The generally accepted concept of the necessity of producing safe foods has indirectly influenced the decision to replace chemical preservatives
with natural ones. Bacteriocins, and in particular ...those synthesized by
lactic acid bacteria (LAB) in the food industry, are considered to be their effective replacement. In controlling the growth of microbial pathogens and/or the occurrence of pathogenic bacteria in food, with the
permitted nisin and pediocin, a significant antibacterial effect has been shown for most LAB bacteriocins. However, the use of purified bacteriocins as bio preservatives in cheese production is limited. To inhibit the growth of bacteria L. monocytogenes, S. aureus and C. tyrobutyricum in cheese, bacteriocinogenic LAB strains contained in primary, adjunct or protective culture are much more acceptable in cheese production.
Opće prihvaćen koncept o nužnosti proizvodnje zdrave i sigurne hrane neizravno je utjecao na odluku da se i kemijski konzervansi zamijene prirodnim. Bakteriocini, a osobito oni koje sintetiziraju bakterije mliječne kiseline (BMK) u prehrambenoj se industriji smatraju njihovom učinkovitim zamjenom. U kontroli rasta mikrobnih uzročnika kvarenja i/ili pojavnosti patogenih bakterija u hrani, uz dopušteni nizin i pediocin i za većinu je do sada opisanih i pročišćenih bakteriocina BMK utvrđen značajan antibakterijski učinak. Međutim, primjena pročišćenih bakteriocina kao biokonzervansa u proizvodnji sira je limitirana. Za inhibiciju rasta bakterija L. monocytogenes, S. aureus i C. tyrobutyricum u siru, znatno su prihvatljiviji bakteriocinogeni sojevi BMK sadržani u primarnoj, dopunskoj ili protektivnoj kulturi od pročišćenih bakteriocina.
Pozadina istraživanja. Pri današnjoj proizvodnji mlijeka u razvijenim zemljama te onima u razvoju, nekoliko čimbenika utječe na trajnost sirovog mlijeka i pojačava kontaminaciju patogenim ...mikroorganizmima, što bitno utječe na inicijalnu populaciju mikroorganizama i uzrokuje kvarenje mlijeka prije početka obrade. Eksperimentalni pristup. U ovom je radu ispitana učinkovitost reuterina kao biokonzervansa u različitim kombinacijama s bakteriocinima za kontrolu mikroflore sirovog mlijeka na farmi. U našem je prethodnom radu zbog izražene antimikrobne aktivnosti od nekoliko sojeva bakterija odabran soj Lactobacillus reuteri LR47, te je ispitana njegova sposobnost proizvodnje reuterina u sirovom mlijeku. Rezultati i zaključci. Preliminarni su testovi pokazali da je supernatant bez stanica bakterije L. reuteri LR47 bitno inhibirao rast većine ispitanih uzročnika kvarenja mlijeka. Daljnje genetičke analize soja otkrile su prisutnost dvaju gena (pduC i dhaB) odgovornih za iskorištenje glicerola tijekom dva različita metabolička puta proizvodnje reuterina. Osim toga, kolorimetrijskom je analizom otkriveno da soj LR47 ima veću sposobnost konverzije glicerola u reuterin od ostalih sojeva bakterija. Pri ispitivanju postupaka biološkog konzerviranja sirovog mlijeka pomoću reuterina ili reuterina u kombinaciji s bakteriocinima, najizraženije je svojstvo inhibicije ukupnog broja mikroorganizama i broja koliformnih bakterija zapaženo u uzorku mlijeka tretiranog kombinacijom reuterina, nizina i pediocina. Broj mikroorganizama i fizikalno-kemijska svojstva, kao što su pH-vrijednost i titracijska kiselost, pokazali su da se kombinacijom određenih koncentracija tih triju prirodnih biokonzervansa očuvala početna mikrobiološka kakvoća mlijeka, te produljila njegova trajnost za 6 sati pri 37 °C. Dobiveni rezultati potvrđuju da se primjenom reuterina u kombinaciji s bakteriocinima može privremeno kontrolirati mikroflora sirovog mlijeka, te produljiti njegova trajnost do daljnje prerade. Novina i znanstveni doprinos. U ovom je radu po prvi put opisana primjena reuterina kao alternativnog postupka produljenja trajnosti sirovog mlijeka.
Jedna je od općenitih značajki prokariota velika raznolikost genoma, na što utječu mutacije, horizontalni prijenos gena, prisutnost bakteriocina i bakterijskih virusa. Iznimna se genomska raznolikost ...razvila kao posljedica izlaganja mikroorganizama stresu i njihove prilagodbe različitim uvjetima okoliša. U radu su predstavljena dva primjera raznolikosti prokariota: genetska varijabilnost jedinki vrste Escherichia coli i raznolikost mikroorganizama prisutnih u slanim staništima, praćena raspravom o zdravstvenim problemima uzrokovanim unosom kontaminirane hrane i mogućnosti primjene mikroorganizama u biotehnologiji.
A large number of Lactobacillus species play an important role in the
production of fermented dairy products and meat products, and they are also
present in fermented vegetables and grain products. ...Lactobacilli are used in
medicine due to the positive effects that some strains have on the health of
the host. Some Lactobacillus strains have a probiotic potential due to their
ability to produce various antimicrobial compounds, exopolysaccharides (EPS),
proteinases and other. Species of the Lactobacillus genus have the potential
to inhibit the growth of competing microorganisms in the ecological niches
they inhabit, using a wide range of various defense mechanisms including the
production of a large number of secondary metabolic products, as well as many
biologically active proteinaceous agents, such as bacteriocins. Strains that
produce more than one bacteriocin with a narrow but different inhibitory
spectrum have a better chance to survive in an environment shared with
closely related species with which they are in competition for the same
nutrients. A presence of huge number of bacteriocin producing strains could
be explained by the fact that the bacteriocin genes were often located on
mobile genetic elements such as conjugative plasmids or transposons, allowing
their wide distribution via horizontal gene transfer. The aim of this
doctoral dissertation was to determine the antimicrobial potential of 52
strains of Lactobacillus casei/paracasei group, followed by a comparative
screening of the bacterial genomes in order to determine the distribution of
BacSJ and acidocin 8912 encoding genes, and also to determine the correlation
of presence of bacteriocin genes and bacteriocin production in the analyzed
strains. This approach enabled identification of potentially new bacteriocins
and putative bacteriocin genes regardless of whether the analyzed bacterial
strains produced bacteriocin. Strains of Lb. casei/paracasei group analyzed
in this study, isolates from fermented dairy products (different types of
cheese and kajmak) produced in households, were determined through
microbiological and biochemical tests and using molecular methods PCR
reactions with (GTG)5 primer and sequencing of 16S rRNA gene. Detection of
antimicrobial activity of strains from Lb. casei/paracasei group was
performed by bacteriocin activity assay using sensitive Lactobacillus and
Lactococcus indicator strains and cross-inhibition tests among bacteriocin
producer strains. To determine the distribution of genes encoding bacteriocin
BacSJ, acidocin 8912, ABCtransporter and accessory protein (Acc), PCR
analysis with specific primers for those genes was used. For the
re-establishment of the ability to produce BacSJ in BGNK1-62 strain, in which
the presence of a potential operon bacSJ2-8/bacSJ2-8i was identified, plasmid
pA2A was used. Plasmid pA2A was obtained by cloning of a PCR fragment
carrying abcT and acc genes, involved in transport of bacteriocin BacSJ, in
lactobacilli/lactococci/E. coli shuttle cloning vector pA13. Biochemical
characterization of two new bacteriocins BacUB9 produced by strain Lb.
paracasei subsp. paracasei BGUB9 and BacGR produced by strain Lb. paracasei
subsp. paracasei BGGR2-66, was done by following the effects of proteolytic
enzymes, different pH values and temperature on their activity. Isolation of
bacteriocin BacUB9 from supernatant of the overnight culture was done in two
ways: ammonium sulphate and acetone precipitation. The sample obtained by
ammonium sulphate precipitation was purified by reversed-phase chromatography
with a "step" gradient elution, and then analyzed on Tricin
SDS-polyacrylamide gel. Sample obtained from acetone precipitation was used
for determination of bacteriocin molecular mass by using mass spectrometry
LC/MS. Isolation of bacteriocin BacGR, adsorbed on the surface of cells, was
done with chloroform extraction after cultivation of BGGR2-66 strain on solid
MRS medium for 48 hours. The sample obtained by chloroform extraction was
then analyzed in two ways. The sample obtained from reverse-phase high
performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the molecular
weight of bacteriocin BacGR, by using mass spectrometry (ESI/MS). Also, a
sample obtained from chloroform extraction was analyzed on discontinuous
Tricin SDSpolyacrylamide gel, after which the sample was transferred to PVDF
membrane and sent to N-terminal amino acid sequencing. The analysis of
antimicrobial activity showed that 17 of 52 tested Lactobacillus
casei/paracasei strains produced bacteriocins. Based on the similarity of the
inhibitory spectrum, five groups of strains we defined (A-E). Group A
includes strains that have a similar antimicrobial spectrum as previously
characterized bacteriocin producer strain BGSJ2-8, and group C includes
strains that have a similar spectrum as characterized bacteriocin producer
strain BGBUK2-16. Because the use of classical methods for detection of
bacteriocin producers may underestimate the bacteriocinogenic potential of
tested strains, all 52 strains of Lb. casei/paracasei group, not only the
strains with a similar antimicrobial spectrum as strain BGSJ2-8, were
screened by PCR amplification for presence of relevant bacteriocin genes. It
was shown that the genetic determinants required for the production of
bacteriocins BacSJ (bacSJ2-8/bacSJ2-8i operon) and/or acidocin 8912 (acdT
gene) were widespread within the Lb. casei/paracasei group with a frequency
of 96.15%. On the basis of whether they produce bacteriocins, and whether
they have or do not possess the analyzed bacteriocin genes, strains of Lb.
casei/paracasei group were divided into two main groups: bacteriocin producer
strains (P1-P7) and strains in which the bacteriocin activity was not
detected (N1-N8). In all bacteriocin producers the presence of both or at
least one structural bacteriocin gene (bacSJ2-8/bacSJ2-8i operon and/or acdT
gene) was identified. A common feature of strains from P3 group, which
distinguishes them from strains from P1 group, is the absence of abcT gene.
The narrow spectrum of activity of three of the five strains of P3 group
(BGGR2-64, BGGR2-66 and BGBUK2-16) can be explained by the inability to
compensate for the absence of abcT gene, as well as with production of
potentially new bacteriocin. The common characteristic of strains belonging
to groups P2 and P4-P7 is a lack of acc gene, which narrow spectrum of
activity can be explained by the loss of acc gene, which causes their poor
bacteriocin activity, or by production of new bacteriocin, which activity
does not require the presence of accessory protein. Interestingly, in the
genomes of 33 strains of Lb. casei/paracasei group, that do not produce
bacteriocins, the presence of one or both putative structural genes for
production of bacteriocin BacSJ and acidocin 8912 were identified. Absence of
ability to produce bacteriocins can be explained by the presence of mutations
in the genes or regulatory sequences of genes encoding components involved in
the synthesis and secretion of bacteriocins. It is also possible that the
structural bacteriocin genes were expressed, but that the loss abcT gene (N3
and N6) and the lack of acc gene (N2, N4, N5 and N7) caused the absence of
secretion of the synthesized bacteriocin. Re-establishment of the ability of
strain BGNK1-62 to produce bacteriocin by in trans expression of heterologous
abcT and acc genes illustrated the importance of identifying putative
bacteriocin genes in the analysis of antimicrobial potential of bacterial
strains of interest. This study showed that both strains BGUB9 and BGGR2-66
possess genetic potential to produce three bacteriocins, but that their
antimicrobial activities probably were result of production of new, until now
not characterized bacteriocins BacUB9 and BacGR. DNA-DNA hybridization showed
plasmid localization of putative genes involved in production of bacteriocin
BacSJ and acidocin 8912 in genome of the BGUB9 and BGGR2-66 strains, and also
Bac-derivatives of these strains, obtained after plasmid curing experiments,
indicated that the genetic determinants necessary for production of
bacteriocins BacUB9 and BacGR were plasmid-encoded. BacUB9 is a relatively
heat-stable, low-molecular-weight peptide (3758 Da), active within a broad pH
range, with a bacteriostatic mode of action, sensitive to proteolytic
enzymes, which beside closely related species also inhibits the growth of
Listeria innocua ATCC 33090T strain. Based on these characteristics it
appears that BacUB9 belongs to the class IIa bacteriocins. Bacteriocin BacGR
is also small (3218 Da) and relatively heat-stable peptide, active in a wide
range of pH values, inactivated by proteolytic enzymes, but with a narrow
spectrum of activity limited to closely related species. Based on the
molecular size, biochemical characterization and obtained N-terminal
sequence, bacteriocin BacGR probably belongs to the class IId bacteriocins.
Veliki broj vrsta roda Lactobacillus zauzima ključno mesto u proizvodnji
fermentisanih mlečnih i mesnih proizvoda, prisutni su i u fermentisanom
povrću i proizvodima od žitarica. Laktobacili se takođe koriste i u medicini
usled pozitivnih efekata koje pojedini sojevi imaju na zdravlje domaćina.
Pojedini sojevi laktobacila imaju i probiotski potencijal zahvaljujući
sposobnosti produkcije različitih antimikrobnih jedinjenja, egzopolisaharida
(EPS), proteinaza i dr. Vrste roda Lactobacillus poseduju potencijal da
inhibiraju rast konkurentskih mikroorganizama u ekološkim nišama koje
naseljavaju, korišćenjem širokog spektra različitih odbrambenih mehanizama
uključujući proizvodnju velikog broja metaboličkih nusproizvoda, kao i mnogih
biološki aktivnih agenasa proteinske prirode kao što bakteriocini. Sojevi
koji proizvode više od jednog bakteriocina sa uskim, ali različitim
inhibitornim spektrom, imaju veće šanse za opstanak u okruženju koje dele sa
blisko srodnim vrstama sa kojima su u kompeticiji za
Z metodami molekularne biologije smo pripravili odseka DNA seva LF221 z zapisom za acidocin LF221 A oziroma acidocin LF221B. Na 0,9 kb dolgem odseku BamHI/HindIII, ki ima zapis za acidocin LF221 A, ...smo ugotovili prisotnost dveh bralnih okvirjev (ORF) ter del tretjega. Za OrfA2 se je izkazalo, da nosi zapis za strukturni gen za acidocin LF221 A (Acd221A), medtem ko OrfA3 nosi zapis za peptid, dolg 90 aminokislinskih ostankov, ki ima zelo verjetno vlogo proteina imunosti (Aci221A). OrfA1, za katerega je trenutno znanih 37 aminokislin, pa je najverjetneje komplementarni peptid (Acd221α) acidocina LF221 A. Z analizo 1,8 kb dolgega odseka EcoRI/HindIII (ima zapis za acidocin LF221 B) smo potrdili prisotnost štirih zaključenih ORF in enega nepopolnega. OrfB3, OrfB4 in OrfB5, ki nosijo zapis za komplementarni peptid (Acd221β) acidocina LF221 B, aktivni peptid (Acd221B) acidocina LF221 B oziroma protein imunosti (Aci221B), se nahajajo na istem operonu. Iz rezultatov analiz genskega zapisa acidocinov in sosednjih genov smo zaključili, da gre za dva različna, dvo-peptidna bakteriocina seva LF221.
Glavna je tema ovoga rada antimikrobno djelovanje industrijski važnih bakterija mliječne kiseline što se koriste kao starter kulture i probiotičke bakterije. Njihovo antimikrobno djelovanje potječe ...od proizvedenih metabolita, kao što su organske kiseline (mliječna i octena kiselina), vodikov peroksid, etanol, diacetil, acetaldehid, acetoin, ugljikov dioksid, reuterin, reutericiklin i bakteriocini. Primjena bakteriocina bakterija mliječne kiseline, u prvom redu kao biokonzervansa, može biti alternativa rješavanju sve većeg problema antibiotičke rezistencije. Druga je mogućnost u rješavanju toga problema primjena probiotika u terapiji različitih gastrointestinalnih i urogenitalnih infekcija.
Biosinteza bakteriocina pomoću probiotičkih sojeva doprinosi njihovoj kolonizaciji epitelnih stanica domaćina, njegovoj zaštiti od patogena te uspostavljanju probiotičkog soja u kompetitivnom okolišu ...prisutnom u gastrointestinalnom sustavu domaćina, a osobito se istražuje njihova bakteriocinska aktivnost važna za primjenu kao biokonzervansa, posebno u proizvodnji mliječnih proizvoda. Stoga je cilj ovog istraživanja bio ispitati antimikrobno djelovanje probiotičkih sojeva Lactobacillus helveticus M92, Lactobacillus plantarum L4, Enterococcus faecium L3, s posebnim osvrtom na biosintezu bakteriocina. Antibakterijska aktivnost navedenih probiotičkih sojeva ispitana je prema predstavnicima istih i srodnih bakterijskih vrsta te prema različitim test mikroorganizmima, učestalim uzročnicima kvarenja hrane, te uzročnicima crijevnih infekcija. Istražena je i mogućnost induciranja biosinteze bakteriocina pomoću
Lactococcus lactis subsp. lactis LMG 9450, jedne od najvažnijih starter kultura u proizvodnji sireva. Bakteriocinska aktivnost soja Lactobacillus helveticus M92 potvrđena je pomoću lančane reakcije polimerazom uz primjenu specifičnih početnica za gen koji kodira za bakteriocin helveticin. Svi probiotički sojevi su pokazali bakteriocinsko djelovanje prema Staphylococcus aureus 3048, Staphylococcus aureus K-144, Escherichia coli 3014, Salmonella enterica serovar Typhimurium FP1, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus TM2, što je važno funkcionalno svojstvo u mehanizmu kompetitivne ekskluzije koja probiotičkim sojevima omogućuje selektivnu prednost pred nepoželjnim mikroorganizmima u gastrointestinalnom sustavu domaćina. Prema dobivenim rezultatima žive stanice Lc. lactis subsp. lactis LMG 9450 induciraju bakteriocinsku aktivnost ispitivanih probiotičkih sojeva, a pri tome sama starter kultura nije bila osjetljiva na djelovanje bakteriocina.
Prisutnost genskih determinanti za stvaranje različitih vrsta bakteriocina već je ranijim istraživanjima utvrđena u slovenskim ovčjim sirevima “Tolminac” i “Kraški sir” koji se proizvode na ...tradicionalan način. Isti geni za izoliranu mikrobnu populaciju (konzorcij) također su potvrđeni i u kultiviranim uvjetima. U ovom radu pokušalo se utvrditi kako se prisutnost tih genskih determinanti u mikrobnom konzorciju odražava na njegovu antimikrobnu aktivnost. Osim toga, utvrđivao se i utjecaj bakterijskih sojeva koji nose gene za stvaranje bakteriocina na kompetitivnost rasta u mješovitoj populaciji. Mikrobni konzorcij izoliran iz sira “Tolminac” propagiran je u mlijeku 10 dana, nakon čega je utvrđena antimikrobna aktivnost kulture i prisutnost genskih determinanti za stvaranje bakteriocina. Usporedbom rezultata za sposobnost stvaranja bakteriocina prije i nakon precjepljivanja u mlijeku, utvrđen je gubitak te sposobnosti za većinu izoliranih sojeva. Sojevi koji su izdržali ponovljena precjepljivanja u mlijeku nosili su genske determinante za bakteriocine: enterocin P, enterocin L50B i citolizin. Antimikrobna aktivnost konzorcija prije i nakon precjepljivanja nije se značajno razlikovala te se ne može pripisati niti jednom od u ovom pokusu potvrđenih bakteriocina.
Istražena je sposobnost rasta bakterije Listeria monocytogenes tijekom zrenja fermentiranih kobasica, te antimikrobno djelovanje izolata bakterija mliječne kiseline. Početni broj L. monocytogenes u ...nadjevu bio je 105 CFU g–1. Kobasice su uzorkovane 0., 3., 7., 14. i 28. dana zrenja, a određivan je ukupni broj bakterija, broj bakterija mliječne kiseline, broj L. monocytogenes, te pH nadjeva. Rast L. monocytogenes bio je zaustavljen do 14. dana, dok je u gotovom proizvodu bila ispod praga detekcije (<2 log10 CFU g-1). Ukupno su bila izdvojena i determinirana 32 izolata bakterija mliječne kiseline među kojima je Leuconostoc mesenteroides pokazivao inhibicijsko djelovanje prema L. monocytogenes putem proizvodnje bakteriocina.
Cilj ovog rada bio je provjeriti prisutnost sojeva bakterija mliječne kiseline koji proizvode različite bakteriocine u tradicionalnom slovenskom siru ‘Tolminc’. Prisutnost genskih determinanti za ...pojedine bakteriocine u ovoj vrsti sira i izoliranoj populaciji mikrobiote sira ‘Tolminc’ već je bila prikazana, a također i njihova antimikrobna aktivnost. Zbog poteškoća pri povezivanju detektiranih genskih determinanti za bakteriocine i antimikrobne aktivnosti, odlučeno je u ovom radu analizirati ista svojstva i kod pojedinačnih bakteriocinogenih sojeva. Slično prethodnim istraživanjima, enterokoki i njihovi bakteriocini najbolje su bili zastupljeni. Nijedan od izoliranih sojeva nije inhibirao bakteriju Staphylococcus aureus, dok su ostale indikatorske mikroorganizme inhibirali različito. Većina sojeva nosila je genske determinante za bakteriocin citolizin. Na temelju genskih determinanti za bakteriocine, antimikrobne aktivnosti, fenotipizacije s PhP (PhenePlateTM) sistemom i identifikacije roda i vrste sojeva, mogu se naći neke sličnosti između Enterococcus sojeva.
PDF
