U posljednjih nekoliko godina interes za proučavanem kemije benzimidazola znatno je porastao zbog njihovog širokog spektra biološkog djelovanja, kao i mnogobrojnih mogućnosti primjene kao materijala ...u elektronici, u elektrokemiji za zaštitu od korozije, polimera ili optičkih materijala.
Struktura benzimidazola sadržana je u vitaminu B12 kao i u strukturi mnogih terapeutskih agensa koji imaju antitumorsko, antiinfektivno, antibakterijsko, antifungalno i mnoga druga biološka djelovanja. Ciklički derivati benzimidazola poput benzimidazo1,2-akinolina, benzimidazo1,2- -ckinazolina, benzimidazo2,1-bizokinolina kao i mnogi drugi privukli su znatnu pažnju kako organskih sintetskih tako i medicinskih kemičara zbog interesantnih bioloških značajki, ponajprije vrlo dobrog antitumorskog djelovanja. Ciklički derivati benzimidazola imaju planarnu strukturu koja im omogućuje interkaliranje između parova baza dvostruke uzvojnice DNA. Interkalativni način vezivanja danas je jedan od najvažnijih u djelovanju antitumorskih lijekova.
Replication is one of the fundamental processes in the life cycle of the cell.
The aim of replication is a duplication of genetic material. To make genetic
material properly duplicated and ...subsequently divided into daughter cells, a large
number of mechanisms of regulation of replication have been developed. One way
of regulation is the proper selection and activation of replication initiation.
The number and complexity of the origins of replication (ori) varies among
species. They are simpler at evolution lower eukaryotes, while in higher
eukaryotes are more complex. The way of recognizing these places by initiation
proteins is not fully understood.
Ori sequence, located downstream of the DHFR gene (dihydrofolate
reductase) hamster, contains three defined origins of replication: ori β, ori β' and ori
γ. Ori β DHFR sequence is strong replicator and shows activity at ectopic places.
Although the sequence of ori DHFR is one of the best characterized ori sequences in
metazoans and within defined functionally important regions (AT rich region,
DNR region, BEND, RIP60 region, IR 4 bp), their function is still not completely
understood.
ORC (Origin recognition complex) is heterohexamer protein responsible for
identifying origins of replication. It is assumed that several elements play a role in
recognizing ori sequences of the ORC complex in metazoans.
The function of the human protein Orc4 (HsOrc4) has not been fully
elucidated. Our previous studies showed that HsOrc4 recognize non-canonical
structures and has the ability to influence at formation of TAT triplexes and
homoadenine structures. Our previous studies are done on linear fragments, and in this work we
examined the function of protein HsOrc4 the circular, topologically closed DNA,
(plasmid). For the analysis of the ori β DHFR, this sequence was subcloned into the
plasmid which forms the structure similar to topology in vivo.
In this work we analyzed the structure of functionally important regions of
ori β sequence DHFR: AT rich region, DNR, BEND, RIP60. Also, we investigated
binding properties of the protein HsOrc4 to supercoiled form of plasmid, and its
possible role in the remodeling of plasmid topology and structure of selected
regions of functional β DHFR ori sequences.
We performed assays with topoisomerase and nuclease. MB nuclease
(Mung Bean) recognizes and cut single stranded DNA regions, and it is used to
detect non-canonical structures within the plasmid. Topoisomerase I relax plasmid
and thus "lock" topology changes caused by interaction with protein HsOrc4.
This research has shown that topologically closed AT rich region of ori β
DHFR sequence form noncanonical structure. In the interaction with the protein
HsOrc4, this structure disappears. It is possible that protein modifies this structure
in direct interaction or the structural change is a consequence of changes in the the
topology of the entire plasmid. Other regions studied do not form non-canonical
structures at neutral pH. At acidic pH 5, DNR region occupies an alternative
structure, while the AT region occupies the same structure. The survival of noncanonical structures in the AT rich regions at different pH values in the sequence
of topological closed DHFR ori β, in contrast to the DNR region, suggest that the
structures are not equally sensitive to pH changes.
It is shown that the protein preferentially binds to HsOrc4 supercoiled form
of plasmids and modify the topology of plasmids. These topology changes are
reversible, since they disappear as protein is removed and for its "remembering"
requires the presence of Topoisomerase I. Protein HsOrc4 intensely bind to the
plasmid at pH 5 than at pH 7.5, forming large complexes.
Based on the results of this study, we conclude that protein HsOrc4
introduces topological changes in plasmid that are expressed at the level of
functionally important elements of ori sequences.
Replikacija je jedan od osnovnih procesa u životnom ciklusu ćelije. Cilj
replikacije je udvajanje genetičkog materijala. Da bi genetički materijal bio pravilno
umnožen i kasnije razdvojen na ćerke ćelije, razvijen je veliki broj mehanizama
regulacije replikacije. Jedan od načina regulacije je pravilan izbor i aktivacija mesta
inicijacije replikacije.
Broj i kompleksnost mesta inicijacije replikacije varira među vrstama. Kod
evolutivno nižih eukariota su jednostavnija, dok su kod viših eukariota
kompleksnija. Način prepoznavanja ovih mesta od strane inicijacionih proteina nije
u potpunosti razjašnjen.
Ori sekvenca, locirana nizvodno od gena DHFR (dihidrofolat reduktaza)
hrčka, sadrži tri definisana ori mesta inicijacije replikacije: ori β, ori β' i ori γ. Ori β
sekvenca DHFR je jak replikator i pokazuje aktivnost na ektopičnim mestima.
Premda je ori sekvenca DHFR jedna od najbolje okarakterisanih ori sekvenci kod
metazoa i u okviru nje definisani funkcionalno značajni regioni (AT bogati region,
DNR region, BEND, RIP60 region, IR 4 bp), njihova funkcija nije u potpunosti
razjašnjena.
Protein ORC (eng. Origin recognition complex) je heteroheksamer odgovoran
za prepoznavanje mesta inicijacije replikacije. Pretpostavka je da nekoliko
elemenata ima ulogu u prepoznavanju ori sekvence od strane ORC kompleksa kod
metazoa.
Funkcija ljudskog proteina Orc4 (HsOrc4) do sad nije u potpunosti
razjašnjena. Našim prethodnim istraživanjima, pokazali smo da HsOrc4 prepoznaje nekanonske strukture i ima sposobnost za utiče na formiranje TAT
tripleksa i homoadeninskih struktura.
Dosadašnja istraživanja su vršena na linearnim fragmentima, pa je u ovom
radu funkcija proteina HsOrc4 ispitivana na cirkularnoj, topološki zatvorenoj
DNK, odnosno plazmidu. Za analizu je odabrana sekvenca ori β DHFR, uklonirana
u plazmid u kojem zauzima strukturu najsličniju in vivo topologiji.
U ovom radu je analizirana struktura funkcionalno značajnih regiona ori β
DHFR sekvence: AT bogatog regiona, DNR, BEND, RIP60. Ispitivano je vezivanje
proteina HsOrc4 za superspiralizovanu formu plazmida i eventualna uloga u
remodelovanju topologije plazmida i strukture odabranih funkcionalnih regiona
ori β DHFR sekvence.
Analize su vršene nukleaznim i topoizomeraznim esejom. Nukleaza MB
(eng. Mung Bean) prepoznaje i iseca jednolančane DNK regione, pa je korišćena za
detektovanje nekanonskih struktura unutar plazmida. Topoizomeraza I relaksira
plazmid i na taj način „zaključava“ promene topologije izazvane interakcijom sa
proteinom HsOrc4.
Ovim istraživanjem je pokazano da topološki zatvoreni AT bogati region ori
β DHFR formira nekanonsku strukturu. U interakciji sa proteinom HsOrc4, ova
struktura nestaje. Moguće je da protein direktnom interakcijom modifikuje ovu
strukturu ili da je promena strukture posledica izmene topologije celokupnog
plazmida. Ostali ispitivani regioni ne zauzimaju nekanonske strukture na
neutralnom pH. Na kiselom pH 5, DNR region zauzima alternativnu strukturu,
dok AT region zauzima istu strukturu. Opstanak nekanonske strukture u okviru
AT bogatog regiona na različitim pH vrednostima unutar topološki zatvorene
sekvence ori β DHFR, za razliku od DNR regiona, sugeriše da strukture nisu
podjednako osetljive na promene pH.
Pokazano je da se protein HsOrc4 preferencijalno vezuje za
superspiralizovanu formu plazmida i modifikuje topologiju plazmida. Ove
promena topologije su reverzibilne, jer nestaju po uklanjanju proteina i da bi sve bile „zapamćene“, potrebno je prisustvo Topoizomeraze I. Protein HsOrc4 se
intenzivnije vezuje za plazmid na pH 5 u odnosu na pH 7,5, formirajući komplekse
velikih dimenzija.
Na osnovu rezultata ovog istraživanja možemo zaključiti da protein HsOrc4
uvodi topološke promene u plazmidu, koje se ispoljavaju upravo na nivou
funkcionalno značajnih elemenata ori sekvence.
