Le virus JC peut entraîner une atrophie cérébelleuse rapide par infection des neurones de la couche des grains du cervelet, parfois sans lésion de leuco-encéphalite multifocale progressive (LEMP) ...associée.
Nous rapportons 5 cas de granulopathie cérébelleuse due au JC virus (GC-JC) survenus au cours d’une infection par le VIH.
Cinq dossiers de patients examinés dans le service de neurologie de l’hôpital de St-Denis de 2004 à 2011 ont été analysés rétrospectivement. Le diagnostic de GC-JC a été retenu sur les critères suivants : atteinte clinico-radiologique exclusive de la fosse postérieure, absence d’autre cause, présence d’ADN du virus JC dans le LCR par PCR (GC-JC définie) ou pas (GC-JC clinique présumée).
Les cinq patients étaient tous profondément immunodéprimés (entre 20 et 100 CD4/mm3). L’IRM initiale était normale ou montrait une atrophie isolée progressive du cervelet. La recherche d’ADN du virus JC dans le LCR était positive dans 4 cas. Les IRM successives montraient une atrophie majeure du cervelet puis un hypersignal plus ou moins marqué du cervelet, du pont, des pédoncules cérébelleux moyens et souvent un aspect de croix pontique.
La littérature montre que l’infection de la fosse postérieure par le JC virus existe, soit dans le cadre d’une LEMP classique, supra et/ou infra-tentorielle, soit plus rarement sans atteinte de la substance blanche. L’infection des neurones de la couche des grains du cervelet est en fait fréquente chez l’immunodéprimé, et responsable en cas d’infection active d’une perte neuronale.
Une atrophie rapide et isolée du cervelet chez un patient immunodéprimé doit faire évoquer une granulopathie cérébelleuse liée au JC virus. Le diagnostic repose sur l’IRM et la mise en évidence du virus JC dans le LCR.
Chez les Archaea, tous les processus informationnels, transcription incluse, sont effectués par des protéines proches de celles des Eukarya. Alors que la machinerie transcriptionnelle des archées a ...été bien caractérisée structurellement et fonctionnellement, très peu d'informations sont disponibles sur la régulation de son activité. En travaillant à la fois avec des modèles cellulaires (crénarchée hyperthermophile Sulfolobus islandicus) et viraux, nous avons pu réaliser une étude approfondie de trois régulateurs transcriptionnels et mieux comprendre les mécanismes de régulation transcriptionnelle chez les archées. Au cours de cette thèse, deux régulateurs viraux, SvtR et AFV1p06, et un régulateur cellulaire, Sta1, ont été étudiés. Concernant SvtR, codé par le virus SIRV1 qui infecte S. islandicus, nous avons poursuivi la recherche précédente, qui avait permis de déterminer sa structure et sa fonction, en nous focalisant sur la caractérisation de l'ensemble de ses cibles dans le génome viral et sur l'étude de son mécanisme d'action. Pour cela, la séquence du site consensus reconnu par SvtR a été établie à l'aide de la mutagénèse systématique d'un de ses sites déjà caractérisés. Ce site est présent dans les promoteurs de dix gènes de SIRV1 montrant que SvtR pourrait réguler l'activité de plus de 20% des gènes viraux. Ses cibles incluent tous les gènes codant pour les protéines de la capside virale. L'analyse fonctionnelle réalisée sur une partie des sites de liaison de SvtR a permis de démontrer qu'il s'agit d'un régulateur polyvalent agissant, selon la cible, en tant que activateur ou répresseur transcriptionnel. En prenant comme modèle le promoteur du gène gp30, nous avons pu démontrer par plusieurs approches que la régulation de ce promoteur inclut la polymérisation de la protéine depuis son site de liaison principal jusqu’à la TATA-box du promoteur. Il s’agit d’un mécanisme de régulation de transcription à distance original et inédit chez les archées. La structure de l’autre régulateur viral étudié, AFV1p06, codé par le virus AFV1 qui infecte Acidianus hospitalis, révèle la présence au sein de cette protéine d’un domaine en doigt de zinc C2H2, considéré jusqu’à présent comme spécifique des eucaryotes. Nous avons démontré la capacité d’AFV1p06 à se lier à l’ADN avec une préférence pour les régions riches en GC. AFV1p06 est la première DNA binding protéine d’archées de ce type caractérisée in vitro. Le troisième régulateur transcriptionnel, Sta1, est codé par le génome des Sulfolobales. Il est capable d’activer la transcription de gènes viraux, ainsi que du gène chromosomique radA en réponse à un dommage à l’ADN. Pour comprendre son rôle dans la cellule, nous avons tenté de réaliser, sans succès, un mutant knock-out du gène sta1 de S. islandicus RYE15A, ce qui indique que le gène sta1 serait un gène essentiel. L’étude de l’interaction hôte-virus sur le modèle S. islandicus LAL14/1 est un des sujets principaux de notre laboratoire. Le séquençage du génome de cette souche a ouvert la voie pour établir un système génétique. Plusieurs mutants KO de LAL14/1 (pyrEF-; ΔCRISPR1) ont été construits. L’impossibilité d’inactiver un autre gène candidat, topR2, codant pour une réverse gyrase, indique qu’il s’agit d’un gène essentiel. La construction du mutant ΔCRISPR1 est la première étape pour obtenir un dérivé de LAL14/1 dépourvu de système CRISPR, un mutant très utile pour mieux comprendre l’implication des CRISPRs dans le phénotype de résistance de LA14/1 au virus SIRV1 et leur rôle chez les archées en général. L’ensemble des résultats de cette thèse contribue à la meilleure compréhension du fonctionnement moléculaire chez les archées et leurs virus.
In Archaea cells all information processes, including transcription, are performed by the Eukarya-like proteins. While the transcriptional machinery of archaea has been well characterized structurally and functionally, very few information concerning the regulation of its activity is available. By working with both cell (crenarchaeota Sulfolobus islandicus) and viral models, we have performed an in-depth study of three transcriptional regulators: two viral regulators, SvtR and AFV1p06, and a cell regulator Sta1. The obtained results allow to better understand the mechanisms of transcriptional regulation in archaea. Concerning the protein SvtR encoded by the virus SIRV1 that infects S. islandicus, we continued the research project that had identified its structure and function. We were focused on identification and characterization of all of SvtR targets in the viral genome and on the study of the mechanisms of regulation. For this purpose, we established the sequence of consensus site recognized by SvtR using systematic mutagenesis of one of its previously characterized binding sites. This site is present in the promoters of 10 genes meaning that SvtR may regulate the activity of more than 20% of SIRV1 genes. Its targets include all known genes encoding proteins of the viral capsid. Functional analysis of SvtR has demonstrated that, according to the target, this protein is a versatile regulator acting as transcriptional activator or repressor. Taking as a model the gp30 gene promoter, we demonstrated by several approaches that regulation of this promoter includes the polymerization of the protein from its primary binding site towards the TATA-box. Such a mechanism of transcriptional regulation is new in archaea. Second, we performed a structural analysis of the protein AFV1p06 encoded by the virus AFV1 which infects Acidianus hospitalis. The structural analysis of AFV1p06 revealed the presence of a C2H2 zinc finger domain regarded hitherto as specific to eukaryotes. We demonstrated that AFV1p06 has ability to bind specifically to DNA sequences rich in GC. AFV1p06 is the first archaeal DNA binding protein with zinc finger domain characterized in vitro. The third transcriptional regulator, Sta1 is encoded by the genome of Sulfolobales. The protein RadA is able to activate the transcription of viral as well as chromosomal genes in response to DNA damage. To understand its role in the cell, we attempted, without success, to knockout the sta1 gene in S. islandicus RYE15A. This result indicates that the sta1 gene is probably essential. The strain S. islandicus LAL14 /1 is a model strain to study host-virus interaction in archaea. The sequencing of the genome of this strain opened the way to establish a genetic system for this model and allowed us to construct knockout mutants for several LAL14/1 genes (pyrEF-; ΔCRISPR1). Our unsuccessful attempts to inactivate topR2, another candidate gene encoding reverse gyrase indicate that topR2 function could be essential. The construction of the ΔCRISPR1 mutant opens the way to obtain a derivative of LAL14/1 entirely lacking the CRISPR system. Such a mutant will be very useful for the future studies of function and role of CRISPRs in archaea in general but also will allow to verify the hypothesis of involvement of CRISPRs in the phenotype of resistance of LA14/1 to SIRV1. All the results of this thesis contribute to an improved understanding of molecular mechanisms in archaeal cells and their viruses.
Le virus de l’herpès simplex de type 1 (HSV-1), un virus neurotrope, affecte environ 80 % de la population. Il peut causer des feux sauvages, des kératites virales ou dans des rares cas des ...encéphalites virales. Chez des patients immunosupprimés et chez les nouveau-nés, l’infection peut être très sévère.Le gène codant pour la protéine virale UL24 est conservé parmi tous les Herpesviridae. Un virus déficient en UL24 est affecté, entre autres, dans son efficacité de réplication et de réactivation à partir de l’état de latence. En contexte de transfection, l’expression d’UL24 corrèle avec une réduction de l’expression de la protéine virale R1, une enzyme impliquée dans la synthèse de l’ADN viral, ainsi que celle d’autres gènes viraux (ICP27, R2, TK et gC) et sa propre expression. Ces gènes viraux ne possèdent pas de similitude de séquence mais ils ont un contenu en guanidine et cytosine (GC) élevé. L’impact d’UL24 s’est manifesté par un effet sur l’accumulation des transcrits, quoique la stabilité des transcrits de R1 n’était pas affectée. L’effet observé était spécifique aux gènes viraux puisqu’aucune réduction d’expression n’a été observée pour les gènes GST ou mCherry, malgré le taux élevé en GC de ce dernier. Aussi, des versions mutées d’UL24 dans des résidus hautement conservé inhibe la réduction de l’expression de gènes viraux. L’orthologue d’UL24 chez l’herpès simien « B-virus » était également capable de réduire l’expression de R1. Ces résultats suggèrent que la fonction régulatrice de l’expression de gènes viraux d’UL24 n’est pas uniquement spécifique au HSV-1 mais aux Alphaherpesvirinae. Afin d’identifier l’élément dans la séquence de R1 qui confie la susceptibilité à la régulation par UL24, une librairie de quatre plasmides codant pour des fragments de R1 fusionnés à GST a été créée. UL24 a réduit l’expression des quatre fragments de R1 suggérant que la reconnaissance des gènes viraux par UL24 peut être due à la présence d’un ou plusieurs motifs dans leurs séquences. En plus de GST, l’insertion d’un fragment de R1 dans le cadre de lecture ouvert de cherry, dont l’expression n’est normalement pas susceptible d’être régulée par UL24 est suffisante pour induire une reconnaissance et une diminution de l’expression de ces protéines chimères par UL24 en contexte de transfection transitoire. Une quantification par qPCR a révélé qu’UL24 entraine une diminution de 50% des ADN plasmidique contenant R1 et R2 mais pas mCherry.En contexte d’infection, l’absence d’UL24 induit une suraccumulation des transcrits viraux R1 et R2 relative à la quantité d’ADN viral. Ces données montrent un nouveau rôle de la protéine UL24 dans la régulation de l’expression de gènes viraux qui pourrait avoir un impact sur la réactivation virale. Nous proposons un modèle où UL24 pourrait réguler à la baisse l’expression de gènes viraux (de différentes cinétiques) afin de favoriser la traduction des transcrits déjà présent dans le cytoplasme dans les temps tardif de l’infection lytique. Aussi, UL24 pourrait contribuer au maintien de la latence en régulant à la baisse l’accumulation de transcrits viraux de gènes lytiques dans les neurones.
Vinca L. (Cezayir Menekşesi) Apocynaceae familyasının cinsidir ve bu cinse ait ikisi endemik olmak üzere altı takson doğal yayılış göstermektedir. Bu çalışmada, Vinca minor L. türü ve Vinca major ...subsp. major L. alttürünün doğal ve kültür formları morfolojik, anatomik ve fitokimyasal özellikleri yapılan çalışmalar sonucunda karşılaştırmalı olarak incelenmiştir.Morfolojik çalışmalarda; Vinca L. taksonlarının; kök, gövde, yaprak ve çiçeklerinin karakterleri incelenip, morfolojik deskripsiyon hazırlanarak çizimleri yapılmıştır. Anatomik çalışmalarda; kök, gövde ve yapraktan enine kesit ayrıca yapraktan üst ve alt yüzeysel kesitler alınarak incelenmiştir. Kimyasal çalışmalarda; bitkinin toprak üstü kısımlarından elde edilen uçucu yağların GC ve GC/MS çalışması yapılmıştır.Morfolojik ve anatomik çalışmalarda taksonlar arasında belirgin ayırt edici farklılıklar olmadığı gözlenmiştir. Fitokimyasal çalışmalar sonucunda her iki takson için de ß-karyofillen ve hekzadekanoik asit ana bileşik olarak bulunmuştur.
Giriş: Candida türleri konak savunma sisteminin zayıflaması durumunda ‘fırsatçı patojen’ olarak davranarak ‘kandidazis’ olarak adlandırılan enfeksiyonlara neden olurlar. Fenotipik ve genotipik açıdan ...birbirine oldukça benzer olmasından dolayı Candida albicans (Calbicans) ve Candida dubliniensis (C.dubliniensis) türlerinin tanı ve ayırıcı tanılarında zorluklar yaşanır. Candida albicans ve Candida dubliniensis türlerinin antifungallere karşı direnç – duyarlılık şekilleri farklılık gösterebildiği için, ayırıcı tanıları özellikle immün yetmezlikli hastalarda önem kazanır. C.dubliniensis’ in birçok izolatının antifungallere karşı duyarlı olmasına rağmen ‘multidrug transporter genleri’ eksprese ederek direnç geliştirebilmektedir. MIDI Sherlock Mikrobiyal tanımlama sistemi, türe özgü olan mikrobiyal yağ asidi metil esterlerini (FAME) gaz kromatografisi (GC) cihazı ile analiz ederek mikroorganizmaların identifikasyonunu sağlar.Amaç:Calbicans ATCC 10231 ve C.dubliniensis CD36standart suşlarının amfoterisin B antifungaline karşı ‘Mininmum İnhibisyon Konsatrasyonu’ (MİK) değerlerinin belirlenmesi, antifungal etkisinde biyofilm oluşumunun değerlendrilmesi ve yağ asidi profillerinin belirlenmesidir.Yöntem:Candida albicans ATCC10231 ve Candida dubliniensis CD36standart suşlarından analiz için hazır ‘hücresel yağ asitleri’ elde edildi. Amfoterisin B antifungalinin Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu (MİK) değerlerini belirlemek için Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi (EUCAST) sıvı mikro dilüsyon yöntemi kullanıldı. Antifungal etkisindeki suşların biyofilm değerlendirmesi kristal viyole boyama yöntemi ile yapıldı.Bulgular:C.albicans ATCC 10231 suşu için amfoterisin B MİK yoğunluğu 64 µg/ml olarak belirlendi.C.dubliniensis CD36 suşu için amfoterisin B MİK yoğunluğu 64 µg/ml olarak belirlendi. Antifungale maruz bırakılmayan C.albicans ATCC 10231 ve C.dubliniensis CD36 suşlarının biyofilm oluşturduğu saptandı. Suşların amfoterisin B MİK konsantrasyonlarında da biyofilm oluşturduğu görüldü. C.dubliniensis CD36 suşunun C.albicans ATCC 10231 suşuna göre yüzeye daha güçlü adere olduğu tespit edildi. Amfoterisin B antifungalinin MİK ve sub-MİK konsantrasyonları C.dubliniensis CD36 suşunun biyofilm olşumunda inhibisyona yol açarken, MİK yoğunluğu C.albicans ATCC 10231 suşunda anlamlı bir inhibisyona neden olmadığı belirlendi ve sub-MİK yoğunluklarında biyofilm oluşumunun istatiksel olarak anlamlı bir şekilde arttığı belirlendi. C.albicans ATCC 10231suşuna spesifik iki, C.dubliniensis CD36 suşuna spesifik bir referans pik olduğu belirlendi. Bir tanesi dallanma özelliği farklı olan toplam altı ortak yağ asidi referans piki elde edildi.Sonuç:C.dubliniensis CD36 ve C.albicans ATCC 10231 suşlarının amfoterisin B antifungali için MİK yoğunlukları aynı olmasına rağmen C.dubliniensis CD36 suşunun yüzeye daha güçlü adere olduğu tespit edilmiştir. C.dubliniensisCD36 suşu yüzeye daha güçlü adere olmasına karşın, amfoterisin B antifungalinin inhibisyon etkisinin C.albicans ATCC 10231suşuna göre daha fazla olduğu saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar gösteriyor ki, morfolojik ve genotipik olarak birbirine benzer olan suşlarla yapılan analizlerde elde edilebilinecek türe özgü tanı belirteçleri, enfeksiyonun tanısının konulmasında ve seyrinin izlenmesinde son derece önemlidir.
Les synapses fibres moussues de l‘hippocampe entre le gyrus denté et les cellulespyramidales de CA3 sont caractérisées par leur morphologie particulière, et par leurspropriétés distinctives de ...transmission synaptique et de plasticité présynaptique. Cessynapses sont parfois appelées «détonatrices» pour leur rôle fonctionnel dansl‘encodage de la mémoire épisodique. Cependant, les mécanismes moléculaires à labase des propriétés spécifiques de ces synapses restent peu connus. Ce travail estcomposé de deux parties principales:1) Phénotypage des synapses fibres moussues de l'hippocampe chez les sourisVAMP7 KOVAMP7 est une protéine SNARE vésiculaire de la famille des longins, qui joue unrôle dans la croissance des neurites durant le développement. Dans le cerveauadulte, VAMP7 est enrichi dans un sous-ensemble de terminaisons nerveuses, enparticulier dans les fibres moussues de l‗hippocampe. Nous avons analysé lafonction de VAMP7 dans la libération de neurotransmetteurs par une caractérisationextensive de la transmission synaptique et des mécanismes de plasticité de cettesynapse. L'absence de VAMP7 ne cause pas de graves déficits développementauxou neuronaux (Sato et al., 2011; Danglot et al., 2012). Les mécanismesprésynaptiques de la plasticité à court terme de la fibre moussue de l‘hippocampesemblent également normaux, pour des raisons éventuelles qui seront discutées.2) Circuits du CA3 examinés par traçage viral et enregistrements de pairesNous avons développé une technique pour établir des enregistrements en pairesentre cellules en grain du gyrus denté connectées et cellules pyramidales CA3 (GCCA3),sur des cultures organotypiques de tranches d'hippocampe de souris. Pouridentifier les partenaires présynaptiques directs à une cellule pyramidale CA3 ciblée,nous avons combiné l‘électroporation cellulaire unitaire et le traçage mono-transsynaptiquebasé sur un virus de la rage recombinant et pseudotypé. Nous avonstransfecté une cellule pyramidale CA3 unique par tranche avec les plasmides codantla glycoprotéine d‘enveloppe du virus de la rage (RG), un rapporteur fluorescent, etla protéine TVA (récepteur de surface apparenté au EnvA, qui n'a pas d‘homologuechez les cellules de mammifères). Les tranches ont ensuite été infectées avec levirus de la rage recombinant et pseudotypé. Après 3-4 jours, le traçage mono-transsynaptiquerévèle les entrées présynaptiques de ce neurone unique. Ensuite, nousavons pu établir des enregistrements de paires entre les cellules en grain-CA3connectés, ainsi que de quantifier les partenaires présynaptiques de la cellulepyramidale CA3 de départ.
The hippocampal mossy fiber is characterized by its particular morphology, distinctsynaptic transmission and presynaptic plasticity. Moreover, this synapse has beencalled ―teacher‖ or ―detonator‖ for its proposed functional role in episodic memoryencoding. Nevertheless, the molecular mechanisms underlying its specific functionalproperties remain elusive. This work is composed of two main parts:1) Phenotyping Hippocampal Mossy Fiber Synapses in VAMP7 KO MiceVAMP7 is a vesicle SNARE of the longin family important in neurite growth duringdevelopment. In the adult brain, VAMP7 is enriched in a subset of nerve terminals,particularly at the hippocampal mossy fiber. We analyzed VAMP7 function inneurotransmitter release by characterizing basal and evoked transmission at thissynapse in KO mice and fully tested hypotheses relevant to short-term plasticity.Loss of VAMP7 has been previously reported not to cause major developmental orneurological deficits (Sato et al., 2011; Danglot et al., 2012). Presynapticmechanisms of short-term plasticity at the hippocampal mossy fiber also seemunaffected for potential reasons that will be discussed.2) CA3 Circuits Probed with RABV-Tracing and Paired RecordingsWe developed a technique to establish paired recordings between connected dentategyrus granule cells and CA3 pyramidal cells (GC-CA3) in mouse hippocampalorganotypic slice cultures. To identify direct presynaptic partners to a defined targetCA3 pyramidal cell, we combined single-cell electroporation (SCE) and mono-transsynaptictracing based on a pseudotyped, recombinant rabies virus (EnvApseudotyped RABV ΔG). Using SCE we transfected a single CA3 pyramidal cell perslice with the plasmids encoding: the RABV envelope glycoprotein (RG), afluorescent reporter, and TVA (the EnvA cognate surface receptor, which has nohomologue in mammalian cells). The slices were subsequently infected with EnvApseudotyped RABV ΔG. After 3-4 days, the RABV mono-trans-synaptic tracingrevealed the presynaptic inputs of that single neuron. Then, we were able toestablish paired recordings between connected GC-CA3 cells, as well as to quantifythe presynaptic partners of the starter CA3 pyramidal cell.
De mosvezel van de hippocampus kenmerkt zich door een bijzondere morfologie,uitzonderlijke synaptische transmissie en presynaptische plasticiteit. De synapswordt ook wel "leraar" of "detonator" genoemd vanwege zijn waarschijnlijke rol in decodering van het episodisch geheugen. Toch blijven de specifieke moleculairemechanismen van dit synaps onbekend. Dit werk bestaat uit twee delen:1) Fenotypering van mosvezel synapsen van de hippocampus in VAMP7 KO muizenVAMP7 is een vesicle-SNARE van de longin familie van belang bij de groei vanneurieten tijdens de ontwikkeling. In de volwassen hersenen, wordt VAMP7 verrijkt ineen subset van zenuwuiteinden, vooral in de mosvezel van de hippocampus. Weanalyseerden VAMP7 functie in neurotransmitter afgifte door het karakteriseren vanbasale en opgeroepen transmissie bij deze synaps in KO muizen. Eerder is algesteld dat gebrek aan VAMP7 niet leidt tot grote ontwikkelings- of neurologischeafwijkingen (Sato et al., 2011; Danglot et al., 2012). Presynaptische mechanismenvan korte termijn plasticiteit in de mosvezel van de hippocampus lijken ookonaangetast te zijn, de mogelijke redenen hiervoor zullen worden besproken.2) CA3 circuits onderzocht met behulp van RABV-tracing en gekoppelde opnamesWe ontwikkelden een techniek om gekoppelde opnames tussen korelcellen van degyrus dentatus en aangesloten CA3 piramidale cellen (KC-CA3) op zogenaamde‗mouse hippocampal organotypic slice cultures‘ te meten. Om rechtstreeksepresynaptische partners te identificeren van een specifieke CA3 piramidale cel,combineerden we single-cell electroporation (SCE) en mono-trans-synaptic tracingop basis van een pseudo-typed, recombinant rabiësvirus (EnvA pseudogetypedRABV ΔG). Met behulp van SCE transfecteerde we één CA3 piramidale cel per slicemet plasmiden die coderen voor: het RABV glycoproteïne-envelop (RG), eenfluorescerende reporter, en TVA (de aan EnvA verwante oppervlakte receptor diegeen homoloog in zoogdiercellen heeft). De slices werden vervolgens geïnfecteerdmet ENVA pseudogetyped RABV ΔG. Na 3-4 dagen bracht de RABV mono-transsynaptischetracing de presynaptische ingangen van die ene neuron aan het licht.Hierna konden we gekoppelde opnames doen tussen verbonden KC-CA3 cellen.Daarnaast konden we de presynaptische partners van de starter CA3 pyramidale celkwantificeren.
Chez les Archaea, tous les processus informationnels, transcription incluse, sont effectués par des protéines proches de celles des Eukarya. Alors que la machinerie transcriptionnelle des archées a ...été bien caractérisée structurellement et fonctionnellement, très peu d'informations sont disponibles sur la régulation de son activité. En travaillant à la fois avec des modèles cellulaires (crénarchée hyperthermophile Sulfolobus islandicus) et viraux, nous avons pu réaliser une étude approfondie de trois régulateurs transcriptionnels et mieux comprendre les mécanismes de régulation transcriptionnelle chez les archées. Au cours de cette thèse, deux régulateurs viraux, SvtR et AFV1p06, et un régulateur cellulaire, Sta1, ont été étudiés. Concernant SvtR, codé par le virus SIRV1 qui infecte S. islandicus, nous avons poursuivi la recherche précédente, qui avait permis de déterminer sa structure et sa fonction, en nous focalisant sur la caractérisation de l'ensemble de ses cibles dans le génome viral et sur l'étude de son mécanisme d'action. Pour cela, la séquence du site consensus reconnu par SvtR a été établie à l'aide de la mutagénèse systématique d'un de ses sites déjà caractérisés. Ce site est présent dans les promoteurs de dix gènes de SIRV1 montrant que SvtR pourrait réguler l'activité de plus de 20% des gènes viraux. Ses cibles incluent tous les gènes codant pour les protéines de la capside virale. L'analyse fonctionnelle réalisée sur une partie des sites de liaison de SvtR a permis de démontrer qu'il s'agit d'un régulateur polyvalent agissant, selon la cible, en tant que activateur ou répresseur transcriptionnel. En prenant comme modèle le promoteur du gène gp30, nous avons pu démontrer par plusieurs approches que la régulation de ce promoteur inclut la polymérisation de la protéine depuis son site de liaison principal jusqu'à la TATA-box du promoteur. Il s'agit d'un mécanisme de régulation de transcription à distance original et inédit chez les archées. La structure de l'autre régulateur viral étudié, AFV1p06, codé par le virus AFV1 qui infecte Acidianus hospitalis, révèle la présence au sein de cette protéine d'un domaine en doigt de zinc C2H2, considéré jusqu'à présent comme spécifique des eucaryotes. Nous avons démontré la capacité d'AFV1p06 à se lier à l'ADN avec une préférence pour les régions riches en GC. AFV1p06 est la première DNA binding protéine d'archées de ce type caractérisée in vitro. Le troisième régulateur transcriptionnel, Sta1, est codé par le génome des Sulfolobales. Il est capable d'activer la transcription de gènes viraux, ainsi que du gène chromosomique radA en réponse à un dommage à l'ADN. Pour comprendre son rôle dans la cellule, nous avons tenté de réaliser, sans succès, un mutant knock-out du gène sta1 de S. islandicus RYE15A, ce qui indique que le gène sta1 serait un gène essentiel. L'étude de l'interaction hôte-virus sur le modèle S. islandicus LAL14/1 est un des sujets principaux de notre laboratoire. Le séquençage du génome de cette souche a ouvert la voie pour établir un système génétique. Plusieurs mutants KO de LAL14/1 (pyrEF-; ΔCRISPR1) ont été construits. L'impossibilité d'inactiver un autre gène candidat, topR2, codant pour une réverse gyrase, indique qu'il s'agit d'un gène essentiel. La construction du mutant ΔCRISPR1 est la première étape pour obtenir un dérivé de LAL14/1 dépourvu de système CRISPR, un mutant très utile pour mieux comprendre l'implication des CRISPRs dans le phénotype de résistance de LA14/1 au virus SIRV1 et leur rôle chez les archées en général. L'ensemble des résultats de cette thèse contribue à la meilleure compréhension du fonctionnement moléculaire chez les archées et leurs virus.
La voie de signalisation NF-kB (nuclear factor kB) régule la transcription de gènes impliqués dans la réponse immune et l’inflammation. L’activation chronique de cette voie est fréquemment retrouvée ...associée à des désordres inflammatoires et des cancers. Les impacts fonctionnels de l’activation de la voie NF-kB ont été jusqu’à présent étudiés à l’échelle des promoteurs. Néanmoins, les études récentes de la distribution chromatinienne de NF-kB indiquent que la sous-unité NF-kB RelA se localise majoritairement dans les régions intragéniques, incluant des exons et des introns, où ses fonctions restent inconnues. Mes travaux ont consisté à adresser cette question dans le contexte de l’infection par le virus HTLV-1, un activateur chronique de la voie NF-kB, responsable de la leucémie T de l’adulte. Mes données montrent que l’activation de la voie NF-kB par l’oncogène viral Tax de HTLV-1 s’accompagne de modifications de l’épissage alternatif d’exons riches en GC qui coïncident avec le recrutement chromatinien de RelA à proximité de ces exons régulés. Les analyses intégratives des profils d’épissage et du remodelage de la chromatine, combinées à des essais de ciblage expérimental de la chromatine (TALE), démontrent que la fixation intragénique de RelA permet de recruter le régulateur d'épissage DDX17 pour moduler l’épissage alternatif de l’exon via son activité hélicase. Ces données révèlent que, outre ses fonctions transcriptionnelles, le facteur NF-kB RelA agit comme une ancre chromatinienne pour le facteur d’épissage DDX17 et fournit une spécificité de régulation d’épissage alternatif. Ces données revisitent nos connaissances des mécanismes physiopathologiques des maladies associées à HTLV-1 ainsi que d'autres désordres reliés à l’activation chronique de la voie NF-kB
The NF-kB (nuclear factor kB) signaling pathway regulates gene transcription of genes involved in immune response and inflammation. Chronic activation of NF-kB frequently associated with inflammatory disorders and cancer. The functional impacts of NF-kB have long been studied at the promoter level. Nevertheless, recent studies of the chromatin distribution of RelA indicate that this NF-kB subunit is predominantly localized in intragenic regions, including exons and introns, where its functions remain unknown. My work has addressed this question in the context of HTLV-1 infection, which is a constitutive activator of NF-kB, and the causative agent of the Adult T-cell Leukemia. The results show that the activation of NF-kB by the viral oncoprotein Tax results in changes in alternative splicing regulations of GC-rich exons that coincide with the chromatin recruitment of RelA in the vicinity of these exons. Integrative analysis of RNA splicing and chromatin occupancy, combined with experimental chromatin tethering assays (TALE) demonstrate that the intragenic binding of RelA leads to the recruitment of the splicing regulator DDX17, which modulates the inclusion rate of exon thanks to its helicase activity. Altogether, these data reveal that, besides its transcriptional role, NF-kB RelA acts as a chromatin anchor for the splicing factor DDX17 and provides alternative splicing specificity. These data revisit our knowledge of the physiopathologic mechanisms of HTLV-1 associated diseases , as well as other disorders related to the chronic activation of the NF-kB pathway
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