İnsan karaciğer pirüvat kinazı saflaştırılarak kinetik özellikleri araştırılmıştır. İnsan karaciğer pirüvat kinazı amonyum sülfat ile çöktürme, dializ ve Sefadex G-200 kromatografiyi içeren 3 safha ...ile saflaştırılmıştır. L tip pirüvat kinaz enzimi insan karaciğer dokusunda %13.2 ürünle yaklaşık 26.3 kat saflaştırılabilmiştir. Enzimin spesifik aktivitesi 2.6 U/mg protein bulunmuştur. İnsan karaciğer pirüvat kinazı için optimal pH 7.4 olarak saptanmıştır. Ca+2 iyonu enzimi inhibe, K+, Mg+2, Mn+2 ve Na+ iyonları ise aktive etmiştir. Pirüvat kinaz FDP, ADP ile düzenlenmiş, alanın ile inhibe edilmiştir. PEP ve ADP için Km değerleri sırası ile 1.2 ve 0.3 mM bulunmuştur. 2,3-DPG ve ATP konsantrasyon artışına bağlı olarak başlangıçta enzimi aktive daha sonra inhibe etmiştir.
The kinetic properties of pyruvate kinase purified from human liver were investigated. Human liver pyruvate kinase was purified by three-step process involving ammonium sulphate precipitation, dialysis and Sephadex G-200 chromatography. L type of pyruvate kinase enzyme was able to be purified about 26.3-fold with 13.2% yield in human liver. Specific activity of the enzyme was found to be 2.6 U/mg protein. The optimal pH for human liver pyruvate kinase was found to be 7.4. K+, Mg2+, Mn2+ and Na+ ions activated enzyme whereas Ca2+ ions inhibited it. The enzyme was regulated by FDP, ADP and pyruvate kinase activity was inhibited by alanine. The Km values for PEP and ADP were 1.2 and 0.3 mM respectively. 2,3-DPG and ATP were found to initially activate and subsequently inhibit the enzyme, as the concentration of 2,3-DPG and ATP increased.
Wistar-Albino cinsi erkek ratlara tek doz streptozocin (60 mg/kg) intraperitoneal verilerek diabetes mellitus oluşturulmuştur. Normal ve streptozosin etkisi ile diabet oluşturulan rat karaciğer ...dokusunda pirüvat kinaz enziminin kinetik özellikleri araştırılmıştır. Normal rat karaciğer doku pirüvat kirazının inkübasyon zamanı 15 dakika, optimum pH'sı 8; diabetik rat karaciğer doku pirüvat kinazmın inkübasyon zamanı 10 dakika, optimum pH'sı 7 olarak bulunmuştur. Magnezyum klorür ve potasyum klorür, normal ve diabetik rat karaciğer dokusunu aktive etmiştir. Enzim substrat olan fosfoenolpirüvat fruktoz l ,6 difosfat yokluğunda sigmoidal eğri gösterirken, fruktoz 1,6 difosfat varlığında eğri hiperbolik Michaelis-Menten kinetiğine dönüşmektedir. Pirüvat kinazmın fosfoenolpirüvat için Km değerinin normal ve diabetik karaciğer dokusunda farklılıklar gösterdiği ve fruktoz 1,6 difosfatın Km değerini düşürdüğü tespit edilmiş olup diabetik karaciğer dokusunda enzimin fosfoenolpirüvata ilgisinin azaldığı saptanmıştır.
Diabetes mellitus was induced in Wistar-Albino type male rats with a single dose of streptozotocin (60 mg/kg intraperitoneally). The kinetic properties of pyruvate kinase were investigated in normal and diabetic rat liver tissue. In normal rat liver tissue, the incubation period of pyruvate kinase was 15 min and the optimum pH was 8. In diabetic rat liver tissue, the incubation period of pyruvate kinase was 10 min and the optimum pH was 7. Activation was found in normal and diabetic rat liver tissues with magnesium chloride and potassium chloride. Phospho(enol)pyruvate is an enzyme substrate; in the absence of the fructose-1,6-diphosphate its graphic showed a sigmoidal plot, and in the presence of the fructose-1,6-diphosphate its graphic turned into a hyperbolic plot of Michaelis-Menten kinetics. Different Km pyruvate kinase values for phospho(enol)pyruvate were found in normal and diabetic liver tissues, and the Km value of fructose-1,6-diphosphate was determined as low. A low phospho(enol)pyruvate enzyme affinity was identified in diabetic liver tissue.
İnsan normal ve tümör meme doku pirüvat kinazı saflaştırılarak moleküler ağırlığı ve kinetik özellikleri araştırılmış, normal meme dokusu ile tümör meme dokusu pirüvat kinaz aktivite düzeyleri ...karşılaştırılmıştır.
DEAE Sefadeks A-SO kromatografi ile meme dokusunda pirüvat kinazın iki farklı formunun varlığı gösterilmiştir. SDS-PAGE ile alt birimlerinin moleküler ağırlığı normal dokuda 1. pikte 30.000 Da, II. pikte 63.000 Da, tümör dokusunda ise 1. pikte 16.500 Da, II. pikte 60.000 Da olarak saptanmıştır. Pirüvat kinaz aktivitesi tümör meme dokusunda normal meme dokusuna göre 5,2 kat fazla bulunmuştur. Pirüvat kinaz enzimi normal meme dokusunda 1. pik 1591 kat, II. pik 636,4 kat, tümör dokusunda I. pik 219 kat, II. pik ise 318 kat saflaştırılabilmiştir.
Reaksiyon hız eğrisi normal ve tümör meme dokusu pirüvat kinazının 1. pikinde hiperbolikti ve FDP tarafından aktive edilmemiştir. II. pikte reaksiyon hız eğrisi tümör meme dokusunda hiperbolik, normal meme dokusunda ise sigmoidaldır ve FDP tarafından aktive edilmiştir. Hill katsayısı PEP için enzimde en az iki bağlanma bölgesinin varlığını göstermiştir.
İnsan meme dokusundan izole edilen pirüvat kinaz izoenzimleri diğer doku pirüvat kinaz izoenzimleri ile karşılaştırıldığında bunların M, ve M2 izoenzim olduğu ve normal meme dokusundaki M2 izoenzimin tümör meme dokusunda K izoenzime dönüşebileceği düşünülebilir.
The molecular weight and kinetic properties of pyruvate kinase purified from human normal and tumor breast tissues were studied and the activity levels of pyruvate kinase from normal and tumor breast tissues were compared.
The presence of 2 forms of pyruvate kinase in human breast tissue was demonstrated by DEAE Sephadex A-50 chromatography. The molecular weight of subunits estimated by SDS-PAGE in forms I. and II. in normal breast tissue and in forms I. and II. in tumor breast tissue were 30,000 and 63,000 Da and 16,500 and 60,000 Da, respectively. It was found that the pyruvate kinase activity in tumor tissue was 5.2 times higher than that in normal tissue. Peaks I and II of pyruvate kinase were able to be purified about 1591-fold and 636.4-fold in normal breast tissue, and 219-fold and 318-fold in tumor breast tissue, respectively.
The reaction rate curve was hyperbolic in the first peaks of both normal and tumor breast tissue pyruvate kinase and was not activated by fructose-1, 6-diphosphate (FDP). Reaction rate curves in the second peaks of tumor breast tissue and normal breast tissue pyruvate kinase were hyperbolic and sigmoidal, respectively, and were activated by FDP. The Hill coefficient showed that there were at least 2 binding regions in the enzyme for PEP.
When compared with other tissue pyruvate kinase isozymes, it seems likely that the isoenzymes of pyruvate kinase isolated from human breast tissue were M, and M2 isozymes and that the M2 isozyme of pyruvate kinase from normal breast tissue changed into K isoenzyme in tumor breast tissue.
