VSE knjižnice (vzajemna bibliografsko-kataložna baza podatkov COBIB.SI)
  • Optimizacija izražanja in čiščenja rekombinantne glikoziltransferaze O-β-N-acetilglukozamin transferaze = Expression and purification optimization of recombinant O-linked β-N-acetylglucosamine transferase : enoviti magistrski študij farmacije : Uniform Master's Pharmacy Program
    Pavšič, Selena
    Protein O GlcNAc transferaza OGT je edini encim, ki katalizira pripenjanje beta N acetilglukozamina na hidroksilno skupino aminokislinskih ostankov serina in treonina znotrajceličnih proteinov. N ... acetilglukozaminilacija je obsežna dinamična posttranslacijska modifikacija, ki se močno prepleta s signalnimi potmi fosforilacije proteinov. Modificirani proteini so vključeni v mnoge celične procese, motnje v njihovi homeostazi pa so povezane s številnimi kroničnimi boleznimi. Zaradi biološkega pomena OGT predstavljajo zaviralci ključno orodje za razumevanje mehanizmov modifikacije, odkrivanje njenih neznanih vlog ter validiranje OGT kot terapevtske tarče. Učinkovita proizvodnja funkcionalnih proteinov v heterolognih gostiteljskih sistemih je eden izmed glavnih temeljev sodobne biotehnologije. V magistrski nalogi smo se posvetili optimizaciji izražanja in čiščenja rekombinantnega proteina OGT. Namen naloge je bil pridobiti aktiven in kromatografsko čist protein ustrezne koncentracije z uporabo ekspresijskega sistema E. coli. V prvem delu naloge smo protein testno izražali pri različnih koncentracijah induktorja v treh bakterijskih sevih NiCo21DE3, Rosetta gami2DE3pLysS in SHuffle T7 Express lysY. Za izboljšanje izražanja smo ekspresijska sistema NiCo21DE3 ter SHuffle T7 Express lysY transformirali s plazmidom pRARE2, ki vsebuje sedem tRNA za prepoznavo redkih kodonov. Analiza celičnih lizatov s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata je pokazala, da ima OGT najvišjo stopnjo izražanja v bakterijskem sevu NiCo21DE3 z vstavljenim pRARE2 pri koncentraciji induktorja 0,2 mM. Drugi del magistrske naloge zajema večstopenjsko čiščenje proteina, pridobljenega z izražanjem v povečanem obsegu. Preskušali smo vplive načina celične lize na ustrezno strukturo proteina, način odstranjevanja nativnih proteinov E. coli ter tehnike koncentriranja proteina za dosego želene količine in čistote. Za najuspešnejše se je izkazala liza bakterijskih celic s soniciranjem, kombinacija izolacije in čiščenja s kovinsko kelatno kromatografijo in gelsko filtracijo ter končno koncentriranje z ultrafiltracijo. V vse pufre smo dodali 0,1 odstotek Tweena 20. Doseženo ustrezno koncentracijo smo potrdili spektrofotometrično, čistoto z vizualizacijo lise pravilne velikosti na poliakrilamidnem gelu, aktivnost pa s kvantitativnim encimskim testom na osnovi fluorescence.
    Vrsta gradiva - magistrsko delo ; neleposlovje za odrasle
    Založništvo in izdelava - Ljubljana : [S. Pavšič], 2021
    Jezik - slovenski
    COBISS.SI-ID - 75459587

Knjižnica/institucija Kraj Akronim Za izposojo Druga zaloga
Fakulteta za farmacijo, Ljubljana Ljubljana FFALJ v čitalnico 1 izv.
loading ...
loading ...
loading ...

Vnos na polico