NUK - logo
E-viri
Celotno besedilo
Odprti dostop
  • Petrović Milan

    10/2012
    Dissertation

    Since the beginning of this century the bone tissue engineering has developed into one of the essential research fields in reconstructive medicine, as an alternative approach compared with the conventional bone transplants. The main objective of this kind of therapy is to repair, regenerate and reconstruct the damaged or disease-stricken tissue. Tissue engineering is based on scaffolds which are of various biomaterials capable of participating in the process of bone tissue regeneration. A great number of materials has been researched and analyzed so as to be used as a scaffold for cell seeding. Therefore, the scaffold would enable those cells to grow, proliferate and penetrate the bone defects, whereupon the new tissue would take over the structure and function of the damaged tissue. Hydroxyapatites and other calcium phosphate materials were widely used as bone replacements for more than two decades. However, the poor mechanical features of porous hydroxyapatites led to their limited use. In case when they are combined into the compound materials together with polymer/biopolymer thin films, the porous hydroxyapatites acquire optimal characteristics required by scaffolds, which can offer excellent conditions for cell infiltration, growth and activity which is necessary in bone tissue engineering. The main objective of the doctoral dissertation was to carry out the characterization, examine the biocompatibility and biofunctionality of porous hydroxyapatite created by the modified hydrothermal method (pHAP), porous hydroxyapatite created by the modified hydrothermal method in combination with PLGA (Phap + PLGA) and porous hydroxyapatite created by the modified hydrothermal method in combination with metformin (pHAP + metformin). The research included the characterization of the tested materials by means of Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), X-ray distraction method (XRD), atomic forse microscopy method (AFM), scanning electorn microscopy analysis(SEM) and BET method. Biocompatibility was examined by MTT test (indirect contact of the tested materials with the cell culture L 929 fibroblasts), LDH test (direct contact of the tested materilas with the cell culture L929 fribroblasts) and test of local effects on skin in rabbits. Biofunctionality of the examined materials was researched by their implatation into defects of critical size of 6mm in the region of parietal bone in rabbits. After 12 weeks the animals were sacrifised, and tissue samples were prepared for pathohistological analysis. By means of the optical microscopy the following parametres were determined both quantitatively and qualitatively: the size of the defect, the presence of giant cells, the presence of neoangiogenesis, the presence of basophils, the presence of nonspecific inflammation in the tissue, the appearance of the newly created bone, the presence of fibroplasia in the tissue and the percentage of mineralization. The results showed that the examined scaffolds were perfectly designed and they had the ideal surface morphology which had an impact on how the hydroxyapatite deposit as well as on the material surface activity necessary for scaffolds. The examined materilas indicated the presence of cytotoxicity in indirect contact with cell culture, but also showed that their surfaces, in direct contact with cell culture, are suitable for cell adhering and their proliferation, and furthermore, they have features which enable the cell growth. The results of the test of local effects on skin in rabbits, showed that none of the examined materilas causes irritation and can be considered as non-irritating, so due to that fact they are suitable for in vivo application. The porouse hydroxyapatite and compound scaffold pHAP with PLGA led to the creation of the new bone together with considerable presence of mineralization in critical sized defects. According to this reasearch, pHAP with PLGA has proved to be equal, and to certain parameters, even better than the applied BioOssR golden standard. pHAP with metformin did not show expected results. The research has shown that, in further experiments, pHAP together with PLGA can be the basis for generating the scaffold in bone tissue engineering and provide settlement of osteoblasts or any of osteoblast precursors, their growth and differentiation. Tkivno inženjerstvo koštanog tkiva se u ovom veku razvilo u jedno od glavnih polja istraživanja u regenerativnoj medicini. Ono predstavlja alternativni pristup u odnosu na konvencionalne koštane transplantate. Osnovni cilj ove vrste terapije je da popravi, regeneriše i rekonstruiše oštećeno ili bolešću zahvaćeno tkivo. Osnovu tkivnog inženjerstva čine ćelijski nosači koji predstavljaju razne vrste biomaterijala sposobnih da učestvuju u regeneraciji koštanog tkiva. Veliki broj materijala je istraživan i analiziran sa ciljem da se koristi kao ćelijski nosač na koji bi mogle da se zasejavaju ćelije. Ćelijski nosač koji bi tim ćelijama omogućio rast, proliferaciju i njihovo unošenje u defekte kosti nakon čega bi novostvoreno tkivo preuzimalo strukturu i funkciju obolelog dela tkiva. Hidroksiapatiti i drugi kalcijum fosfatni materijali imali su široku upotrebu kao koštani zamenici više od dve decenije. Zbog loših mehaničkih osobina poroznih hidroksiapatita došlo je do ograničenja njihove primene. U slučaju kada se kombinuju u kompozitne materijale sa odgovarajućim polimer/biopolimer tankim filmovima, porozni hidroksiapatiti dobijaju optimalne osobine potrebne ćelijskim nosačima, koje mogu pružiti odlične uslove za infiltraciju, rast i aktivnost ćelija neophodnih u tkivnom inženjerstvu kosti. Osnovni cilj doktorske disertacije bio je izvršiti karakterizaciju, ispitati biokompatibilnost i biofunkcionalnost poroznog hidroksiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom(pHAP), poroznog hidroksiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom u kombinaciji sa PLGA (pHAP+PLGA) i poroznog hidroksiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom u kombinaciji sa metforminom (pHAP+metformin). Istraživanje je podrazumevalo karakterizaciju ispitivanih materijala uz pomoć Fourier transform infracrvene spektroskopije (FTIR), metodom rentgen difrakcije (XRD), metodom atomski forsirane mikroskopije (AFM), analizom skening elektronske mikroskopije (SEM) i BET metodom. Biokompatibilnost je ispitivana pomoću MTT testa (indirektni kontakt ispitivanih materijala sa ćelijskom kulturom L 929 fibroblasta), LDH testa (direktni kontakt ispitivanih materijala sa ćelijskom kulturom L 929 fibroblasta) i testom kutane iritacije. Biofunkcionalnost ispitivanih materijala bila je istraživana njihovom implantacijom u defekte kritične veličine od 6 mm u predelu kalvarije kunića. Nakon 12 nedelja životinje su bile žrtvovane, a uzorci tkiva su obrađeni za patohistološku analizu. Optičkom mikroskopijom kvantitativno i kvalitativno obrađivani su sledeći parametri: veličina defekta, prisustvo džinovskih ćelija, prisustvo neoangiogeneze, prisustvo bazofila, postojanje znakova nespecifičnog zapaljenja u tkivu, pojava novostvorene kosti, prisustvo fibroplazije u tkivu i procenat mineralizacije. Rezultati istraživanja pokazuju da su ispitivani ćelijski nosači bili savršeno dizajnirani i da su imali idealnu morfologiju površine koja je uticala na način deponovanja hidroksiapatita kao i na aktivnost površine materijala neophodne za ćelijske nosače. Ispitivani materijali pokazali su postojanje citotoksičnosti u indirektnom kontaktu sa kulturom ćelija, ali i da su njihove površine u direktnom kontaktu sa kulturom ćelija pogodne za adheriranje ćelija i za njihovu proliferaciju i da se odlikuju karakteristikama koje omogućavaju rast ćelija. Rezultati testa kutane iritacije pokazali su da ni jedan od ispitivanih materijala ne izaziva iritaciju i da se mogu smatrati neiritirajućim pa su iz tog razlog pogodni za primenu u in vivo uslovima. Porozni hidroksiapatit i kompozitni ćelijski nosač pHAP sa PLGA doveo je do stvaranja nove kosti uz značajno prisustvo mineralizacije u defektima kritične veličine kalvarije kunića. pHAP sa PLGA se pokazao, na osnovu ovog istraživanja jednak, a po nekim parametrima i bolji od primenjenog zlatnog standarda BioOss-a. pHAP sa metforminom nije pokazao očekivane rezultate. Istraživanje je pokazalo da pHAP sa PLGA u daljim eksperimentima može da posluži kao osnova za dobijanje ćelijskog nosača u tkivnom inženjerstvu kosti i da omogući vezivanje osteoblasta ili nekog od prekursora osteoblasta, njihov rast i diferencijaciju.