Pozadina istraživanja. Primjena biljaka i njihovih ekstrakata u liječenju kroničnih bolesti nadaleko je poznata u tradicionalnoj medicini. Svrha je ovoga rada bila utvrditi utjecaj desetodnevne ...konzumacije ekstrakta cvijeta trnine na koncentraciju glukoze u krvi, glikemijsko opterećenje, aktivnost α-amilaze i koncentraciju inzulina u serumu normoglikemijskih i hiperglikemijskih (induciranih aloksanom) miševa.
Eksperimentalni pristup. Normoglikemijski i hiperglikemijski (inducirani s 150 mg aloksana po kg tjelesne mase) C57BL/6 miševi tretirani su tijekom 10 dana ekstraktom cvijeta trnine. Koncentracija šećera u ekstraktu određena je HPLC analizom, a koncentracija glukoze u krvi i oralna podnošljivost glukoze (oralni glukoza tolerans test) ispitane su glukometrom. Koncentracija inzulina u serumu određena je ELISA testom, a aktivnost α-amilaze kolorimetrijskom metodom.
Rezultati i zaključci. Ekstrakt cvijeta trnine povećao je koncentraciju glukoze u krvi u normoglikemijskom mišu za 30 % nakon prvog i petog dana, te za 17 % nakon desetog dana konzumacije. To je bila posljedica prisustva slobodnih šećera, što je potvrđeno analizom njihovog sastava, kojom je utvrđeno da ekstrakt sadržava 59,8 mg/L monosaharida, uglavnom fruktoze (55,7 mg/L) i glukoze (24,3 mg/L). Suprotno tome, tretman ekstraktom cvijeta trnine je nakon 10 dana smanjio koncentraciju glukoze u krvi hiperglikemijskog miša za 29 %. Oralni glukoza tolerans test potvrdio je da se u hiperglikemijskoj skupini tretiranoj ekstraktom poboljšala podnošljivost glukoze te da je brže uspostavljena njezina homeostaza. Koncentracija inzulina u serumu povećala se za 49 %, a aktivnost α-amilaze za 46 % nakon desetodnevnog tretmana hiperglikemijske skupine ekstraktom cvijeta trnine. Može se zaključiti da ekstrakt cvijeta trnine poboljšava podnošljivost glukoze, potiče lučenje inzulina te smanjuje aktivnost serumske α-amilaze.
Novina i znanstveni doprinos. Dobiveni rezultati prvi put pokazuju mogućnost primjene ekstrakta cvijeta trnine u regulaciji hiperglikemije.
Proizveden je mutant AmySΔR179-G180 delecijom arginina (Arg179) i glicina (Gly180) u α-amilazi iz bakterije Bacillus stearothermophilus (AmyS) pomoću ciljane mutageneze, a radi poboljšanja njezinih ...svojstava. Amilaze AmyS i AmySΔR179-G180 eksprimirane su u bakteriji Bacillus subtilis i pročišćene taloženjem pomoću amonijeva sulfata, te su im opisana i uspoređena svojstva. Delecijom aminokiselina Arg179 i Gly180 poboljšala se termostabilnost α-amilaze AmySΔR179-G180, a vrijeme poluraspada pri 100 °C bitno se produljilo s 24 na 33 min. Osim toga, ova je amilaza otpornija na djelovanje kiselina i treba manje kalcija za održavanje aktivnosti. Sekrecijska svojstva rekombinantnog soja ispitana su šaržnom fermentacijom u fermentoru od 7,5 L, te je dobivena velika aktivnost α-amilaze. Postignuta je najveća aktivnost od 3300 U/mL i produktivnost od 45,8 U/(mL•h).
Haloarchaea je razred bakterija koje su u velikoj mjeri prisutne u slanom okolišu, pa proizvode enzime što mogu katalizirati reakciju u nepovoljnim uvjetima, kakvi prate mnoge industrijske procese. U ...ovom su radu optimirani uvjeti za proizvodnju izvanstanične amilaze s pomoću bakterija iz razreda Haloarchaea, izoliranih iz solane, te je proizvedeni enzim pročišćen i karakteriziran. Bakterija Haloferax sp. HA10 proizvela je najviše amilaze pri sljedećim uvjetima: 3 M NaCl, 37 °C, pH=7 i 1 % škroba. Pročišćena amilaza imala je približnu molekularnu masu od 66 kDa te industrijski korisna svojstva, a njezina je aktivnost ovisila o prisutnosti iona kalcija. Enzim je bio stabilan pri širokom rasponu pH-vrijednosti (od 5 do 9) i koncentraciji soli (od 0,5 do 3,0 M), te je zadržao 48 % aktivnosti čak i pri 4,0 M soli. Optimalna je temperatura za aktivnost amilaze izolirane iz bakterije Haloferax sp. HA10 bila 55 °C (99 % aktivnosti). Pri 80 °C enzim je zadržao 57 % aktivnosti, a povećanjem temperature na 90 ili 100 °C aktivnost je pala na 44 %. Aktivnost amilaze nije se smanjila u prisutnosti različitih surfaktanata i detergenata. Koliko je nama poznato, u literaturi ne postoje podaci o α-amilazi izoliranoj iz halofilnih bakterija domene arheja, stabilnoj u prisutnosti detergenata.
U radu je pročišćena i okarakterizirana α-amilaza, izolirana iz novootkrivenog soja bakterije Anoxybacillus sp. AH1, stabilna pri visokim temperaturama u prisutnosti detergenata. Najveća količina ...enzima (1874,8 U/mL) proizvedena je nakon 24 sata inkubacije. Nakon pročišćavanja amilaze gel-filtracijskom kromatografijom u koloni punjenoj gelom Sephadex G-75, specifična se aktivnost enzima povećala 18 puta, a prinos je bio 9 %. Metodom SDS-PAGE određena je molekularna masa pročišćenog enzima od 85 kDa. Optimalna je pH-vrijednost bila 7,0; a optimalna temperatura 60 °C. Enzim je bio izuzetno stabilan u prisutnosti 30 %-tnog glicerola, te je zadržao 85 % aktivnosti na 60 °C tijekom 120 min. Pomoću Lineweaver-Burkovog dijagrama utvrđeno je da je vrijednost Km amilaze bila 0,102 μmol, a vmax 0,929 μmol/min. Aktivnost se enzima povećala u prisutnosti različitih detergenata, dok se u prisutnosti uree znatno smanjila. Ioni magnezija i kalcija bitno su povećali, a ioni cinka i bakra, te kelatori metalnih iona EDTA i 1,10-fenantrolin smanjili aktivnost α-amilaze. Aktivnost se α-amilaze znatno povećala i u prisutnosti β-merkaptoetanola i ditiotreitola, no smanjila dodatkom p-kloromerkuribenzojeve kiseline. Jodoacetamid i N-etilmaleimid imali su blag, a fenilmetilsulfonil fluorid jak inhibicijski učinak na aktivnost amilaze.
Učinkovitost fermentacijske proizvodnje enzima ponajprije ovisi o optimalnoj opskrbi mikroorganizma kisikom, tj. dobrom prijenosu kisika. Protok zraka i miješanje su neki od čimbenika koji utječu na ...opskrbu reaktora kisikom. S pomoću Bacillus amyloliquefaciens proizvedena je α-amilaza u reaktoru zapremnine 600 mL, radnog volumena od 300 mL, i u reaktoru od 5 L, s radnim volumenom od 3 L. Utvrđeno je da je često prozračivanje reaktora povećalo prinos enzima. Prinos biomase i produktivnost enzima bili su u linearnom odnosu s protokom zraka, a najveća je produktivnost bila pri 1 vvm. Maksimalna je produktivnost od 41,4 U/(mL·h) postignuta nakon 14 h u fermentoru od 600 mL, dok je u onom od 5 L najveća produktivnost bila 40 U/(mL·h) nakon 12 sati fermentacije.
U radu je ispitana proizvodnja ekstracelularne amilaze fermentacijom na čvrstoj podlozi s pomoću Bacillus subtilis. Optimirani su različiti parametri za maksimalnu proizvodnju amilaze. Ispitani su ...razni čvrsti supstrati, kao što su kora banane, lubenice i dinje; mekinje leće i pšenice te kukuruzna uljna pogača; zatim vrijeme inkubacije (24-144 h), veličina čestica (500-2500 μm), početna vlažnost supstrata (40-70 %, V/m) i veličina inokuluma (10-60 %, V/m). Maksimalna proizvodnja amilaze (4857 U/mg) postignuta je dodatkom škroba (masenog udjela 1 %, veličine čestica 1500 μm) podlozi od kore banane, fermentirane tijekom 72 h na 37 °C, pri veličini inokuluma od 30 % te početnoj vlažnosti od 60 % .
Komušina, slama od raži, slama od pšenice i pšenične posije upotrijebljeni su kao supstrat za fermentaciju na čvrstoj podlozi pri proizvodnji α-amilaze iz Penicillium chrysogenum. Ispitan je utjecaj ...vlage, veličine čestica i koncentracije inokuluma na sintezu enzima iz Penicillium chrysogenum. Optimalna količina vlage u supstratima bila je 75 % za komušinu, 65 % za slamu od pšenice i pšenične posije, te 55 % za slamu od raži. Veličina čestica i koncentracija inokuluma bili su >1 mm odnosno 20 % za komušinu i slamu od pšenice, 1 mm odnosno 20 % za pšenične posije, te >1 mm odnosno 30 % za slamu od raži. Najveća proizvodnja enzima od 160 U/mL postignuta je upotrebom pšeničnih posija u optimalnim uvjetima. Uporabom komušine aktivnost enzima bila je 28, slame od raži 49, a slame od pšenice 45 U/mL.
Istražen je utjecaj različitih izvora dušika i dodataka podlozi na proizvodnju α-amilaze (EC 3.2.1.1) s pomoću plijesni Aspergillus oryzae ATCC 1011 u pokusu na tresilici i šaržnim uzgojem. ...Primijenjeni su anorganski i organski dušikovi spojevi, a kao glavni izvori ugljika i dušika korišteni su kukuruzni škrob i amonijev sulfat. Pokusima na tresilici dokazano je da je utjecaj koncentrata dušika iz krumpira (potato nitrogen concentrate – PNC) na proizvodnju amilaze skoro jednak onom ekstrakta kukuruza (corn steep liquor – CSL). Pročišćavanjem zamućenog materijala prije obrade nije se postigao značajan učinak. Zamjenom anorganskog izvora dušika natrijevim nitratom dobiveni su manji prinosi enzima. Dodatkom drugih kompleksnih spojeva, kao što je hidrolizat kazeina, smanjio se prinos enzima, a dodatkom ekstrakta kvasca ili slada neznatno se povećao titar amilaze. Veći rast stanica i bolji prinos α-amilaze postignut je uzgojem na podlozi obogaćenoj s PNC u reaktoru na postolju nego bez tih dodataka. Zamjenom PNC sa CSL postignuto je povećanje prinosa enzima za 9-17 % nakon 100 sati uzgoja. Upotreba PNC kao jedinog izvora dušika, uz zamjenu sojine kaše, ekstrakta kvasca i slada te hidrolizata kazeina laktozom kao izvorom ugljika, dovela je do neznatnih razlika u kinetici rasta i formiranju enzima u bioreaktoru. Međutim, uočene su metaboličke razlike u zasićenosti otopljenim kisikom (dissolved oxygen tension – DOT), koncentraciji α-amino dušika i količini kiseline potrebne za održavanje konstantnog pH.
PDF