Pozadina istraživanja. U posljednje se vrijeme sve više ispituju postupci enzimske hidrolize nusproizvoda obrade ribe radi dobivanja proizvoda obogaćenih funkcionalnim i biološkim svojstvima važnim u ...proizvodnji hrane, kozmetike i medicinskih preparata. Osim toga, na taj se način smanjuju količina otpada industrijske proizvodnje i pritisak na okoliš. Svrha je ovoga rada bila osmisliti učinkoviti postupak dvostupanjske enzimske hidrolize kože slatkovodne ribe i ispitati učinak dobivenih bioaktivnih peptida na uklanjanje slobodnih radikala, redoks ravnotežu, te proliferaciju i migraciju fibroblasta.
Eksperimentalni pristup. Kolagen razgradljiv pomoću pepsina izoliran je iz kože bijelog glavaša (Hypoph¬thalmichthys molitrix) i hidroliziran u kontroliranim uvjetima pomoću proteinaze K. Molekulska masa permeata dobivenog ultrafiltracijom određena je pomoću elektroforeze s gradijentom i gel-filtracijske kromatografije. Biološka aktivnost peptida srednje i male veličine ispitana je in vitro simulacijom oksidacijskog stresa i oštećenja kože.
Rezultati i zaključci. Riblji kolagen je hidroliziran pomoću proteinaze K, najučinkovitijeg enzima koji cijepa primarnu strukturu molekule, što je potvrđeno prethodnim ispitivanjem in silico. Pri optimalnim uvjetima povećali su se specifičnost enzima i prinos reakcije. U usporedbi s riblijm kolagenom, bioaktivni su peptidi imali bitno veću sposobnost uklanjanja slobodnih i hidroksilnih radikala, često prisutnih in vivo. Ovisno o koncentraciji, stimulirali su metabolizam fibroblasta i migraciju stanica pri cijeljenju modelne rane. Prethodna obrada fibroblasta optimalnim koncentracijama ribljih peptida spriječila je porast sinteze reaktivnih spojeva kisika pri induciranju oksidacijskog stresa. Možemo zaključiti da bioaktivni peptidi kože bijelog glavaša imaju važna svojstva, kao što su održavanje redoks ravnoteže i pospješivanje cijeljenja rana, što upućuje na njihovu moguću primjenu u razvoju farmaceutika i nutraceutika.
Novina i znanstveni doprinos. U ovom je radu provedena enzimska hidroliza izoliranog proteina, za razliku od dosadašnjih istraživanja u kojima je korišten otpad različitog sastava. Dobiveni bioaktivni peptidi nisu djelovali samo kao antioksidacijski agensi, već i kao regulatori oksidacijskog stresa i cijeljenja kože u staničnom modelu. Zbog svojih svojstava mogu se preporučiti za primjenu u proizvodnji kozmetičkih pripravaka koji suzbijaju starenje kože.
Plant proteinase inhibitor genes are among the prime candidates suitable for
insect resistance improvement in plants. Expression pattern of a sugar beet
serine proteinase inhibitor gene, BvSTI, was ...characterized in response to
mechanical and fall armyworm (Spodoptera frugiperda J.E. Smith) induced
wounding. BvSTI expression was analyzed in three breeding lines moderately
resistant to sugar beet root maggot (Tetanops myopaeformis Roder.) and in a
susceptible line, F1010. Increased mechanical wounding induced levels of
BvSTI expression were observed in all resistant lines as compared to F1010.
The most intensive response to wounding was observed in resistant lines,
F1016 and UT-8, with a maximum up to 4- and 2,5-fold increase of BvSTI
transcript levels over non-wounded roots and leaves, respectively. In
contrast, slight increase of BvSTI transcript levels in leaves and even an
initial decrease in roots were observed in sensitive F1010, but also in the
third resistant line, F1015. BvSTI transcript accumulation in F1016 and F1010
tissues wounded by FAW showed a similar gene expression pattern, but it was
delayed and less intense than the response incited by abiotic wounding. On
the protein level, BvSTI-specific polyclonal antibodies confirmed increased
accumulation of the 30 kDa BvSTI protein in wounded leaves but not in roots
of F1016 and F1010. Using trypsin inhibition assays, the activity of BvSTI
was confirmed in F1016 roots and leaves and F1010 leaves. In F1010 roots
BvSTI activity was completely lacking. To confirm the potential role of the
BvSTI gene in defending mechanisms to insect pests in sugar beet the same
analyzed germplasm were bioassayed for resistance to fall armyworm insects.
Larvae fed sugar beet leaves from all three resistant germplasms (F1016,
F1015 and UT-8) had significant reductions in larval weights as compared to
larvae fed on sensitive F1010 leaves. The observed daily weight increase was
also the highest in larvae from sensitive vs. resistant leaves. As the larvae
entered the pupal stage, pupal sizes did not reflect the overall larval
weights and all developed pupae were similar. Larvae fed on roots were almost
double lighter than larvae from leaves for all analyzed gemplasms. Some
developmental abnormalities of the pupae fed on F1016 and F1015 leaves were
noted. Since identification of gene promoters that are specifically activated
in response to wounding or pest attack will facilitate regulated transgene
expression in plants, we examined the induction pattern of a sugar beet
promoter derived from the BvSTI proteinase inhibitor gene. BvSTI promoter was
previously fused to the β-glucuronidase (GUS) reporter gene and transferred
to Nicotiana benthamiana plants. GUS activity driven by BvSTI promoter was
evaluated in independently derived BvSTI transgenic tobacco T2 homozygous
progeny. Mechanical wounding and fall armyworm larval feeding induced GUS
gene expression in tobacco leaves and roots that was localized at the wound
site in mature tobacco tissues. Based on our results we can conclude that
BvSTI gene expression was wound induced in the insect resistant germplasm
suggesting that this gene can be used in biotechnological approaches or in
breeding programs for improving insect resistance. Observation of GUS gene
activity at the wound site in transgenic tobacco indicates that the BvSTI
promoter is inducible in these tissues and, therefore, should prove useful
for expressing resistance transgenes in leaves and roots as a first line of
defense against plant pests and pathogens.
Biljni inhibitori proteinaza aktivno učestvuju u odbrani biljaka od insekata
štetočina inhibirajući insekatske digestivne proteinaze. In planta analiza
ekspresije BvSTI gena koji kodira inhibitora serinskih proteinaza urađena je
sa ciljem otkrivanja uloge ovog inhibitora u otpornosti biljaka šećerne repe
na insekte, kao i radi utvrđivanja potencijala ovog gena kao pogodnog
kandidat-gena koji bi se biotehnološkim metodama mogao uvesti u osetljive
biljne genome, čime bi se povećala njihova otpornost prema insektima
štetočinama. Ekspresija BvSTI gena praćena je kod tri genotipa šećerne repe
koji se odlikuju umerenom otpornošću prema larvama štetočine korena Tetanops
myopaeformis Roder, F1016, F1015 i UT-8, kao i kod jednog osetljivog
genotipa, F1010. Kod svih otpornih genotipova mehaničko povređivanje
indukovalo je ekspresiju ovog gena, a nivo transkripcije bio je povišen u
poređenju sa nivoom kod osetljivog genotipa. Najintenzivniji odgovor na
povređivanje zabeležen je kod otpornih genotipova F1016 i UT-8. U listovima
osetljivog F1010, ali i trećeg otpornog genotipa F1015, registrovan je samo
neznatni porast u intenzitetu BvSTI transkripcije, dok je u korenovima ova
dva genotipa mehaničko povređivanje dovelo do blage početne supresije u
aktivnosti BvSTI gena. Akumulacija BvSTI transkripata u listovima i
korenovima otpornog F1016 i osetljivog F1010 kojima su se hranile larve
Spodoptera frugiperda J.E. Smith pokazala je sličan obrazac ekspresije kod
oba genotipa. U poređenju sa transkripcionim obrascima dobijenim nakon
mehanilčkog povređivanja, ishrana insekata dovela je do znatno sporije
indukcije i slabijeg intenziteta transkripcije. Analize na proteinskom nivou
pokazale su da nakon povređivanja listova dolazi do akumulacije proteina
veličine 30 kDa za koji su se vezala poliklonalna BvSTI specifična antitela
kako kod otpornog F1016, tako i kod osetljivog F1010 genotipa. Aktivnost
BvSTI inhibitora protiv tripsina pokazana je kod F1016 korenova i listova,
kao i kod F1010 listova. U F1010 korenovima aktivnost BvSTI inhibitora nije
detektovana. U biotestu u kome je ispitivana otpornost pojedinačnih
genotipova na larve S. frugiperda korišćena su sva četiri genotipa šećerne
repe kod kojih je pokazano da povređivanje utiče na ekspresiju BvSTI gena.
Larve koje su se hranile listovima sva tri otporna genotipa bile su
statistički značajno lakše od larvi koje su hranile osetljivim F1010
listovima. Prelaskom larvi u stadijum lutke statistički značajne razlike u
masi mađu larvama koje su se hranile listovima različitih genotipova su se
izgubile i sve lutke su bile sličnih masa. Larve koje su se hranile
korenovima šećerne repe bile su u proseku dvostruko lakše od larvi sa
listova, a lutke koje su se razvile iz njih osim što su bile značajno lakše
bile su i obavijene hitinskim omotačem znatno svetlije boje. U nekoliko
slučajeva zabeležene su i morfološke abnormalnosti kod lutki razvijenih iz
larvi koje su se hranile rezistentnim sa F1016 i F1015 listovima. Obrazac
indukcije promotorskog regiona BvSTI gena praćen je u transgenim biljkama
duvana kod kojih se pod kontrolom ovog promotora nalazio reporter GUS gen.
Kod mladih in vitro gajenih biljaka nezavisno razvijenih T2 linija duvana
ekspresija GUS gena bila je više konstitutivna. S druge strane, kod starijih
biljaka gajenih u staklari mehaničko povređivanje, kao i povređivanje nastalo
ishranom S. frugiperda larvi, indukovali su lokalizovanu ekspresiju GUS gena
samo na mestu povređivanja u listovima i korenovima. Pokazana korelacija
između stepena otpornosti genotipova šećerne repe i nivoa ekspesije BvSTI
gena upućuje na zaključak da je ovaj gen učestvuje u mehanizmima odbrane
protiv herbivornih insekata, te se smatra da može biti korišćen u
biotehnološkim procesima unapređivanja otpornosti na insekte kod biljaka.
Takođe, promotorski region BvSTI gena pokazao je inducibilnu prirodu
ekspresije i može biti pogodan za kontrolisanu ekspresiju transgena u
listovima i korenovima biljaka kao prva linija odbrane od insekata štetočina.
The combination or stacking different genes in transgenic plants to achieve
disease and pest control and/or higher crop yield is one of a major method
of contemporary biotechnology. Oryzacystatins I ...and II (OCI and OCII),
inhibitors with different specificity, show potential in controlling pests
that utilize cysteine proteinases for protein digestion. To strengthen this
inhibitory range and, possibly, achieve an additive effect in the overall
efficiency of these proteins against pests, both cystatins were co-expressed
in three potato cultivars. Oryzacystatin genes pyramiding in Dragačevka and
Desiree cultivars were achieved by co-transformation with OCI and OCII genes
co-integration frequency of 20-22%. For Jelica cultivar sequential
re-transformation was more efficient approach: OCII gene integration
frequency following re-transformation of an OCI-expressing line was 91%.
Additionally, pyramiding of different oryzacystatin genes, by co- or
re-transformation approach, were achieved using the nptII gene as the only
selection marker. Wounding induction of OCI and OCII gene transcripts and
accumulation of biologically active OCI and OCII recombinant proteins was
confirmed in all analyzed OCI/OCII transformed lines. OCI/OCII potato lines
did not exhibit morphological abnormalities, indicating low level of
somaclonal variation or interference of the recombinant OCI or OCII with
host plant metabolism. In the absence of significant mortality, feeding
Colorado potato beetle larvae (Leptinotarsa decemlineata Say) on
OCI/OCII-expressing foliage had an impact on various aspects of the growth
and developmental performances of larvae. Larvae feeding on transformed
potato leaves tended to molt earlier and, especially during L2-L3 stages,
gain weight up to 29.7% faster and consume leaf material up to 29.1% faster,
compared to those on untransformed foliage. Larvae on OCI/OCII foliage were
also reach maximum weight gained three days earlier and slow down earlier in
preparation for pupation. Despite their faster growth and feeding, with
similar efficiencies of conversion of ingested food, L4 larvae reared on
transformed foliage were not compensating presence of the recombinant
oryzacystatins in the diet. Compared to those on untransformed foliage,
maximum weight gained and amount of foliage consumed were up to 19.4% and
18.5%, respectively, lower for the larvae fed on OCI/OCII potato foliage.
Larval weight reduction on OCI/OCII foliage resulted in adult emergence with
up to 26.3% reduced body mass. Analysis of total digestive proteinases
activity showed initially, up to 56%, reduction in digestive capacity of L3
potato beetle larvae, accompanied with inhibition of cysteine proteinase
specific activity up to 62% (acute effect). However, by continual ingestion
of OCI/OCII potato foliage total and cysteine proteinases specific
activities were at control level, suggesting compensatory responses of
larvae protease system to the presence of recombinant oryzacystatins in the
diet. The observed alterations in larval feeding and growth performance can
be interpreted as regulatory responses aimed at stabilizing the final body
weight despite presence of the recombinant inhibitors. These changes can
trigger complex interactions between feeding, food processing and growth
regulatory mechanisms, which tend to compensate for the potential fitness
loss caused by feeding on transformed foliage.
Kombinovanje ili “slaganje” različitih gena u transgenim biljkama radi
postizanja uspešnije kontrole patogena i štetočina i/ili većeg prinosa
predstavlja jednu od glavnih oblasti istraživanja savremene biotehnologije.
Orizacistatini I i II (OCI i OCII), proteinazni inhibitori različitih
specifičnosti, pokazali su potencijal u kontroli štetočina koje koriste
cisteinske proteinaze za digestiju proteina. Da bi se pojačao njihov
inhibitorni potencijal i, eventualno, povećala efikasnost ovih inhibitora u
kontroli štetočina, oba cistatina su koeksprimirana u transformisanim
biljkama tri sorte krompira. “Slaganje” orizacistatinskih gena kod sorti
Dragačevka i Dezire ostvareno je postupkom ko-transformacije i zabeležena je
frekvenca kointegracije OCI i OCII gena od 20-22%. Kod sorte Jelica
sekvencijalna re-transformacija se pokazala kao efikasniji pristup:
frekvenca integracije OCII gena nakon re-transformacije OCI-transformisane
linije iznosila je 91%. Istovremeno, “slaganje” dva orizacistatnska gena,
bilo postupkom ko- ili re-transformacije, postignuto je upotrebom nptII gena
kao jedinog selekcionog markera. Ekspresija OCI i OCII gena indukovana
povređivanjem i akumulacija biološki aktivnih rekombinantnih OCI i OCII
proteina potvrđena je kod svih analiziranih OCI/OCII transformisanih linija
krompira. OCI/OCII linije krompira nisu ispoljavale značajna odstupanja od
normalnog fenotipa, što ukazuje na nizak nivo somaklonalnih varijacija i
odsustvo uticaja rekombinantnih OCI i OCII na metabolizam biljke domaćina.
Iako nije uticala na preživljavanje, ishrana larvi krompirove zlatice
(Leptinotarsa decemlineata Say) listovima krompira koji eksprimiraju oba
orizacistatina imala je značajan uticaj na različite osobine performanse
rasta i razvića larvi. Larve hranjene transformisanim listovima su se
presvlačile ranije, i tokom L2 i L3 stupnja uvećavale masu do 29,7% brže i
konzumirale listove do 29,1% brže u odnosu na one hranjene netransformisanim
listovima. Istovremeno, larve na OCI/OCII listovima su do tri dana ranije
dostizale maksimum mase i ranije “usporavale” sa ishranom ulazeći u
prepupalnu fazu razvića. Uprkos povećanju performansi rasta i ishrane, pri
istoj efikasnosti ishrane, L4 larve na transformisanim listovima nisu u
potpunosti uspele da kompenzuju negativne efekte prisustva orizacistatina u
hrani. U odnosu na larve hranjene netransformisanim listovima, maksimalna
masa na kraju larvenog razvića i ukupan stepen oštećenja listova bili su do
19,4% i do 18,5% manji kod larvi krompirove zlatice hranjenih OCI/OCII
transformisanim listovima krompira. Smanjenje mase larvi na OCI/OCII
listovima dovelo je i do pojave adulta krompirove zlatice sa do 26,3%
redukovanom telesnom masom. Analiza ukupne proteinazne aktivnosti kod larvi
krompirove zlatice pokazala je inicijalno smanjenje digestivnog kapaciteta
L3 larvi do 56%, koje je praćeno inhibicijom specifične aktivnosti
cisteinskih proteinaza do 62% (akutni efekat). Sa druge strane, pri
hroničnoj ingestiji OCI/OCII listova krompira, ukupna i aktivnost
cisteinskih proteinaza kod L3 larvi ne pokazuje značajna odstupanja od
kontrolnog nivoa, ukazujući na kompenzatorne odgovore proteaza larvi na
prisustvo rekombinantnih orizacistatina u ishrani. Uočene promene u ishrani,
rastu i razviću larvi krompirove zlatice mogu biti tumačene kao regulatorni
odgovor kojim se postiže maksimum telesne mase uprkos prisustvu
rekombinantnih inhibitora. Time se pokreću složene interakcije između
ishrane, digestivnih procesa i regulatornih mehanizama rasta i razvića koje
mogu da kompenzuju potencijalno smanjenje adaptivne vrednosti usled ishrane
transformisanim listovima.
Fermente et ürünlerinde tat ve koku oluşumu, proteolitik parçalanmalardan önemli oranda etkilenmektedir. Fermantasyon ve olgunlaşma sırasındaki proteoliz, protein olmayan azot bileşiklerinin artışına ...neden olmaktadır. Fermente et ürünleri proteolitik enzimlerin aktivitesi için optimum koşullar içermektedir. Kasın kendine ait proteolitik enzimler; fermantasyonun başlangıç aşamalarında aktin ve myosin'in yıkımına neden olurken, bakterilere ait proteazlar ise kuruma sırasında aktivite göstermektedir. Fermente et ürünlerine proteolitik enzimlerin eklenmesi, proteolizi hızlandırarak olgunlaşma süresini kısaltmakta ve depolama giderlerini azaltmaktadır. Proteolitik enzimlerin kullanımı fermente et ürünlerinde duyusal kalitenin sürekliliğini de sağlamaktadır.
Fermente et ürünlerinde tat ve koku oluşumu, proteolitik parçalanmalardan önemli oranda etkilenmektedir. Fermantasyon ve olgunlaşma sırasındaki proteoliz, protein olmayan azot bileşiklerinin artışına ...neden olmaktadır. Fermente et ürünleri proteolitik enzimlerin aktivitesi için optimum koşullar içermektedir. Kasın kendine ait proteolitik enzimler; fermantasyonun başlangıç aşamalarında aktin ve myosin'in yıkımına neden olurken, bakterilere ait proteazlar ise kuruma sırasında aktivite göstermektedir. Fermente et ürünlerine proteolitik enzimlerin eklenmesi, proteolizi hızlandırarak olgunlaşma süresini kısaltmakta ve depolama giderlerini azaltmaktadır. Proteolitik enzimlerin kullanımı fermente et ürünlerinde duyusal kalitenin sürekliliğini de sağlamaktadır.
Fermente et ürünlerinde tat ve koku oluşumu, proteolitik parçalanmalardan önemli oranda etkilenmektedir. Fermantasyon ve olgunlaşma sırasındaki proteoliz, protein olmayan azot bileşiklerinin artışına ...neden olmaktadır. Fermente et ürünleri proteolitik enzimlerin aktivitesi için optimum koşullar içermektedir. Kasın kendine ait proteolitik enzimler; fermantasyonun başlangıç aşamalarında aktin ve myosin'in yıkımına neden olurken, bakterilere ait proteazlar ise kuruma sırasında aktivite göstermektedir. Fermente et ürünlerine proteolitik enzimlerin eklenmesi, proteolizi hızlandırarak olgunlaşma süresini kısaltmakta ve depolama giderlerini azaltmaktadır. Proteolitik enzimlerin kullanımı fermente et ürünlerinde duyusal kalitenin sürekliliğini de sağlamaktadır.
Fermente et ürünlerinde tat ve koku oluşumu, proteolitik parçalanmalardan önemli oranda etkilenmektedir. Fermantasyon ve olgunlaşma sırasındaki proteoliz, protein olmayan azot bileşiklerinin artışına ...neden olmaktadır. Fermente et ürünleri proteolitik enzimlerin aktivitesi için optimum koşullar içermektedir. Kasın kendine ait proteolitik enzimler; fermantasyonun başlangıç aşamalarında aktin ve myosin'in yıkımına neden olurken, bakterilere ait proteazlar ise kuruma sırasında aktivite göstermektedir. Fermente et ürünlerine proteolitik enzimlerin eklenmesi, proteolizi hızlandırarak olgunlaşma süresini kısaltmakta ve depolama giderlerini azaltmaktadır. Proteolitik enzimlerin kullanımı fermente et ürünlerinde duyusal kalitenin sürekliliğini de sağlamaktadır.
