NUK - logo
E-viri
Celotno besedilo
Odprti dostop
  • Kovačević Tamara

    06/2013
    Dissertation

    Antiphospholipid antibody syndrome (APS) is an autoimmune multisystemic disorder clinically characterized by recurrent thrombosis and pregnancy morbidity, and presence of antiphospholipid antibodies (aPL) in sera of affected individuals. Presence of aPL is the most common acquired risk factor for pregnancy loss and pregnancyrelated complications. Main antigen in APS is β2-glycoprotein I (β2GPI), an evolutionarily conserved protein, which shows similarity in sequence and conformation with a number of microbial proteins. Until recently, thrombosis and inflammation were thought to be the main aPL related mechanisms leading to complications in pregnancy. More recent findings, however, indicate that aPL can exert direct effects of on placentation. This research was conducted to investigate the effects of immunoglobulins with specificity significant for APS on human extravillous trophoblast in vitro. The study included polyclonal aPL derived from APS patients (aPL+ IgG) and monoclonal antibody 26 (MAb 26) raised to tetanus toxoid with additional β2GPI specificity, originating from conformational similarity between tetanus toxoid and β2GPI. Effects of immunoglobulins with specificity important for APS on human extravillous trophoblast invasion in vitro were investigated using Matrigel invasion assay. The test showed that both aPL+ IgG and MAb 26 induce a decrease in trophoblast invasiveness, which did not result from a change in cell viability, proliferation, or apoptosis. Both antibodies, however, did affect the expression of characteristic proteins that are known to act as mediators of cell invasion. The aPL+ IgG induced decrease in trophoblast invasiveness was accompanied by reduction in matrix metalloproteinase (MMP)-9, integrin subunits α1, α5 and β1, and in levels of secreted galectin-1. Similarly, the inhibitory effect of MAb 26 on trophoblast invasion was accompanied by a decrease in MMP-2 and -9, integrin subunit α1, and galectin-1 expression. Immunocytochemistry revealed binding of both aPL+ IgG and MAb 26 to extravillous trophoblast cells. The observed binding was persistent in the absence of exogenous β2GPI and other factors derived from fetal calf serum used for cell culture. That implies expression of endogenous β2GPI, or putative receptor(s) that can bind aPL directly. Internalization of aPL in to various cell types (endothelial cells, macrofages, syncitiotrophoblast) has been reported, and represents a novel mechanism of aPL induced effects. Analysis of both types of trophoblast cells following incubation with aPL+ IgG and MAb 26 revealed intracellular localization of the antibodies in some of the cells. Number of cells with intracellular localization of the antibodies, as well as the staining intensity, positively correlated with the duration of incubation. MAb 26 internalization into HTR-8/SVneo cell was active and temperature dependent process indicating involvement of endocytosis. The absence of significant internalization of immunoglobulins used as control (aPL- IgG or mIgG) implies that the process was not Fc receptor mediated. No cell type specific difference was observed in the internalization of MAb 26. Further analysis of MAb 26 cell localization, using confocal microscopy and specific markers of cell compartments, confirmed the intracellular presence of MAb 26. After 2 h of exposure the highest proximity of the signal to the MAb 26 was determined for caveolin-1 and clathrin coated vesicles, indicating that MAb 26 localizes near inner side of cell membrane. The original results presented in this study contribute to the understanding of the mechanisms and molecules that may be involved in defective placentation induced by aPL. In addition, the effectiveness of anti-β2GPI antibody used, likely derived through molecular mimicry, opens new avenues in research of autoimmunity. Antifosfolipidni sindrom (APS) je autoimunsko oboljenje koje klinički karakteriše ponavljana pojava tromboze i/ili poremećaji u trudnoći, a serološki prisustvo antifosfolipidnih antitela (aPL). Prisustvo aPL predstavlja najčešći stečeni faktor rizika za gubitak trudnoće i komplikacije u trudnoći. Smatra se da je glavni antigen u APS β2-glikoprotein I (β2GPI), evolutivno konzerviran protein, koji je po sekvenci i konformaciji sličan velikom broju proteina mikrobskog porekla. Do nedavno se smatralo da su tromboza i inflamacija u placenti najznačajniji mehanizmi kojima aPL ostvaruju patološki uticaj na tok i ishod trudnoće, ali novija saznanja ukazuju da aPL antitela direktno utiču na proces placentacije. U ovom radu je ispitivan uticaj imunoglobulina sa specifičnošću značajnom za antifosfolipidni sindrom na ekstravilusni trofoblast čoveka in vitro. Studija je obuhvatila ispitivanje efekata poliklonskih aPL koja su prečišćena iz seruma pacijenata sa APS i monoklonskog antitela 26 (MAb 26) prema tetanus toksoidu, koje poseduje i specifičnost prema β2GPI. Time je omogućeno bolje razumevanje uloge heterogene populacije aPL koja je prisutna u serumu pacijenata, kao i antitela jasno definisane specifičnosti prema β2GPI u procesima koji dovode do defektne placentacije. Ispitivanjem in vitro uticaja imunoglobulina sa specifičnošću značajnom za APS na invazivnost ekstravilusnog trofoblasta čoveka, testom ćelijske invazije u Matrigel, pokazano je da aPL+ IgG i MAb 26 smanjuju invazivnost trofoblasta. Uočeni efekat nije bio posledica smanjene vijabilnosti i proliferacije ćelija, niti povećane apoptoze. Oba ispitivana antitela su uticala na ekspresiju karakterističnih proteina koji imaju ulogu u ćelijskoj invazivnosti. Efekat aPL+ IgG na trofoblastnu invaziju je posredovan inhibitornim delovanjem na matriksnu metaloproteinazu (MMP)-9, integrinske subjedinice α1, α5 i β1 i sekretovani galektin-1, dok MAb 26 svoje efekte ostvaruje inhibitornim delovanjem na MMP-2 i -9, α1 subjedinicu integrina i galektin-1. Vezivanje aPL+ IgG i MAb 26 za ekstravilusnu trofoblastnu ćelijsku liniju HTR-8/SVneo, kao i vezivanje MAb 26 za citotrofoblast (CT) izolovan iz placente prvog trimestra, je potvrđeno imunocitohemijskom analizom. Ispitivana antitela se vezuju za ćelije trofoblasta i u odsustvu egzogenog β2GPI i drugih faktora prisutnih u fetalnom telećem serumu, ukazujući na ekspresiju endogenog β2GPI ili još uvek nedefinisanog receptora koji bi mogao da direktno vezuje antitela. Iz literature je poznata internalizacija aPL u pojedine ćelijske tipove (endotelne ćelije, makrofage, sinciciotrofoblast), što predstavlja nov koncept na osnovu koga bi aPL mogla ostvariti patološki efekat. Analiza HTR-8/SVneo ćelija nakon inkubacije sa aPL+ IgG i MAb 26 je pokazala lokalizaciju antitela unutar ćelija. Broj ćelija kod kojih se uočava intracelularna lokalizacija imunoglobulina, kao i intenzitet bojenja, u direktnoj je korelaciji sa dužinom trajanja inkubacije. Internalizacija MAb 26 u HTR-8/SVneo ćelije je aktivan proces koji zavisi od temperature na kojoj se inkubacija odvija, što ukazuje na endocitozu kao mogući mehanizam internalizacije antitela. Sa druge strane, odsustvo internalizacije imunoglobulina koji su korišćeni kao kontrola (aPL- IgG i mIgG) ukazuje da proces internalizacije verovatno nije posredovan Fc receptorom. Nije uočena zavisnost od tipa ekstravilusnih trofoblastnih ćelija za internalizaciju MAb 26. Ispitivanje lokalizacije MAb 26 u odnosu na odeljke unutar ćelije, primenom odgovarajućih markera, je potvrdilo unutarćelijsko prisustvo MAb 26. Nakon 2 h najveća blizina u detektovanim signalima kod dvojnog bojenja je uočena za MAb 26 i kaveolin-1, kao i klatrin, što ukazuje na lokalizaciju MAb 26 neposredno uz ćelijsku membranu. Dobijeni rezultati predstavljaju napredak u razumevanju mehanizama i molekula uključenih u patološke promene placente pod delovanjem aPL. Pored toga, biološki efekat izazvan korišćenim anti-β2GPI antitelom, obzirom na način njegovog nastanka posredstvom molekulske mimikrije, otvara nove pravce u istraživanju autoimunosti.