U ovom radu prikazana je mogućnost primjene konceptnih mapa
kao dijagnostičkog sredstva u procjeni učeničkog znanja. Autori uvode nove termine: „idealna struktura znanja”, „poželjna struktura znanja” ...i „realna struktura znanja” kao pokazatelje nivoa usvojenosti znanja. Uloga konceptnih mapa kao dijagnostičkog sredstva testirana je u oblasti gimnazijske nastave biokemije. U pedagoškom eksperimentu sudjelovali su gimnazijalci iz Novog Sada (Srbija). Ispitivano je njihovo poznavanje nastavnih sadržaja iz dvije nastavne
teme (nukleinske kiseline i biosinteza proteina). Kreirane su konceptne mape realne strukture znanja za svakog učenika nakon fi nalnog testa i testa retencije znanja. Usporedbom mapa poželjne i realnih struktura znanja ustanovljene su moguće primjene konceptnih mapa: u određivanju nivoa usvojenosti znanja; u ocjeni uloženog truda i sposobnosti učenika da usvoji biokemijske
sadržaje; kao indikatora nivoa retencije znanja; kao mjere efi kasnosti primijenjene nastavne metode. Radom s konceptnim mapama nastavnici mogu ocijeniti svoje rezultate i steći uvid u vlastiti rad.
Bolesnici zaraženi HIV-om skloni su ranoj pojavi ateroskleroze zbog upale uzrokovane samim virusom, kao i
zbog nuspojava antiretrovirusnog liječenja. Antiaterogeno djelovanje ekstra djevičanskog ...maslinovog ulja
(EVOO) moglo bi umanjiti rizik od kardiovaskularnih bolesti u osoba zaraženih HIV-om. 39 HIV-om zaraženih
muških ispitanika uključeno je u križni klinički pokus. Ispitanici su konzumirali EVOO i rafinirano maslinovo
ulje (ROO) - placebo. Više od 50% ispitanika imalo je izražene čimbenike za aterosklerozu, a više od 90%
ispitanika imalo je povećanu koncentraciju malondialdehida i povećanu katalitičku koncentraciju superoksid
dismutaze. Udio rizičnih čimbenika znatno je veći u ispitanika koji se liječe inhibitorima proteaze ili
abakavirom. Konzumacija ROO smanjila je koncentraciju malondialdehida za 18% u svih ispitanika, dok je
konzumacija EVOO smanjila koncentracije hsCRP za 151% i brzinu sedimentacije eritrocita za 62% u ispitanika
liječenih inhibitorima proteaze. Koncentracije hsCRP-a značajno su smanjene nakon konzumacije EVOO samo u
ispitanika čija je suradljivost bila veća od 90%. Konzumacija maslinovih ulja nije smanjila rizik za koronarnu
bolest srca i metabolički sindrom. Rizične čimbenike za kardiovaskularne bolesti potrebno je definirati i pratiti
tijekom antiretrovirusnog liječenja. Učinkovitost EVOO trebalo bi potvrditi na većem broju ispitanika.
Premature atherosclerosis in HIV infected patients is associated with chronic infection by itself and side effects
of antiretroviral therapy. Beneficial effect of extra virgin olive oil (EVOO) could decrease the risk for
cardiovascular disease in HIV-infected patients. 39 HIV positive male participants were included in randomized
crossover controlled trial. They consumed EVOO and refined olive oil (ROO) - placebo. The atherosclerosis risk
factors were affected in more than 50% of participants receiving antiretroviral therapy. In more than 90% of
participants malondialdehyde concentrations and superoxide dismutase cathalitic concentrations were increased.
Risk factors were more affected in participants using protease inhibitors and abacavir containing antiretroviral
therapy. After ROO administration, MDA concentration was 18% higher when compared to basic values. After
EVOO administration, in participants using protease inhibitors containing antiretroviral therapy, erythrocyte
sedimentation rate and hsCRP concentrations were 62% and 151% lower when compared to basic values,
respectively. hsCRP concentrations showed a significant decrease after EVOO administration only in
participants with >90% compliance. Olive oil consumption did not affect the risk for coronary heart disease and
the metabolic syndrome diagnosis. Cardiovascular disease risk factors should be recognized and followed in all
HIV patients receiving antiretroviral therapy. EVOO effects should be confirmed on a larger sample size.
Cilj istraživanja: Prvenstveni cilj ovoga rada bila je uspostava modela za praćenje putovanja MHC molekula I. razreda, ali i ostalih površinskih molekula, u neinficiranim stanicama i u stanicama ...inficiranim MCMV divljim-tipom ili različitim mutantama virusa MCMV kojima nedostaje/ju geni čija je funkcija u literaturi opiasana. Poznato je da se MHC-I molekule puno brže uklanjaju sa površine inficirane stanice nego sa površine neinficirane stanice, upravo je stoga mjerena kinetika uklanjanja površinskih MHC-I molekula. Također su istražena načela ulaska MHC-I molekula u put recikliranja te njihov ulazak u degradacijski put, odnosno u kasne endosome.
Materijal i metode: U pokusima smo koristili staničnu liniju mišjih embrionalnih fibroblasta (MEF-a). U istraživanjima smo koristili neinficirane i inficirane stanice te određivali možebitne razlike. Slijedeće rekombinante virusa MCMV su korištene: Δm138-MCMV (ΔMC95.15) s delecijom fcr1 (m138) gena , Δie1-MCMV s delecijom egzona 4 ie1 gena, Δie2-MCMV s delecijom ie2 (m128) gena, Δie3-MCMV s delecijom ie3 gena, Δm4m6m152-MCMV s delecijom tri poznata imunoinvaziva koji utječu na sazrijevanje MHC-I molekula te MCMV divlji-tip, koji je kao i gotovo sve MCMV-delecijske mutante proizvedene i umnažan na kulturi MEF porijeklom iz BALB/c miševa. Δie3-MCMV uzgajan je na komplementarnoj NIH3T3 BAM25 staničnoj liniji. U svrhu praćenja MHC-I molekula koristili smo monoklonska protutijela (mPt): MA-215 za konformirane Kd i 34-5-8S za konformirane Dd. Transferinski receptor (TfR) smo pratili pomoću mPt R17, a molekule GM1 pomoću obilježene podjedinice B kolera toksina. Kako bismo utvrdili koji su putovi uključeni u ulazak molekula u stanicu, endosomalno putovanje, recikliranje i degradaciju, koristili smo različite kemijske inhibitore. Kinetiku internalizacije pratili smo protočnom citometrijom, a unutarstanično putovanje konfokalnom mikroskopijom koristeći princip površinskog vezivanja odgovarajućeg mPt i njegovog praćenja nakon određene kinetike internalizacije. Internalizirane molekule kolokalizirali smo međusobno, te s određenim endosomalnim markerima. Recikliranje molekula pratili smo pomoću dva različita protokola metodom protočne citometrije i konfokalne mikroskopije. U cilju identifikacije sudbine površinskih proteina, koristili smo metode površinske biotinilacije, imunoprecipitacije, elektroforeze na poliakrilamidnim gelovima (SDS-PAGE), Western-blota i kemiluminiscencije.
Rezultati: Obrazac izražaja MHC-I molekula kako na površini tako i u unutrašnjosti stanice mijenja se u uvjetima MCMV-infekcije. MHC-I molekule nishodno se reguliraju s površine inficirane stanice procesom koji nije isključivo za njih specifičan, potom se nakupljaju u hibridnom odjeljku koji je pozitivan na mnogobrojne biljege unutarstaničnih endosomalnih putova ili odjeljaka (EEA-1+, TfR, GM130). MHC-I molekule internaliziraju se brže u inficiranim nego u neinficiranim stanicama putem koji je neovisan o dinaminu. Niti jedan od ispitivanih kemijskih inhibitora endocitoze (klorpromazin, imipramin, filipin i AlF4-) nije značajnije blokirao internalizaciju MHC-I molekula. Nishodna regulacija MHC-I molekula s površine inficirane stanice je proces 5-6 puta brži od konstitutivne internalizacije te je najvjerojatnije induciran virusnim proteinima. MCMV usmjerava MHC-I molekule nakon internalizacije sa površine stanice, u odjeljak u kojem ih i nakuplja. Internalizirane MHC-I molekule nalaze se u mjehurićima koji ne mogu otpustiti EEA-1 odnosno rane endosomalne membrane, što bi bio jedan od razloga njihovog odgođenog ulaska u endolizosomalni put u proces degradacije. Iz odjeljka koji se formira u MCMV-inficiranim stanicama u kojem se nakupljaju mnogobrojne internalizirane molekule moguće je recikliranje, ali je kapacitet recikliranja smanjen. Retencijski odjeljak sadrži većinom membrane ranih endosoma s obzirom da samo mali dio molekula može reciklirati pri 16 °C i uz prisustvo LY294002, što su karakteristike jukstanuklearnog reciklirajućeg odjeljka. Najvjerojatniji uzrok promjene recikliranja u MCMV-inficiranim stanicama je smanjenje ukupne količine Rab11 molekule te smanjenje mogućnosti stvaranja reciklirajućh membranskih domena. Ulazak u put degradacije za mnoge je molekule odgođen u MCMV-inficiranim stanicama neovisno o njihovu putu ulaska u stanicu te je otežano formiranje endolizosomalnih mebrana. U MCMV-inficiranim stanicama dolazi do promjena u izražavanju pojedinih molekula Rab. Razina Rab5 u inficiranim stanicama ne smanjuje se poput ostalih molekula Rab, te dolazi do otežane pretvorbe Rab5 u Rab7, kao i do smanjenja razine Rab7 u inficiranim stanicama, što za posljedicu ima odgođeno odvođenje molekula u put degradacije. Za nishodnu regulaciju MHC-I molekula s površine inficirane stanice odgovoran je ili ie3 gen ili oni geni koji su pod kontrolom ie3 gena. m06/gp48 protein odgovoran je za usmjeravanje kako novo-sintetiziranih tako i internaliziranih MHC-I molekula u proces degradacije.
Zaključak: Endosomalno remodeliranje je mehanizam evoluirao u svrhu MCMV morfogeneze u inficiranih stanica, jer ne utječe samo na MHC-I molekule, nego i na druge endocitirane molekule koje koriste različite endosomalne putove. Ovo remodeliranje se nadopunjuje blokiranjem izlaza MHC-I molekula iz sekretnog puta što dovodi do ubrzanog gubitka MHC-I molekula s površine stanice u ranim razdobljima infekcije.
Objectives: The aim of this study was to establish experimental model that will enable us to follow constitutive internalization of MHC class I. molecules and other cell surface expressed molecules in uninfected or in the cell infected with either MCMV wild-type or with different MCMV deletion mutant. It is well known that MHC-I molecules are downregulated with higher rate from infected cell than from uninfected cell, so we measured the kinetics of MHC-I molecules downregulation. Additionally, we investigated the principles of MHC-I molecules endocytosis, their recycling pathway and also MHC-I molecules entrance in degradation pathway respectively, in late endosomes.
Material and methods: Experiments were performed on murine embrional fibroblasts (MEFs). In our experiment we used uninfected and cell infected with numerous MCMV: Δm138-MCMV (ΔMC95.15) with the deletion of the fcr1 (m138) gene, Δie1-MCMV with the deletion of exon 4 ie1 gene, Δie2-MCMV with the deletion of the ie2 (m128) gene, Δie3-MCMV with the deletion of the ie3 gene, Δm4m6m152-MCMV with deletion of three well known immunoevasins that affect MHC-I molecules maturation. The MCMV wild-type and MCMV deletion mutants were propagated on BALB/c MEFs. The Δie3-MCMV was grown on the complementing cell line NIH3T3 BAM25. In order to follow MHC-I molecules, we have used a monoclonal antibodies (mAbs): MA-215 for conformed Kd molecules and 34-5-8S for conformed Dd molecules. Transferrin receptor (TfR) was followed by mAb R17, and GM1 molecules with labeled cholera toxin B subunits. In order to determine which pathways are involved in endocytosis, endosomal trafficking, recycling and degradation of these molecules, we used different chemical inhibitors of endocytosis. The kinetics of surface molecules was followed by flow citometry and their intracellular trafficking by confocal microscopy after binding of appropriate mAbs. Internalized molecules were colocalized with each other as well as with specific endosomal markers. After rearranging two different protocols from the literature we followed molecules recycling by flow citometry and confocal microscopy. In order to monitor the kinetics of degradation, we used the method of surface biotinilation and imunoprecipitation, electrophoresis on polyacrylamide gels (SDS-PAGE), Western-blot and chemiluminiscence.
Results: The pattern of MHC-I molecules expression on the cell surface and intracellular was changing during the infection. MHC-I molecules were downregulated from the surface of infected cell with process that is not specific for them since the other cell surface expressed molecules have also been downregulated. After their downregulation MHC-I molecules were accumulated in hybrid compartment which is positive on various markers of endosomal pathways and compartments (EEA-1+, TfR, GM130). Kinetics of MHC-I molecules internalization were significantly faster in infected cells than in uninfected cells following the pathway that is dynamin independent. Neither of the tested chemical inhibitors (chlorpromazine, imipramin, filipin and AlF4-) did not block internalization of MHC-I molecules. Downregulation of cell surface expressed MHC-I molecules is process that is 5-6 times faster than constitutive internalization and it is probably induced with viral proteins. MCMV directs after internalization from the cell surface MHC-I molecules in the retention compartment. Internalized MHC-I+ vesicles are unable to release EEA-1 respectively early endosomal membrane what could clarify their delayed entry into endolysosomal route in the process of degradation. In MCMV-infected cells many of the internalized molecules have been accumulated in the retention compartment from which recycling was possible although the capacity of the recycling was reduced. Retention compartment contains most of the membrane of early endosomes since only small amount of the molecules was capable to recycle on 16 °C even in the presence of LY294002, which are the characteristics juxtanuclear recycling compartment. The most likely cause of changes in the recycling of MCMV-infected cells was reduction of the total amount of Rab11 molecules that decreased the possibility of creating recycling membrane domains. Degradation pathway has been affected in MCMV-infected cells for numerous molecules regardless to their pathway of entry into the cell. Besides the amount of the Rab11 molecules in MCV-infected cells the level of other Rab molecules was altered. The level of Rab5 in infected cells didn’t decrease like other Rab molecules, leading to the difficult conv
Galektin-3, lektin koji specifično prepoznaje -galaktozidne strukture, djeluje kao jak
proinflamatorni signal koji modulira staničnu proliferaciju i adheziju, kemotaksiju,
fagocitozu te sintezu ...upalnih medijatora. Mnoge tvari s imunomodulatornim djelovanjem
djeluju na signalne puteve u kojima sudjeluju i transkripcijski faktori čija su vezna mjesta
prisutna u promotorskoj regiji gena za galektin-3 (LGALS3). Zbog česte uporabe ovih tvari u
terapijske svrhe te važnosti galektina-3 u fiziologiji stanica monocitno-makrofagne loze, u
ovom je radu ispitan utjecaj nesteroidnih (aspirina i indometacina) i steroidnih
(hidrokortizona i deksametazona) tvari s imunomodulatornim djelovanjem primijenjenih u
različitim terapijskim rasponima na ekspresiju LGALS3 i galektina-3 u nediferenciranim i
diferenciranim stanicama monocitne stanične linije THP-1 tijekom 72-satnog kultiviranja.
Niti jedna od ispitanih tvari u primijenjenim koncentracijama tijekom 72 sata kultiviranja
nije citotoksično djelovala na stanice. Količina mRNA za galektin-3 određena je primjenom
metode RT-PCR praćene analizom na uređaju AbiPrism 310 Genetic Analyser, a količina
galektina-3 u staničnim homogenatima Western-imunoblot metodom. Rezultati su pokazali
da ispitivane tvari mijenjaju ekspresiju LGALS3 i galektina-3 te da njihovi učinci ovise o
diferenciranosti stanica, koncentraciji primijenjene tvari kao i vremenu izlaganja. U
nediferenciranim stanicama sve ispitane tvari svih primijenjenih koncentracija inhibiraju
ekspresiju i LGALS3 i galektina-3, a inhibitorni je učinak u korelaciji s vremenom izlaganja.
Tijekom 48-satne preobrazbe nediferenciranih stanica u diferencirane, dolazi do snažne
indukcije ekspresije i LGALS3 (3 puta) i galektina-3 (3,5 puta). U diferenciranim stanicama
sve ispitivane tvari u početku inhibiraju ekspresiju LGALS3 nakon čega dolazi do uspostave
konstitutivne razine mRNA, dok na proteinskoj razini dugotrajnije izlaganje ispitivanim
tvarima potiče ekspresiju galektina-3. U oba slučaja, intenzitet promjena kao i njihov
vremenski slijed ovise o vrsti i koncentraciji primijenjene tvari. Na temelju dobivenih
rezultata moguće je zaključiti da primijenjene tvari s imunomodulatornim djelovanjem
utječu na različite signalne puteve kao i mehanizme regulacije ekspresije galektina-3 na
genskoj i proteinskoj razini, a da promjene ovise o vrsti i koncentraciji tvari te vremenu
izloženosti, kao i o diferencijacijskom stupnju stanica. Dobiveni rezultati predstavljaju važan
korak u razumijevanju djelovanja tvari s imunomodulatornim djelovanjem na galektin-3 u
stanicama monocitno-makrofagne loze, a time i na njihove brojne fiziološke funkcije.
Galectin-3, a β-galactoside binding lectin, acts as a strong pro-inflammatory signal that
modulates cell proliferation and adhesion, chemotaxis, phagocytosis and synthesis of
inflammatory mediators. Many immunomodulatory drugs affect signaling pathways that
comprise transcriptional factors which binding sites are present in the promoter region of
galectin-3 gene (LGALS3). Because of the frequent therapeutic application of
immunomodulatory drugs and the importance of galectin-3 in the physiology of monocytes
and macrophages, we investigated effects of non-steroidal (aspirin and indomethacin) and
steroidal (hydrocortisone and dexamethasone) immunomodulatory drugs, applied in
different therapeutic ranges, on the expression of LGALS3 and galectin-3 in nondifferentiated
and differentiated cells of monocytic THP-1 cell-line during 72 hours of
cultivation. None of the studied drugs in applied concentrations during 72 hours of
cultivation had cytotoxic effect on the cells.
The targeted mRNA level was evaluated using relative RT-PCR technique and analysis on
the AbiPrism 310 Genetic Analyser. Galectin-3 expression in cell homogenates was
determined by western-immunoblot analysis. The results showed that the chosen
immunomodulatory drugs affect LGALS3 and galectin-3 expression and that their effects
depend on cell differentiation level, concentration of the applied drug, as well as time of
exposure. In undifferentiated cells all of the studied drugs (in all applied concentrations)
inhibit expression of LGALS3 and galectin-3, and inhibitory effect correlates with time of
exposure. Differentiation of monocytic THP-1 cells into macrophages during 48-hours
strongly induces expression of LGALS3 (3 times) and galectin-3 (3,5 times). In differentiated
cells, all studied drugs inhibited LGALS3 expression at the beginning, but during further
incubation constitutive level of galectin-3 mRNA was reestablished. On the protein level,
prolonged exposure to all applied drugs induce galectin-3 expression. Intensity and timecourse
of both, mRNA and protein level changes depend on drug type and on applied
concentration. These findings indicate that the applied immunomodulatory drugs affect
different signaling pathways and mechanisms of regulation of galectin-3, on both mRNA
and protein level. The changes depend on drug type and concentration, time of exposure as
well as cell differentiation level. The results obtained in this study represent important step
in the understanding of the effects of immunomodulatory drugs on galectin-3 in
monocytes/macrophages, hence on their numerous physiological roles.
Istraživanje je obavljeno na uzorcima krvi 23 zdrava vepra određena za rasplod. Veprovi su bili dobrog općeg stanja, u dobi od 3 do 5 godina, teški između 100-150 kg. Ukupni broj eritrocita, ...koncentracija hemoglobina, hematokrit i prosječni volumen eritrocita (MCV) bili su nešto viši od fizioloških vrijednosti ustanovljenih za domaću svinju, a ukupni broj leukocita bio je nešto niži od fizioloških vrijednosti s većim udjelom segmentiranih granulocita. Srednje vrijednosti aktivnosti alanin aminotransferase i kreatin kinaze bile su više, a aspartat aminotransferaze, alkalne fosfataze, ukupnih serumskih bjelančevina, albumina, dušika ureje (BUN) i kreatinina bile su unutar fizioloških vrijednosti utvrđenih za domaću svinju. Vrijednosti glukoze u serumu bile su znatno više od vrijednosti za domaću svinju.
Cilj istraživanja: Prvenstveni cilj ovoga rada bila je karakterizacija konstitutivne internalizacije konformiranih i nekonformiranih MHC molekula I razreda, odnosno karakterizacija njihove ...endocitoze, recikliranja i degradacije. Poznato je da razlika u konformaciji MHC-I molekula uzrokuje njihovo razdvajanje u sekretornom putu. Stoga su u ovom radu istražena načela njihova razdvajanja tijekom endocitoze i putovanja kroz endosomalne odjeljke. Na temelju eksperimentalnih mjerenja cilj nam je bio i uspostavljanje matematičkog modela za kinetičku analizu endosomalnih putova.
Materijal i metode: Istraživanja smo proveli na mišjim fibroblastima J26 transficiranim s genom koji kodira molekule HLA-B7 (J26-B7), HLA-Cw6 (J26-Cw6) ili HLA-G1 (J26-G1), na humanoj tumorskoj staničnoj liniji HeLa koja konstitutivno izražava sve klasične HLA molekule I razreda, Balb 3T3 mišjim fibroblastima, te L-Ld stanicama (mišji fibroblasti transficirani genom za molekule H2-Ld). Za praćenje MHC molekula I razreda koristili smo monoklonska protutijela (mPt): mPt W6/32, koje prepoznaje sve klasične konformirane HLA molekule i konformirane HLA-G1 molekule, mPt HC-10, koje prepoznaje sve klasične nekonformirane HLA molekule, mPt MEM-G/1 koje prepoznaje nekonformirane molekule HLA-G1, mPt 30-5-7 koje prepoznaje konformirane H2-Ld molekule, te mPt 64-3-7 koje prepoznaje nekonformirane H2-Ld molekule. Transferinski receptor (TfR) smo pratili pomoću mPt R17, a molekule GM1 pomoću obilježene podjedinice B kolera toksina. Neionski detergent Triton X-100 nam je poslužio za ispitivanje nazočnosti molekula u lipidnim splavima. Oponašanjem uvjeta endosomalnog pH izvan stanice, utvrdili smo promjenu konformacije MHC molekula I razreda u zadanim uvjetima. Kako bismo utvrdili koji putovi su uključeni u endocitozu, endosomalno putovanje, recikliranje i degradaciju ovih molekula, koristili smo različite kemijske inhibitore. Kinetiku internalizacije pratili smo protočnom citometrijom, a unutarstanično putovanje konfokalnom mikroskopijom koristeći princip površinskog vezivanja odgovarajućeg monoklonskog protutijela i njegovog praćenja nakon određene kinetike internalizacije. Internalizirane molekule kolokalizirali smo međusobno, te s određenim endosomalnim markerima. Recikliranje molekula pratili smo modificirajući tri različita protokola iz literature i to protočnom citometrijom i konfokalnom mikroskopijom. U cilju praćenja kinetike degradacije koristili smo metodu površinske biotinilacije, te imunoprecipitacije, elektroforeze na poliakrilamidnim gelovima (SDS-PAGE), Western-blota i kemiluminiscencije. Za matematičko modeliranje i simulacije endocitoznih procesa koristili smo programski paket Mathematica (Wolfram Research Europe Ltd.). Rezultati: Konformirane MHC-I molekule dobro su izražene na staničnoj površini za razliku od nekonformiranih molekula. Djelovanjem kiselog pH (fiziološke i nefiziološke vrijednosti) izražaj konformiranih MHC-I molekula pada, dok izražaj nekonformiranih raste. Različite konformacije MHC-I molekula u ustaljenom stanju samo djelomično se kolokaliziraju unutar stanice i to prvenstveno u ranim endosomalnim odjeljcima. Niti jedan od ispitivanih kemijskih inhibitora (klorpromazin, Dynasore, filipin i AlF4-) nije blokirao internalizaciju MHC-I molekula. Nekonformirane MHC-I molekule se znatno brže internaliziraju i degradiraju od konformiranih MHC-I molekula što je najvjerojatnije posljedica činjenice da se konformirane MHC-I molekule usmjeravaju u reciklirajuće odjeljke, a nekonformirane MHC-I molekule u degradacijski put. Tome u prilog govori rezultat da se konformirane MHC-I molekule nakon internalizacije nalaze prvenstveno u jukstanuklearnom području zajedno s Tf/TfR i Rab11 GTPazom, dobro poznatim biljezima jukstanuklearnih reciklirajućih endosoma. Internalizirane konformirane MHC-I recikliraju s učinkovitošću od oko 30%, znatno manje od TfR/Tf koji recikliraju s učinkovitošću od 85-99%, što ukazuje da konformirane MHC-I molekule ulaze u zasebne reciklirajuće odjeljke. Ubrzo nakon internalizacije konformirane i nekonformirane MHC-I se kolokaliziraju s biljegom ranih endosoma (EEA-1), kao i međusobno, ali nedugo zatim stupanj kolokalizacije se smanjuje što znači da se razmjerno brzo razdvajaju. To razdvajanje blokira LY294002 (blokator PI3K), kao i konkanamicin A (blokator endosomalne H+ crpke). Djelovanjem Tx-ispiru se konformirane MHC-I molekula i TfR sa staničnih membrana, dok se nekonformirane MHC-I molekule i GM1 ne ispiru. Matematičkim modeliranjem potvrđeni su eksperimentalni rezultati, te izračunati slijedeći parametri: stopa endocitoze, stopa recikliranja i stopa degradacije.
Zaključak: Konformirane MHC-I molekule kao i TfR nalaze se u detergent-osjetljivim membranskim mikrodomenama za razliku od nekonformiranih MHC-I molekula i GM1, kako na staničnoj površini tako i u unutrašnjosti stanice. Internalizacija MHC-I molekula nije ovisna o klatrinu i dinaminu, već najvjerojatnije o funkciji malih GTPaza (Cdc42 i Arf6). Sortiranje, odnosno odvajanje endosomalnih putova konformiranih i nekonformiranih MHC-I molekula odvija se na razini ranih endosoma i ovisno je o pH. Nakon sortiranja konformirane MHC-I molekule se prvenstveno usmjeravaju u recikliranje, a nekonformirane u degradaciju.
Objectives: The aim of this study was to characterize constitutive internalization of conformed and non-conformed MHC class I molecules, with respect to their endocytosis, recycling and degradation. Conformational difference is known to segregate MHC-I molecules in secretory pathway. Therefore, we investigated endocytic pathway and putative segregation principles of these molecules during endocytic trafficking. Additionally, based on experimental measurements our goal was to establish a mathematical model for kinetics analysis of endosomal transport.
Material and methods: Experiments were performed on murine fibroblasts J26 transfected with HLA-B7 (J26-B7), HLA-Cw6 (J26-Cw6) or HLA-G1 molecules (J26-G1), on human HeLa cell line that constitutively expresses all classical HLA class I molecules, Balb 3T3 murine fibroblasts, and murine L cells stably transfected with Ld molecules (L-Ld). In order to follow MHC class I molecules, we used the following monoclonal antibodies (mAb): mAb W6/32 for all classical conformed HLA-I molecules and for conformed HLA-G1 molecules, mAb HC-10 for all classical non-conformed HLA-I molecules, mAb MEM-G/1 for non-conformed HLA-G1 molecules, mAb 30-5-7 for conformed H2-Ld molecules, and mAb 64-3-7 for non-conformed H2-Ld molecules. Transferrin receptor (TfR) was followed by mAb R17, and GM1 molecules with labeled cholera toxin B subunits. Non-ionic detergent Triton X-100 was used for testing the presence of molecules in lipid rafts. Conditions of endosomal pH were simulated outside the cell and the conformation changes of MHC-I molecules were under given conditions. In order to determine which pathways are involved in endocytosis, endosomal trafficking, recycling and degradation of these molecules, we used different chemical inhibitors. The kinetics of surface molecules was followed by flow citometry and their intracellular trafficking by confocal microscopy after binding of appropriate mAbs. Internalized molecules were colocalized with each other as well as with specific endosomal markers. After rearranging three different protocols from the literature we followed molecules recycling by flow citometry and confocal microscopy. In order to monitor the kinetics of degradation, we used the method of surface biotinilation and imunoprecipitation, electrophoresis on polyacrylamide gels (SDS-PAGE), Western-blot and chemiluminiscence. For mathematical modeling and simulation of endocytic processes we used a software package Mathematica (Wolfram Research Europe Ltd.). Results: Conformed MHC-I molecules are well expressed on the cell surface, unlike non-conformed molecules. Expression of conformed MHC-I molecules decreases due to treatment with acid pH (physiological and non- physiological values), while expression of non-conformed MHC-I molecules increases. Different conformations of MHC-I molecules in steady state conditions are only partially colocalized intracellular, primarily in the early endosomal compartments. Neither of the tested chemical inhibitors (chlorpromazine, Dynasore, filipin and AlF4-) did not block internalization of MHC-I molecules. Kinetics of internalization, as well as degradation of non-conformed MHC-I molecules are significantly faster than kinetics of conformed MHC-I molecules, due to fact that conformed MHC-I molecules recycle, unlike non-conformed molecules. These thesis are supported also by the finding that conformed MHC-I molecules after internalization are directed primarily in juxtanuclear region where they colocalize with Tf/TfR, and with Rab11. Internalized conformed MHC-I molecules recycle with 30% efficiency, while TfR/Tf recycling efficiency is 85-99%. Shortly after internalization conformed and non-conformed MHC-I molecules colocalize with early endosomal marker EEA-1, as well as to each other, but soon thereafter the level of colocalization decreases. This separation is blocked due to the influence of LY294002 (inhibitor of PI3K) or concanamycin A (inhibitor of endosomal H+ pump). Treatment with Tx-100 removes conformed MHC-I molecules and TfR from the cell membranes, while non-conformed MHC-I molecules and GM1 are resistant to the Tx-100 treatment. Experimental results are confirmed by mathematical modeling, by which the following parameters are also calculated: the rate of endocytosis, the rate of recycling and the rate of degradation.
Conclusion: Conformed MHC-I molecules, as well as transferrin receptor are localized in detergent-sensitive membrane micro domains, while non-conformed MHC-I molecules and GM1 are localized in detergent-resistant membrane micro domains, not only on the cell surface, but also intracellularly. Internalization of MHC-I molecules is clathrin- and dynamin-i
Istraživani su određeni sastojci seruma odstrjeljenog jelena lopatara (n=52). Utvrđene su prosječne vrijednosti za spol i starost životinja te razlitičo mjesto uzimanja krvi. Tijekom zime 2000./01. ...godine uzeta je krv iz lovišta na Gorenjskem i Dolenjskem. Utvrđene su prosječne vrijednosti slijedećih parametara: aspartat aminotransferaze (AST), alanin aminotransferaze (ALT), laktat dehidrogenaze (LDH), gama glutamiltransferaze (GGT), mokraćevine, kreatinina, ukupnih proteina, albumina i glukoze. Dobiveni rezultati pokazuju da postoje samo neka statistički značajna odstupanja između različitih skupina. Cilj ovog rada je pokazati niz biokemijskih podataka kod odstrjeljenog jelena lopatara u Sloveniji i uspoređivanje podataka s ostalim sličnim istraživanjima, što je od važnosti za laboratorijsku dijagnostiku.
Istraživani su određeni sastojci seruma odstrjeljenog jelena lopatara (n=52). Utvrđene su prosječne vrijednosti za spol i starost životinja te razlitičo mjesto uzimanja krvi. Tijekom zime 2000./01. ...godine uzeta je krv iz lovišta na Gorenjskem i Dolenjskem. Utvrđene su prosječne vrijednosti slijedećih parametara: aspartat aminotransferaze (AST), alanin aminotransferaze (ALT), laktat dehidrogenaze (LDH), gama glutamiltransferaze (GGT), mokraćevine, kreatinina, ukupnih proteina, albumina i glukoze. Dobiveni rezultati pokazuju da postoje samo neka statistički značajna odstupanja između različitih skupina. Cilj ovog rada je pokazati niz biokemijskih podataka kod odstrjeljenog jelena lopatara u Sloveniji i uspoređivanje podataka s ostalim sličnim istraživanjima, što je od važnosti za laboratorijsku dijagnostiku.
Some serum constituents of shot fallow deer (n = 52) in Slovenia have been studied and the means of various biochemical parameters have been determined for sex and age groups and the place where blood has been taken. The samples were taken from two hunting enclosures in Upper Carniola (Gorenjska) and Lower Carniola (Dolenjska) during the 2000/01 winter season. Recorded mean values were: aspartate aminotransferase (145.6 ± 73,5 U/L), alanine aminotransferase (49.4 ± 13.5 U/L), lactate dehydrogenase (1155 ± 535 U/L), gamma glutamyltransferase (38.7 ± 19.9 U/L), urea (6.23 ± 2.39 mmol/L), creatinine (150.9 ± 36.5 μmol/L), total proteins (60.9 ± 7.7 g/L), albumin (38.3 ± 8.6 g/L) and glucose (5.1 ± 3.9 mmol/L). Only minor significant differences in biochemical parameters were found between groups.
