hranu nije adekvatan zbog visokog rizika, pa je
primena hipoalergenih molekula koji smanjeno vezuju IgE obećavajući koncept.
Diverzifikacija gena za aktinidin rađena je lančanom reakcijom polimeraze
sklone greškama epPCR (engl. error-prone PCR) koja je praćena kloniranjem
biblioteke u Aga2 ekspresioni sistem za ekspresiju na površini ćelija kvasca.
Nakon tri runde sortiranja, nasumično odabrani klonovi su dalje analizirani
dot blotom i ELI
Zamena alergenih ekstrakata pojedinačnim prirodnim i rekombinantnim
alergenima u dijagnostici alergije je obećavajući koncept i naziva se
dijagnostika razdvojena na komponente CRD (engl. component-resolved
diagnosis). U tom smislu, neophodno je proceniti alergeni potencijal svakog
pojedinačnog kandidata za primenu u CRD. U ovoj tezi ocenjivane su
biohemijske i alergene osobine cistein proteaznog inhibitora (nCPI) iz ploda
zelenog kivija. Prečišćeni nCPI pokazao je IgE reaktivnosti in vitro (dot
blot) i in vivo (kožne probe i aktivacija bazofila), dok je IgG reaktivnost
pokazana u Western blotu i ELISA-i. Biološka aktivnost je ocenjena
ispitivanjem antimikrobnog potencijala nCPI naspram tri soja fitopatogenih
bakterija (A. tumefaciens, B. cepacia i u manjem obimu bakterije E.
carotovora) kao i dva izolata fitopatogenih gljiva (A. radicina i B.cinerea),
kako in vitro, tako i in vivo. Zbog slabe zastupljenosti nCPI u plodu kivija
kodirajuća sekvenca nCPI je efikasno eksprimirana u Escherichia coli.
Molekulska identičnost rCPI u odnosu na prirodni molekul pokazana je
strukturnim (maseni otisak prsta) i imunohemijskim (imunoblot i ELISA) i
biološkim (inhibicija proteazne aktivnosti papaina i rasta fitopatogenih
gljiva) testovima. Na osnovu dobijenih rezultata jasno je da je CPI klinički
relevantan alergen i kao takav trebalo bi da bude uključen u dijagnostiku
alergije na kivi razdvojenu na komponente. Standardni imunoterapijski pristup
u tretmanu alergije na hranu nije adekvatan zbog visokog rizika, pa je
primena hipoalergenih molekula koji smanjeno vezuju IgE obećavajući koncept.
Diverzifikacija gena za aktinidin rađena je lančanom reakcijom polimeraze
sklone greškama epPCR (engl. error-prone PCR) koja je praćena kloniranjem
biblioteke u Aga2 ekspresioni sistem za ekspresiju na površini ćelija kvasca.
Nakon tri runde sortiranja, nasumično odabrani klonovi su dalje analizirani
dot blotom i ELISA testom koristeći serum 6 osoba alergičnih na kivi U
poređenju sa prirodnim i rekombinantnim aktinidinom, dva mutanata su pokazala
smanjenu sposobnost aktivacije bazofila. Ovakav tip mutacione analize mogao
bi da bude korisna tehnika u razvoju vakcina za terapiju alergije, s obzirom
da supstitucija ili delecija aminokiselina u IgE vezujućim epitopima može da
smanji ili eliminiše anafilaktički potencijal molekula.
En la patogénesis de las enfermedades alérgicas están involucrados el ambiente, la carga genética y la inmunocompetencia del individuo. Continuamente nuestro sistema inmune está expuesto a numerosas ...proteínas, sin embargo, solo unas pocas inducen una respuesta inmune alérgica. El potencial intrínsico de una proteína alergénica para inducir sensibilización solo se manifiesta en individuos susceptibles, genéticamente condicionados a presentar respuestas atópicas. Muchas de estas proteínas alergénicas comparten alguna homología en su secuencia de aminoácidos. Estos alérgenos poseen un amplio rango de características moleculares, ninguna de las cuales es única solo para estas proteínas alergénicas. A pesar de esto, algunas de estas características son más comunes entre algunos alérgenos que con otras proteínas. Se ha demostrado que algunas proteínas con actividad enzimática inducen reacciones alérgicas y que esta propiedad biológica está asociada con su actividad catalítica. En la presente revisión se describen las principales características moleculares de las proteínas alergénicas, y se hace énfasis en la cistein proteasas de los ácaros intradomiciliarios, en razón a que ellas son un factor de riesgo en el desarrollo de una respuesta inmune alérgica en individuos susceptibles y se constituyen en factores desencadenantes de respuestas inflamatorias en la fisiopatología de las enfermedades alérgicas respiratorias.
The use of plants in medical treatment and nutrition is as old as human history itself. The skills for treatment using plants have been developed in all nations of the world and have been maintained ...more or less up to the present day. Developed countries show the tendency to increase use of phototherapy in recent years. Scientific interest in the curative properties of garlic begins in the second half of the nineteenth century, when Louis Pasteur found out that this herb inhibits the growth and reproduction of certain strains of bacteria. The garlic has been subject to ongoing scientific research since then. This study examined the antimicrobial activity of aqueous extract of garlic cultivated in Šumadija region and its main active principle of allicin and some organosulfur compound constituents of plants Alium sativum L., soluble in water derivatives of cysteine on gram- negative bacteria Eserihia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 and gram- positive bacteria Staphylococcus aureus ATCC 43300, Bacillus subtilis ATCC 11774. Measurement and quantification of antimicrobial activity were determined using surface disk diffusion method on Mueller Hinton agar substrate with the use of Motic Images Plus 2.0 ML software on pure bacterial cultures. The 115 antibiotic gentamicin is reference substance and is used in all experiments as a control. The garlic extract and its strongest active constituent of allicin has showed the expected antimicrobial activity, but also the constituent N-acetyl-L-cysteine has showed the effect on all bacterial strains used for this study. N-acetyl-L-cysteine demonstrated greater antimicrobial effect on gram-positive bacteria tested than gram- negative bacteria. The presumption of resulting antimicrobial effect of gram negative bacteria would be that the thiol group reacts first with lipopolysaccharide layer and only then with the capsule polysaccharides known as glycocalyx and differences in the structure of the cell wall directly affect the resulting value of the inhibition zone. The results of our study would be able to confirm this hypothesis where the minimum inhibitory activity was significantly lower than the values obtained for gram-negative bacteria. Determining the diameter of the inhibition zone, minimum inhibitory concentration, or more precisely determine the antibacterial effect of garlic extract and the identification and assessment of the N-acetyl-L cysteine as a group of active substances which are present in garlic could contribute significantly to a better understanding of the scope of antimicrobial activity of garlic. The fact that N-acetyl-cysteine beside allicin has direct antimicrobial potential on bacterial species examined in the study could be the basis for the development of new therapeutic antimicrobial agents. This also can be used to expand the indications of existing drugs. It is known that N-acetyl-L-cysteine is now used as mucolytic. This work shows that its direct antimicrobial activity may potentially cause the fundamental changes in therapy with respiratory infections patients, to improve therapeutic efficacy and security.
Upotreba biljaka u lečenju i ishrani stara je koliko i sama ID istorija ljudskog roda. Veština lečenjem biljem razvijala se kod svih naroda sveta i sačuvala se manje ili više sve do današnjih dana uz tendeciju porasta primene fitoterapije u ekonomski razvijenim zemljama poslednjih godina. Naučni interes za lekovitost belog luka počinje u drugoj polovini XIX veka kada je Luj Paster utvrdio da ova biljka sprečava rast i razmnožavanje određenih sojeva bakterijsih vrsta i od tada je predmet stalnih naučnih istraživanja. U ovom radu ispitivana je antimikrobna aktivnost vodenog ekstrakta belog luka gajenog sa područja Šumadije, glavnog aktivnog principa alicina kao i nekih organosumpornih jedinjenja konstituenasa biljke Alium Sativum L., rastvornih u vodi derivata cisteina, na gram-negativne bakterije Eserihia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 i gram-pozitivne bakterije Staphylococcus aureus ATCC 43300, Bacillus subtilis ATCC 11774. Merenja i kvantifikovanje antimikrobnog dejstva su bila određena korišćenjem površinskog disk difuzionog metoda na Mueller Hinton agarnoj podlozi uz primenu aplikativnog softvera Motic images plus 2.0 ML na čistim bakterijskim kulturama i referentnom supstancom antibiotikom gentamicinom korišćenog u svim eksperimentima kao kontrola. Očekivanu antimikrobnu aktivnost je ispoljio ekstrakt belog luka i najači aktivni princip alicin, ali je 112 istovremeno i konstituens N-acetil-L-cistein takođe ispoljio efekat na sve u radu ispitivane bakterijske sojeve. N-acetil-L- cistein je veći antimikrobni efekat pokazao na ispitivane gram- pozitivne nego na gram-negativne bakterijske vrste. Pretpostavka za dobijeni antimikrobni efekat kod gram negativnih bakterija bi bila da tiolna grupa reaguje prvo sa lipopolisaharidnim slojem pa tek nakon toga sa kapsulnim polisaharidima poznatih kao glikokaliks, odnosno da razlike u strukturi ćelijskog zida direktno utiču na dobijene vrednosti zone inhibicije. Dobijeni rezultati naše studije upravo bi mogli da potvrde ovu pret- postavku gde je minimalna inhibitorna aktivnost bila znatno niža od vrednosti dobijenih za gram-negativne bakterije. Određivanje prečnika zone inhibicije, minimalne inhibitorne koncetracije, preciznije određivanje antibakterijskog efekta ekstrakta belog luka kao i neposredno utvrđivanje da i konstituens N-acetil-L-cistein pripada grupi aktivnih principa koji su prisutni u belom luku bi mogli da doprinesu znatno boljem razumevanju obima antimikrobnog dejstva belog luka. Činjenica da pored alicina i N-acetil-L-cistein poseduje direkni antimikrobni potencijal na ispitivane bakterijske vrste u studiji bi mogla biti osnov za izradu novih lekovitih antimikrobnih preparata kao i za proširenje indikacija postojećih lekova. Poznato je da se N-acetil-L-cistein sada već koristi kao mukolitik, a u ovom radu je pokazano da njegovo direktno antimikrobno dejstvo može uticati na potencijalno korenite promene u načinu primene terapije kod pacijenata sa respiratornim infekcijama, u cilju unapređenja terapijske efikasnosti i bezbednosti.
Dental pulp originates from the embryonic ectomesenchyme and represents potentially important source of mesenchymal stem cells (MSCs) with the ability to regenerate all tissues of the craniofacial ...region, originating from the ectomesenchyme, too. N-acetyl-L-cysteine (NAC) is an antioxidant that may have an impact on the therapeutic use of MSCs. The aim of this study was to determine whether the cells isolated from the dental pulp of children deciduous teeth of children and expanded in vitro, have the characteristics of MSC, to examine the effect of NAC on their proliferation and differentiation and to determine whether NAC influences the metabolism of glucose, the activity of antioxidant enzymes and whether it reduces oxidative damage of various cellular macromolecules. The initial cell population was obtained from six pulps of deciduous teeth using ex vivo tissue explants method. The number of colonies (Colony Forming Unit – Fibroblast; CFU-F) was determined by seeding the low density cell culture. Proliferative potential and population doubling time of the cells in culture were followed by counting the cells after tripsinization of subconfluent cultures, every 4 days, respectively, during 40 days of cultivation. Flow cytometry was used for cell immunophenotypisation, aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity determination, number of cells in different phases of cell cycle, number of cell divisions and percentage of cells in apoptosis. Activity of β-galactosidase (SA-β-Gal), was determined using cytochemistry. Osteogenesis, chondrogenesis and adipogenesis were induced using complete commercial mediums. Osteogenic differentiation was monitored via alkaline phosphatase activity (spectrophotometry), deposition of calcium in the extracellular matrix (Alizarin red staining) and the appearance of osteocalcin (immunocytochemistry). Chondrogenic differentiation was followed by measuring collagen type I (in situ hybridization), collagen type 2 (immunohistochemistry) and the determination of the concentration of glycosaminoglycans (spectrophotometry). Adipogenic differentiation was examined by visualization of fat droplets (Oil Red O staining). Activity of catalase and superoxide dismutase (SOD) in cell lysates was determined spectrophotometrically. Malondialdehyde (MDA) was determined by reaction with thiobarbituric acid (TBA). Carbonyl derivatives of proteins were determined by reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine. After total lipid extraction and methylation of fatty acids, fatty acid methyl esters were separated by gas-liquid chromatography, and the concentration of saturated fatty acids, monounsaturated fatty acids and polyunsaturated fatty acids was expressed as percentage of total fatty acids detected in the sample. Isoenzyme forms of lactate dehydrogenase (LDH1, LDH2, LDH3, LDH4 and LDH5) were determined by vertical electrophoresis. All the above measurements were made with and without different concentrations of NAC (0,1 mM, 1 mM and 2 mM). Our results showed that the dental pulp of deciduous teeth of children had population of cells that formed a significant number of CFU-F (4% of the isolated cells) and continually proliferated for 40 days without decrease in the population doubling time. However, the resulting cell population was heterogeneous in terms of the division velocity. After three days of cultivation, around 12% of the cells were divided less than four times, while the remaining cells divided more than four times. Viability of cells was in average 95%, and only 3% of the cells were positive for β-galactosidase. During the entire time of the cultivation, expanded cells retained the ability to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes. Almost all cells expressed CD44, CD73, collagen type I, CD29, CD90 and osteonectin. Part of the cells expressed STRO-1, CD146 and CD106. Marker of hematopoietic stem cells have not been detected. Elevated ALDH activity ranged from 4% to 24% and was negatively correlated with the population doubling time. Our results showed that the effect of NAC on isolated cells dependeds on its concentration. In fact, after 72 hours of application of lower NAC concentrations (0,1 mM and 1 mM) the number of cells in culture increased by 20%, most probably due to the acceleration of the cell cycle of a small population of cells. Application of 2 mM NAC decreased the number of cells in culture. In addition, the growing concentration of NAC stimulated osteogenesis and chondrogenesis and inhibited adipogenesis. Also, the application of 0,1 mM NAC increased the percentage of cells which expressed high ALDH activity, and reduced the percentage of SA-β-gal positive cells. Application of 2 mM NAC led to an increase in the number of SA-β-gal positive cells. Lower concentrations of NAC reduced oxidative damage to various cellular macromolecules (reduced lipid peroxidation and the formation of carbonyl derivatives of proteins), and this was accompanied by reduced activity of SOD and catalase. In addition, it was shown that by adding 0,1 mM NAC the activity of LDH isoforms 4 and 5 increased, which could indicate an increase in the glycolitic activity, and at least in part explain the rapid proliferation of cells. After a comprehensive review of our results, we could conclude that by the method we applied, we isolated heterogeneous population of cells from the pulp of children deciduous teeth. Isolated cells had characteristics of dental pulp stem cells. Lower concentrations of NAC stimulated proliferation of cells in culture, reducing their oxidative damage and possibly increasing the volume of glycolysis, while all concentrations of NAC stimulated osteogenesis and chondrogenesis. We believe that the low concentration of NAC could find application in dental pulp stem cell expansion protocols, esspecially if necessary to stimulate their differentiation toward osteoblasts and chondrocytes.
Zubna pulpa vodi poreklo od embrionalnog ektomezenhima i potencijalno je važan izvor mezenhimalnih matičnih ćelija (MMĆ) za regeneraciju svih tkiva kraniofacijalne regije koja su, takođe, poreklom od ektomezenhima. N-acetil-L-cistein (NAC) je antioksidant koji može da ima uticaj na terapijsku primenu MMĆ. Cilj ovog rada je bio da utvrdi da li ćelije izolovane iz zubne pulpe mlečnih zuba dece i ekspandirane in vitro, imaju karakteristike MMĆ i da ispita dejstvo NAC-a na njihovu proliferaciju i diferencijaciju, kao i da se utvrdi da li NAC utiče na aktivnost enzima antioksidativne zaštite, oksidativno oštećenje različitih ćelijskih struktura i metabolizam glukoze. Metodom tkivnog eksplanta, iz šest pulpi mlečnih zuba dece, je dobijena početna populacija adheretnih ćelija. Za procenu broja CFU-F (eng. Colony Forming Unit – Fibroblast), ćelije su zasejavane u maloj gustini. Proliferativni potencijal i vreme udvajanja broja ćelija u kulturi je praćeno brojanjem ćelija posle tripsinizacije subkonfluentnih kultura, svaka 4 dana, tokom 40 dana. Protočna citometrija je korišćena za imunofenotipizaciju ex vivo umnoženih ćelija, određivanje aktivnosti aldehid- dehidrogenaze (ALDH), brzinu ulaska ćelija u sintetsku (S) fazu ćelijskog ciklusa, određivanje broja ćelijskih deoba i detekciju apoptoze. Aktivnost -galaktozidaze (SA-β-Gal), određivana je korišćenjem citohemije. Diferencijacija ekspandiranih ćelija u smeru osteogeneze, hondrogeneze i adipogeneze izvedena je korišćenjem komercijalnih medijuma. Promene na ćelijama tokom osteogene diferencijacije su praćene preko aktivnosti alkalne fosfataze spektrofotometrijski, deponovanja kalcijuma u ekstracelularni matriks (bojenje alizarin crvenim) i pojave osteokalcina (imunocitohemija). Hondrogena diferencijacija u peletama je praćena određivanjem kolagena tip I (in situ hibridizacija), kolagena tip 2 (imunohistohemija) i određivanjem koncentracije glikozaminoglikana (spektrofotometrija). Adipogena diferencijacija je ispitana vizuelizacijom masnih kapljica (Oil red O bojenje). Aktivnost katalaze i superoksid-dismutaze (SOD) u ćelijskom lizatu je određena spektrofotometrijski. Koncentracija malondialdehida (MDA) je određena reakcijom sa tiobarbiturnom kiselinom (TBA). Karbonilni derivati proteina određivani su reakcijom sa 2,4 -dinitrofenilhidrazinom. Posle ekstrakcije ukupnih lipida i metilovanja masnih kiselina, metil-estri masnih kiselina su razdvajani gasno-tečnom hromatografijom (GLC), a koncentracija zasićenih (SFA), mononezasićenih (MUFA) i i polinezasićenih masnih kiselina (PUFA) je izražena procentualno u odnosu na ukupne masne kiseline. Izoenzimski oblici laktat-dehidrogenaze (LDH1, LDH2, LDH3, LDH4 i LDH5) su odreĊivani vertikalnom elektroforezom. Sva navedena merenja su izvedena bez i sa različitim koncentracijama NAC-a (0,1 mM, 1 mM i 2 mM). Naši rezultati su pokazali da je iz zubne pulpe mlečnih zuba dece dobijena populacija ćelija koja formira značajan broj CFU-F (4% izolovanih ćelija) i kontinuirano proliferiše tokom 40 dana, bez opadanja vremena potrebnog za udvajanje njihovog broja u kulturi. Ipak, dobijena populacija ćelija je bila heterogena po brzini deoba. Oko 12% ćelija je posle tri dana kultivacije bilo podeljeno manje od četiri puta, dok se ostatak ćelija podelio više od četiri puta. Vijabilitet ćelija je bio u proseku oko 95%, a svega 3% ćelija je bilo pozitivno na β-galaktozidazu. Tokom čitavog vremena kultivacije kapacitet za diferencijaciju u osteoblaste, adipocite i hondrocite se nije menjao. Gotovo sve ćelije su u pasaži četiri eksprimirale CD44, CD73, kolagen tipa I, CD29, CD90 i osteonektin. Deo ćelija je eksprimirao STRO-1, CD146 i CD106. Marker matičnih ćelija hematopoeze nije detektovan u našem sistemu kultivacije. Opseg u kome se kretao procenat ćelija koje pokazuju povišenu aktivnost ALDH je iznosio od 4% do 24% i bio je u negativnoj korelaciji sa vremenom udvajanja ćelija u kulturi. Naši rezultati su pokazali da uticaj NAC-a na izolovane ćelije zavisi od njegove koncentracije. Naime, posle 72 sata od primene nižih koncent
Food allergy is an IgE mediated reaction of the immune system to food components, most commonly to food proteins. Food allergies develop after primary sensitization through the gastrointestinal tract ...and the mechanism behind this route of sensitization has not yet been elucidated. It has been postulated that in order to sensitize the organism through an oral route, food allergens must reach the gastrointestinal mucosa in at least a partially intact form in order to interact with the immune system. In addition to the unclear mechanism of sensitization, food allergies also present a challenge in the field of diagnostics, while the only effective therapy method to date is the strict avoidance of allergenic substances. During the last 30 years, since its first appearance on the world market, kiwifruit has become one of the more popular components of human nutrition, and yet, at the same time, it has emerged as one of the ten most frequent elicitors of allergic reactions to food. Actinidin, a cysteine protease from the papain family, is the most abundant protein in the pulp of kiwifruit and is considered the major allergen of this fruit. In this thesis the structural and immunological characteristics of actinidin were examined in order to shed light on the mechanism of oral sensitization and to aid in the improvement of kiwifruit allergy diagnosis. It was shown that actinidin purified from fresh kiwifruit under native conditions represents a mixture of the active and inactive enzyme. Differences in electrophoretic mobility, IgE binding in immunoblot and patient response in skin prick tests were shown for proteolytically active and inhibited actinidin. It was demonstrated that only the active enzyme survives conditions of simulated gastric and intestinal fluid while preserving its immunogenicity and proteolytic activity. The observed differences between the active and inhibited form of actinidin are most likely a consequence of differences in the conformation of the enzyme that arise upon inhibition, a hypothesis supported by results from CD spectroscopy and fluorimetry. Results presented in this thesis contribute to the effort of elucidating the mechanism of oral sensitization to kiwifruit by shedding light on the features of actinidin which enable it to reach the intestinal mucosa in a proteolytically active form. Additionally, since the influence of the activity (conformation) of actinidin on results of in vitro and in vivo diagnostic assays was demonstrated, results from this thesis could contribute to the improvement of kiwifruit allergy diagnosis. In addition, it was shown that the relative ratio of active and inhibited actinidin in kiwifruit protein extract depends on the chosen method for extract preparation. Apart from influencing future kiwifruit allergy diagnostic procedures, these results can be used to optimise the extraction procedure for kiwifruit protein extracts. In this thesis the possibility of using kiwifruit extract as a plant milk clotting agent was analysed. It was shown that the addition of kiwifruit extract prepared at pH 5.0 to cow milk leads to the formation of a casein clot. The obtained clot and whey were shown to have identical protein profiles to the clot and whey obtained through the activity of calf chymosin. The ratio between coagulating and proteolytical activity towards cow milk was only 30 % less favorable when using kiwifruit extract.
Alergije na hranu su IgE antitelima posredovane imunološke reakcije na komponente hrane, najčešće proteine. Razvijaju se nakon primarne senzitizacije preko gastrointestinalnog trakta, i za sada nije poznat mehanizam senzitizacije ovim putem. Smatra se da bi alergeni proteini hrane morali da prođu kroz gastrointestinalni trakt barem delimično očuvane strukture kako bi doveli do senzitizacije. Pored nerazjašnjenog mehanizma senzitizacije, alergije na hranu predstavljaju i izazov na polju dijagnostike, dok je jedina do sada potpuno uspešna metoda terapije strogo izbegavanje unosa alergene namirnice. Tokom svega 30-tak godina od svog prvog pojavljivanja na svetskom tržištu pa do danas plod kivija je postao jedna od omiljenijih namirnica u ljudskoj ishrani, ali je istovremeno dospeo i među deset najčešćih uzročnika alergije na hranu. Aktinidin, cistein proteaza iz papainske familije, je najzastupljeniji protein pulpe kivija i smatra se glavnim alergenim molekulom ovog izvora. U oviru ove disertacije ispitivane su strukturne i imunološke osobine aktinidina u cilju rasvetljavanja puta oralne senzitizacije i poboljšanja dijagnostike alergije na kivi. Pokazano je da aktinidin prečišćen iz svežeg ploda kivija pod nativnim uslovima predstavlja smešu aktivnog i neaktivnog enzima. Između proteolitički aktivnog i neaktivnog aktinidina postoji razlika u elektroforetskoj pokretljivosti, sposobnosti vezivanja IgE u imunoblotu i obrascima reagovanja pacijenata u kožnim probama. Pokazano je da samo aktivni enzim preživljava uslove simuliranog želudačnog i crevnog soka i da nakon ovih tretmana pokazuje očuvanu imunogenost i proteolitičku aktivnost. Uočene razlike između aktivnog i inhibiranog oblika aktinidina najverovatnije su posledica razlika u strukturi enzima koje nastaju prilikom inhibicije, a ova pretpostavka je potkrepljena rezultatima CD spektroskopije i fluorimetrije. Rezultati dobijeni u ovoj disertaciji doprinose rasvetljavanju mehanizama oralne senzitizacije na kivi ukazujući na strukturne osobine aktinidina koje mu omogućavaju da u proteolitički aktivnom obliku dospe do intestinalne mukoze. S obzirom da je pokazan uticaj aktivnosti (konformacije) aktinidina na in vivo i in vitro dijagnostičke eseje prikazani rezultati mogu doprineti i poboljšanju dijagnostike alergije na kivi. Pokazano je i da relativni odnos aktivnog i inhibiranog aktinidina u ekstraktu kivija zavisi od načina pripreme ekstrakta. Ovi rezultati, osim u poboljšanju dijagnostike alergije na kivi, mogu biti upotrebljeni i za optimizaciju proteinskih ekstrakata kivija i njihovu upotrebu u industriji mleka. U ovoj disertaciji je ispitana moguća upotreba ekstrakta kivija kao sredstva za koagulaciju mleka u procesu proizvodnje sira. Dobijeni rezultati su pokazali da dodavanjem proteinskog ekstrakta kivija pripremljenog na pH 5.0 u kravlje mleko dolazi do nastanka gruševine i surutke identičnih proteinskih profila kao prilikom dodavanja himozina poreklom iz želuca teleta. Izmeren odnos koagulacione i proteolitičke aktivnost ovog ekstrakta prema mleku je bio svega 30% lošiji od himozina.
L-cistein sulfinat dekarboksilaza (EC 4.1.1.29) je enzim koji određuje brzinu biosinteze taurina, te katalizira dekarboksilaciju L-cistein sulfinskekiseline u hipotaurin. Identifikacija nove ...L-cistein sulfinat dekarboksilaze koja bi mogla poboljšati biosintetičku učinkovitost taurina vrlo je bitna. Još neistraženi gen za dekarboksilazu, undec1A, identificiran je u prethodnom radu probirom sekvencija DNA iz neuzgojenih mikroorganizama iz tla. Uproteinu Undec1A primjenjena je nasumična mutageneza pomoću sekvencijalne lančane reakcije polimeraze s pogreškama. Mutirani protein Undec1A-1180, izdvojen iz zbirke tako dobivenih različitih mutiranih proteina, imao je 5,62 puta veću specifičnu aktivnost od ishodnogproteina Undec1A pri temperaturi od 35 °C i pH=7,0. Rezultati molekulskog uklapanja potvrđuju da aminokiselinski ostaci Ala235, Val237, Asp239, Ile267, Ala268 i Lys298 u proteinu Undec1A-1180 pomažu pri prepoznavanju i katalizi molekula L-cistein sulfinske kiseline. Ovi bi rezultati mogli poslužiti kao osnova za definiranje svojstava proteina Undec1A-1180.Tehnologija usmjerene evolucije prikladna je za unapređenje biotehnološke primjene gena dobivenih iz metagenoma.
Šaran ima visoko razvijeni okusni sustav kojeg stimulira uski raspon slobodnih aminokiselina uključujući L-cistein i L-prolin. Sinergijski učinak kombinacije ovih dviju tvari na okusnu reakciju nije ...ranije dokazivan. U ovoj studiji različite koncentracije L-cisteina (0-0,1 M) i L-prolina (0-0,05 M) nasumce su davane testnim skupinama šarana u peletama agara tijekom jednominutnih pokusa. Trajanje prvog zadržavanja i ukupno trajanje zadržavanja tijekom svakog pokusa te broj gutanja (uzimanja) pelete zabilježeni su za svaki od ukupno 690 testova. Za svaki tip pelete izračunata je okusna reakcija, broj konzumacija i prosječno prihvaćanje od strane šarana. Pokazalo se da L-cistein znatno više stimulira konzumaciju od L-prolina te između njih nije uočen sinergizam. Rezultati su važni za pripremanje riblje hrane i ribičkih mamaca za šarane.
Transkripcijski čimbenik 2 povezan s NF-E2 (Nrf2) važan je za zaštitu stanice od oksidacijskog stresa uzrokovanog kemijskim spojevima. U prijašnjem smo istraživanju utvrdili da često rabljeni ...piretroidni insekticid deltametrin aktivira Nrf2 u štakorskim PC12-stanicama feokromocitoma. Još međutim nisu jasni molekularni mehanizmi te aktivacije. U ovome smo istraživanju željeli utvrditi ulogu deplecije staničnoga glutationa (GSH) u aktivaciji Nrf2 od strane DM-a. DM je pojačao ekspresiju Nrf2 u mRNA te povisio razinu proteina i razinu Nrf2 u jezgri. Aktivacija Nrf2 bila je povezana s nizvodnom aktivacijom hemoksigenaze 1 (HO-1) i katalitičke podjedinice glutamat cistein ligaze (GCLC). DL-butionin-S,R-sulfoksimin (BSO), za koji se zna da dovodi do deplecije GSH, nije međutim povećao ekspresiju Nrf2-proteina niti doveo do njegova nakupljanja u staničnoj jezgri. Prethodna primjena BSO aktivirala je međutim ekspresiju HO-1 i GCLC u mRNA. Usto je suprimirala djelovanje DM-a na aktivaciju i regulaciju Nrf2 te smanjila ekspresiju HO-1 i GCLC u mRNA nakon primjene DM-a. Ova saznanja govore da deplecija GSH nije nuždan mehanizam za aktivaciju Nrf2/ARE od strane DM-a u PC12-stanica te da do povećane ekspresije GCLC i HO-1 može doći drugim signalnim putovima.
U istraživanju su štakori bili izloženi natrijevom arsenitu (10 ppm arsena) primijenjenom u vodi za piće tijekom 8 tjedana nakon čega su bili podijeljeni u 5 skupina po 6 štakora. Štakorima u ...skupinama 3, 4 i 5 oralnim je putem dnevno davan cistein, metionin ili askorbinska kiselina u količini od 25 mg/kg tjelesne mase. Štakori 2. skupine poslužili su kao kontrola. Na kraju pokusa određeni su pokazatelji oksidativnog stresa i to razina lipidnog peroksida, superoksidne dismutaze i katalaze u krvi, jetri i bubrezima. Izloženost arsenu očitovala se značajnim (P<0,05) porastom razine lipidnih peroksida kao i aktivnosti superoksidne dismutaze i katalaze u eritrocitima, jetri i bubrezima. Zabilježene su niže razine lipidnih peroksida kao i povratak aktivnosti protuoksidacijskih enzima na različitim razinama i u različitim tkivima. Izloženost arsenu nije imala značajni učinak (P>0,05) na tjelesnu masu štakora različitih skupina. Zaključeno je da istodobna profilaktička primjena cisteina, metionina ili askorbinske kiseline pruža specifičnu zaštitu tkiva od oksidacijskih oštećenja uzrokovanih supkroničnim izlaganjem arsenu.
Fabryjeva bolest je X-vezana nasljedna metabolička bolest nakupljanja uzrokovana
smanjenom aktivnošću enzima α-galaktozidaze A. Posljednično tome dolazi do nakupljanja
nerazgrađenog supstrata ...(globotriazilceramida) u endotelnim i glatkim mišićnim stanicama
krvnih žila što dovodi do njihovog oštećenja. Dosadašnji rezultati pokazuju da samo
nakupljeni supstrat nije jedini uzrok kasnijim kliničkim manifestacijama bolesti. Ovo
istraživanje obuhvatilo je određivanje asimetričnog dimetilarginina (ADMA) kao važnog
čimbenika u patologiji promjena endotela krvnih žila u skupini bolesnika s Fabryjevom
bolešću, te koncentracija aminokiselina L-arginina, L-metionina i L-citrulina kao i njihovih
međusobnih omjera s ADMA. Određivanjem koncentracije ADMA u predkliničkoj fazi i za
vrijeme enzimske nadomjesne terapije, željeli smo ispitati da li postoji povezanost genotipa i
fenotipa bolesnika s Fabryjevom bolešću s koncentracijama ADMA u serumu, te procjeniti
moguću klinički primjenu koncentracije ADMA kao novi dijagnostički i prognostički
pokazatelj oštećenja krvnih žila kod bolesnika s Fabryjevom bolesti.
Rezultati pokazuju da ADMA ne može biti pouzdani marker za procjenu stanja bolesnika s
Fabryjevom bolešću. Nadomjestaj L-arginina ili L-citrulina mogao bi biti dodatak ERT kao
prevencija pogoršanja vaskulopatije zbog nedostatka L-arginina i posljedično tome
bioraspoloživosti NO.
Fabry disease is X-linked inherited metabolic storage disease caused by reduced activity of
the enzyme α-galactosidase. Consequently that leads to accumulation of substrate
(globotriaosylceramide) in endothelial and smooth muscle cells of blood vessels and to their
damage. Results so far show that only the accumulated substrate is not the only cause of
subsequent clinical manifestations of disease. This research would include determining
asymmetric dimethylarginine (ADMA) as an important factor in the pathology changes of the
endothelium of blood vessels in the patients group with Fabry disease. By determining the
concentration of ADMA in preclinical phase and during enzyme replacement therapy, we will
examine whether there is an association of genotype and phenotype in patients with Fabry
disease with aDMA concentrations in serum and evaluate the possible clinical application of
the concentration of aDMA as a new diagnostic and prognostic marker of vascular damage in
patients with Fabry disease.
This study provides evidence that ADMA could not be reliable marker of vascular damage in
patients with Fabry disease. Supplementation of L-arginine or L-citrulline could be add on
treatment on ERT as prevention of vascular damage due to reduced biosintheses of L-arginine
and availability of NO.
PDF
