Tekućinska kromatografija visokog učinka (high performance liquid chromatography, HPLC) je jedna od najznačajnijih i najuspješnijih metoda koje se primjenjuju za razdvajanje i pročišćavanje raznih ...molekula. Većina kromatografskih nosača je dizajnirana za razdvajanje proteina te je primjena ove metode u istraživanju makromolekula i makromolekularnih kompleksa otežana. Građa klasičnih nosača se temelji na poroznim kuglicama, a razdvajanje na difuziji. Zbog neadekvatne veličine pora i sporog razdvajanja, primjena ove metode u istraživanju biomolekula nije osobito uspješna. Monolitni su kromatografski nosači napravljeni iz jednog dijela te imaju visoki stupanj poroznosti i veličinu kanala koja je adekvatna za većinu makromolekularnih kompleksa (prosječni promjer je 1,5 μm). Karakterizira ih laminaran protok tekuće faze i interakcije s ligandima koje se temelje na konvekciji, a ne na difuziji što ujedno omogućava brzi prijenos mase i znatno skraćuje vrijeme potrebo za odvijanje eksperimenta (Barut et al., 2008). Viroidi su male jednolančane kružne, i u većini istraživanih slučajeva, fitopatogene RNA-molekule koje ne posjeduju gene za proteine već sve svoje funkcije provode formiranjem raznih sekundarnih/tercijarnih struktura. Te iste strukture omogućuju visoku stabilnost viroida u biljci i izvan nje te su temelj njihove visoke infektivnosti. Rasprostranjivanje virusa vodenim putovima je dobro dokumentirano (Mehle i Ravnikar, 2012) dok prijenos viroida vodom do nedavno nije razmatran. Viroid vretenaste ušiljenosti gomolja krumpira (Potato spindle tuber viroid, PSTVd) može preživjeti i do pet tjedana u vodenom okruženju te zadržati svoju infektivnost (Mehle et al., 2011). Najpreciznija metoda njegove detekcije je kvantitativna lančana reakcija polimerazom uz prethodnu reverznu transkripciju (reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR). Zbog tipičnih stohastičkih efekata koji utječu na qPCR, ova metoda ne može sa sigurnošću detektirati patogen koji je prisutan u izrazito niskim koncentracijama (Morrison et al., 1998). Takva situacija je vrlo vjerojatna u vodenim uzorcima zbog učinka razrjeđenja te je prethodni korak koncentriranja uzorka nužan. Jedan od ciljeva ove doktorske disertacije je optimizacija postupka koncentriranja viroida iz vodenih uzoraka. Analizirano je kromatografsko ponašanje PSTVd-a i biljnih mRNA dvjema adsorbcijskim metodama: ionskom izmjenom i kromatografijom hidroforbnih interakcija. Najbolji prinos ostvaren je pomoću kromatografije hidrofobnih interakcija te je ta metoda korištena za koncentriranje viroida iz vodenih uzoraka. Prinos je analiziran kvantitativnom PCR-metodom. Virus mozaika postrne repe (Turnip yellow mosaic virus, TYMV) i virus grmolike kržljavosti rajčice (Tomato bushy stunt virus, TBSV) pripadaju malim biljnim sferičnim virusima (promjer ~30 nm). Oni su modeli koji su poslužili za razumijevanje ikozaedarske strukture te niza procesa koji se odvijaju tijekom virusne replikacije i tijekom raznih staničnih procesa (Dreher, 2004; Morgan, 2003; Yamamura i Scholthof, 2005). Iako navedeni virusi nemaju jak ekonomski značaj (nisu izrazito patogeni), i danas su atraktivni zbog potencijalne primjene u biomedicini i nanotehnologiji (virus based vectors i virus-like particles). U ovoj doktorskoj disertaciji TYMV i TBSV su prvi put kromatografski izdvojeni iz biljnog homogenata. Korištena je ionsko-izmjenjivača kromatografija jer navedeni virusi posjeduju različiti ukupni naboj pri određenom pH. Sadržaj frakcija je analiziran pomoću kvantitativne PCR-metode, SDS-poliakrilamidne gel-elektroforeze proteina i elektronske mikroskopije. Infektivnost virusnih čestica nakon kromatografije je provjerena inokulacijom zdravih biljaka sadržajem virusnih frakcija te detekcijom virus (RT-qPCR) u tim istim biljkama. Metoda optimizirana za TYMV je primijenjena u analizi izolata koji pripadaju dvjema skupinama sojeva: TYMV-1 i TYMV-2 (Symons et al., 1963). Pripadnici skupine TYMV-2 (TYMV-N i TYMV-D) imaju kraće retencijsko vrijeme nego pripadnici skupine TYMV-1 (TYMV-E i TYMV-Y). Istodobno je uočena mogućnost da se u slučaju izolata TYMV-D radi o miješanoj infekciji dvama sojevima gdje, ovisno o vremenskom periodu, do izražaja dolazi jedan od njih. Nadalje, u ovoj disertaciji je istražena mogućnost primjene monolitne kromatografije u razdvajanju individualnih virusa iz smjesnog uzorka. Pomoću CIM DEAE kolone i radnih pufera sa pH 6, uspješno su razdvojena četiri biljna virusa: tri ikozaedarska (TBSV, TYMV-N i TYMV-E) i jedan štapićasti (TMV). Virus mozaika duhana (Tobacco mosaic virus, TMV) pripada štapićastim virusima (helikalna simetrija) i on je kamen temeljac virologije (Harrison i Wilson, 1999). Primjenom uvjeta optimiziranih za tobamoviruse (CIM QA i pH 5,5) razdvajanje četiriju virusa je bilo manje uspješno te se može zaključiti da svaki virus zahtjeva posebnu optimizaciju što je prethodno dokumentirano u literaturi (Adriaenssens et al., 2012). Adenovirusi serotipa 5 (Ad5) su jedni od najraširenijih vektora u genskoj terapiji (Wiley Database, 2013). Analizirano je kromatografsko ponašanje više genetički modificiranih Ad5- vektora. Frakcije su analizirane SDS-poliakrilamidnom elektroforezom proteina i testom blue forming units. Promjene u heksonskom proteinu koje su dovele do gubitka naboja su rezultirale skraćenim retencijskim vremenom, dok promjene u dužini vlakna nisu imale utjecaj na retencijsko vrijeme. Zamjena vlakna jednog serotipa drugim (Ad5-vlakno je zamijenjeno Ad3-vlaknom) je dovelo do povećanja ukupnog naboja viriona te do produženja retencijskog vremena. Rezultati dobiveni u sklopu ove disertacije pridonose proširenju primjene monolitne kromatografije i metodološki unaprjeđuju istraživanje virusa i viroida. Monolitna kromatografija je brza, praktična i učinkovita metoda za razdvajanje različitih virusnih čestica i te koncentriranje viroidne RNA.
By using monolithic supports it is possible to apply chromatography in purification, separation, and concentration of various large molecules and macromolecular complexes. In this thesis, chromatographic behaviour of RNA molecules was analysed using ion-exchange and hydrophobic interaction modes. A concentrating protocol for Potato spindle tuber viroid, which improved the sensitivity of its reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) detection, was developed. Turnip yellow mosaic virus (TYMV) and Tomato bushy stunt virus were separated from plant homogenate with monolithic supports for the first time. Furthermore, several plant viruses were separated from an artificially mixed sample using ion-exchange chromatography. High recoveries were obtained and virus infectivity was maintained. Electron microscopy confirmed the integrity of the plant virus particles after chromatography. The method was also used to differentiate members of two groups of TYMV isolates representing different virus strains. Chromatographic behaviour of several structurally modified Adenovirus 5-based vectors was considered. The influence of changes in the hexon protein and in the fibre on retention time was observed. Results obtained within this thesis represent methodological advancement in the research of viroids and viruses, proving that monolith chromatography is a fast, practical and efficient method for separation of different virus particles and concentrating viroid RNA.
The first case of bovine demodicosis in France was diagnosed in a cow, at ENVA, hospitalised for respiratory problems. Clinical examination of the animal revealed numerous nodules at the base of the ...neck and over the shoulders. Staphylococcal infections and classic bovine mange were discarded, based on the localisation and nodular aspect of the lesions. Demodicosis was suspected and skin biopsies were realised. Demodex bovis was isolated and identified. Treatment included injectable ivermectin together with respiratory antibiotherapy and a non-steroidal anti-inflammatory drug. Demodicosis is a mite infestation affecting cattle, caused by a parasite in the hair follicles and sebaceous glands. This condition is widespread in Tropical Countries and its occurrence in Europe may be underestimated
Il primo caso di demodicosi in Francia è stato diagnosticato all'ENVA, in una vacca ricoverata per problemi respiratori. Gli esami clinici dell'animale hanno consentito di evidenziare numerosi noduli alla base del collo e sulle spalle. E' stata scartata la diagnosi di infezioni da stafilococco e di rogna bovina classica, data la localizzazione e l'aspetto nodulare delle lesioni. E' stato avanzato il sospetto di demodicosi e sono state effettuate biopsie cutanee. E' stato isolato e identificato Demodex bovis. Sono stati praticati trattamenti a base di ivermectina iniettabile unitamente ad antibioticoterapia respiratoria e a un farmaco infiammatorio non steroideo. La demodicosi è un'infestazione da acari che interessa i bovini ed è causata da un parassita dei follicoli e delle ghiandole sebacee. Questa parassitosi è diffusa nei Paesi tropicali e la sua diffusione in Europa può essere sottostimata.
Lucrarea este o stampă realizată în acvaforte, exemplarul 4 dintr-un tiraj de 10 lucrări. Compoziția este suprarealistă și are în centru un braț cu pumn supradimensionat. În dreapta acestuia un alt ...pumn ține un obelisc inversat, iar în stânga un braț mai firav se termină cu o palmă deschisă prin care pare a trece coada unui animal totemic. Ființa hibridă are gura larg deschisă, arătându-și dinții mari, deși și ascuțiți. În spatele celor patru elemente compoziționale din prim plan se disting mai multe siluete monolitice și o pasăre hibridă cu ochi alungiți ce pare a privi înspăimântată spre pumnul central. Siluetele din partea stângă sus sunt în întuneric în timp ce în partea dreaptă, jos, în spatele animalului fioros, acestea sunt în lumină. Lucrarea este semnată și datată, în partea dreaptă, jos, cu creionul: „Mchirnoagă 1971”.
stânga jos, cu creion: IV/X Protest împotriva spaimelor
semnătură
exemplar de serie
Stampa este construită pe orizontală și imprimată în cuplul de complementare roșu-verde, cu accente de luminozitate conferite de hârtia suport. În plan inferior, o zonă îngustă este realizată din ...linii orizontale, paralele ce conferă perspectivă lucrării. Dincolo de orizontul jos, în văzduh, chipuri monolitice dispuse piramidal, se profilează din stânga. Asemenea sculpturilor de pe muntele Rushmore, cele trei personaje par cioplite din munții sugerați pe fundal, printr-un desen geometric distorsionat și modulat. Compoziția este dinamică, închisă și încărcată de simboluri. Lucrarea este semnată și datată în partea dreaptă, jos, cu creion: „Gh.Ivancenco 74”.
stânga jos, cu creion: Exemplar de artist_ „Libertatea” aguatinta
semnătură
exemplar de artist
Placa de cupru este gravată în acvaforte și acvatinta după un desen realizat minuțios, cu linii sigure. Imaginea descrisă este compusă circular, în jurul „personajului” principal, un scaun în stil ...baroc, cu spătar înalt. Așezat pe un postament și luminat de sus, scaunul gol este înconjurat de blocuri masive de piatră, de forma unor monoliți care au chipuri triste, redate într-un desen sculptural. În centrul arenei ce înconjoară elementul de interes, sunt căzute pe jos, monede mari. Un covor este dispus pe scările care duc, din dreapta jos, la intrarea în spațiul imaginar. Placa nu este nici semnată și nici datată. Versoul plăcii este acoperit aproape complet cu bitum.
nesemnată
atribuit
Imaginea este compusă asemenea unui cadru de film. De jur împrejurul centrului de interes este o zonă lată imprimată compact cu negru. Central, imprimată în tonalități de roșu, imaginea reprezintă un ...peisaj geometrizat realizat simplu, cu linii subțiri, verticale și hașuri. Din elementele monolitice din plan apropiat par a se desprinde bucăți care levitează spre o linie punctată ce se sfârșește în registrul superior arcuit precum linia unui orizont. Lucrarea este semnată și datată cu creionul, în dreapta, jos: „Mihai Micu 77”.
stânga jos, cu creion: „Ex a „Amiază” gravură metal
semnătură
exemplar de autor
