Svrha ovog rada bila je odrediti seroprevalenciju IgG protutijela na flaviviruse, virus krpeljnog meningoencefalitisa (KMEV), West Nile virus (WNV) i dengue virus (DENV) u sjeverozapadnom dijelu ...Hrvatske. Tristo uzoraka seruma dragovoljnih darivatelja krvi skupljeno je 1997. i 2007. godine u Međimurskoj županiji, znanom endemskom području za KME. Prisutnost IgG protutijela određivana je za KMEV, WNV i DENV ELISA metodom, a pozitivni rezultati potvrđeni su testom indirektne imunofluorescencije koristeći Flavivirus Biochip tehniku. Godine 1997. od 300 uzoraka seruma, 9 (3%) bilo je pozitivno na KMEV. U 2007. godini od 300 uzoraka seruma iz istog područja, na KMEV bilo je pozitivno 48 (16%), 1 (0,3%) na WNVi niti jedan na DENV. Naši podaci dokumentiraju porast seroprevalencije na KMEV populacije sjeverozapadne Hrvatske, a što je najverojatnije rezultat učestalijeg cijepljenja protiv KMEV i također prisutnosti ranije infekcije s WNV, što potvrđuje eksponiranost WNV zdrave populacije u sjeverpozapadnoj Hrvatskoj. DENV može biti importiran ljudima koji dolaze iz ili su posjećivali endemska područja. Rezultati ove studije mogu biti od pomoći javnom zdravstvu u odabiru i planiranju odgovarajućih mjera intervencijske i preventivne strategije.
Objectif: Examiner l'exactitude du test du tourniquet a l'admission dans le diagnostic de l'infection dengue chez les adultes au Laos. Methodes: Analyse prospective de la valeur predictive du test du ...tourniquet pour le diagnostic de l'infection dengue, telle que definie par les IgM, IgG et l'ELISA NS1 (Panbio Ltd, Australie), chez les adultes du Laos hospitalises avec une suspicion clinique d'infection dengue. Resultats: Sur 234 patients suspectes d'infection clinique dengue a l'admission, 73% ont ete confirmes serologiquement pour avoir la dengue, tandis que ceux ayant une serologie negative pour la dengue ont ete diagnostiques comme ayant le typhus des broussailles (11%), le typhus murin (3%), le typhus indetermine (3%), le virus de l'encephalite japonaise (1%), un flavivirus indetermine (1%) et la fievre typhoiede (1%). 7% d'entre eux n'avaient pas d'etiologie identifiable. Le test du tourniquet a ete positif chez 29,1% (IC95%: 23,2-34,9) et 34,1% (IC95%: 27,0-41,2) des patients seropositifs pour la dengue, chez 32,7% (IC95%: 23,5 a 41,8) de ceux avec de la fievre dengue et chez 36,4% (IC95%: 24,7-48,0) de ceux avec une fievre dengue hemorragique. La concordance inter-observateur pour le test du tourniquet etait de 90,2% (IC95%: 86,4-94,0) (Kappa=0,76). En utilisant l'ELISA comme reference, la sensibilite du test etait de 33,5 a 34%, sa specificiteetait de 84 a 91%. Les valeurs predictives positives et negatives etaient de 85 a 90% et de 32,5 a 34%, respectivement. Conclusions: Le test du tourniquet a l''admission est peu sensible et ajoute peu de valeur pour le diagnostic de la dengue chez les patients adultes hospitalises du Laos avec suspicion de dengue. Meme si un test du tourniquet positif suggere la dengue et si le traitement de diagnostics alternatifs peut ne pas etre necessaire, un resultat negatif du test n'exclut pas la dengue. Objetivo: Examinar la precision de la prueba de torniquete realizada al momento de la admision, en el diagnostico de la infeccion por dengue en adultos, en Laos. Metodos: Evaluacion prospectiva del valor predictivo de la prueba del torniquete para el diagnostico de la infeccion por dengue, definido por IgM, IgG y ELISAs NS1 (Panbio Ltd, Australia), en adultos de Laos ingresados con sospecha clinica de dengue. Resultados: De 234 pacientes con sospecha clinica de dengue al momento de la admision, a un 73% se le confirmo el dengue mediante serologia, mientras que aquellos con una serologia negativa para dengue fueron diagnosticados con tifus exantematico (11%), tifus murino (3%), tifus de origen indeterminado (3%), virus de encefalitis Japonesa (1%), flavivirus indeterminado (1%), y fiebre tifoidea (1%); 7% tenian una etiologia no identificable. La prueba de torniquete era positiva en 29.1% (95% IC=23.2-34.9%) y en 34.1% (95% IC=27.0-41.2%) de los pacientes seropositivos, en 32.7% (95% IC=23.5-41.8) de aquellos con fiebre del dengue y en 36.4% (95% IC=24.7-48.0) de los que tenian una fiebre hemorragica por dengue. La concordancia inter-observador para la prueba del torniquete era del 90.2% (95% IC=86.4-94.0) (Kappa=0.76). Utilizando los ELISAs como referencia, la sensibilidad de la prueba del torniquete era del 33.5-34%; y su especificidad del 84-91%. Los valores predictivos positivos y negativos eran 85-90% y 32.5-34%, respectivamente. Conclusiones: En el momento de la admision, la prueba del torniquete tenia una baja sensibilidad y anadia relativamente poco valor al diagnostico del dengue entre los pacientes ingresados en Laos con sospecha de dengue. Aunque una prueba positiva del torniquete sugiere dengue, y el tratamiento de diagnosticos alternativos puede no ser requerido, una prueba con resultado negativo no excluye la presencia de la enfermedad.
Résumé: Au cours des deux dernières décennies, on a assisté à l’émergence brutale d’un certain nombre de flavivirus transmis par des moustiques, principalement d’origine africaine, envahissant des ...régions géographiques où ils n’avaient jamais été actifs. Ce fut le cas pour le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) qui, à partir de 1995, a gagné le Nord-Est de l’Australie et, surtout, du virus West Nile (WNV) qui a colonisé tout le continent américain à partir de 1999. Puis, dès 2001, le virus Usutu (USUV) a infecté une grande partie de l’Europe occidentale et le virus Zika (ZIKV) a provoqué une sérieuse épidémie en Micronésie (2007). Enfin, en 2010, le virus Tembusu (TMUV) a ravagé des élevages de canards en Chine, tandis que le virus Bagaza, après s’être manifesté au Kerala, en Inde, par des cas d’encéphalites humaines, a infecté le Sud de l’Espagne. Des pouvoirs pathogènes nouveaux ont été observés chez l’Homme et chez l’animal, en même temps que des voies inhabituelles de contamination étaient décrites et que ces virus infectaient des hôtes vertébrés nouveaux et de nouvelles espèces de moustiques. Les causes de cette évolution inattendue restent obscures.
Abstract: During the past two decades, a number of mosquito-borne flaviviruses, mainly of African origin, have invaded new geographical areas where they have never been active. This was the case for the Japanese encephalitis virus which reached the northeastern part of Australia (1995) and, above all, for the West Nile virus which, since 1999, entirely colonized the American continent. Then, the Usutu virus invaded a large part of the Western Europe (2001) while the Zika virus caused a large epidemic in an island of Micronesia (2007). Finally, in 2010, the Tembusu virus devastated many duck farms in China while the Bagaza virus, after having provoked human encephalitis in India, reached the southern part of Spain. In the affected areas, new pathogenic outcomes were observed in humans and animals while new vertebrate hosts and mosquito species were infected. Moreover, unusual ways of contamination were described. The origins of this unprecedented evolution remain to be clarified.
Les flavivirus ayant un impact en médecine vétérinaire sont largement distribués dans le monde (à l’exemple de la fièvre West Nile (WNF) présente sur les cinq continents ou de l’Encéphalite japonaise ...(EJ) en Asie du Sud-Est) et sont responsables de maladies à dominante neurologique chez l’homme et/ou le cheval.La virémie étant généralement brève lors de ces infections virales, les méthodes de diagnostic utilisées sont essentiellement sérologiques. Or le chevauchement fréquent des aires de répartition des flavivirus complique le diagnostic sérologique. En effet, des réactions sérologiques croisées entre flavivirus sont observées lors de l’utilisation de méthodes de diagnostic usuelles telles que l’ELISA et l’immunofluorescence (IF). Les résultats sérologiques doivent donc être confirmés par la méthode fastidieuse de séroneutralisation (SNT) virale avec les différents flavivirus existants dans la région. De plus, le risque d’émergence sur un territoire donné de nouveaux flavivirus comme le virus Zika au Brésil ou en Amérique du Nord ne peut être exclu.Nous avons donc développé dans la première partie de ce travail une nouvelle stratégie de diagnostic sérologique multiplexe à l’aide de la méthode d’immuno-essai (MIA) sur billes. Sachant que la glycoprotéine d’enveloppe soluble (sE) des flavivirus est divisée en 3 domaines (D) structuraux, DI, DII et DIII et que les épitopes du DIII sont spécifiques de chaque flavivirus, des protéines EDIII recombinantes de différents flavivirus d’intérêt ont été synthétisées en système d’expression Drosophila S2 et leur antigénicité a été testée sur sérums équins et ovins. Nous avons obtenu des résultats très encourageants en démontrant que l’utilisation des EDIII associée avec la capacité de multiplexage de la méthode MIA apparaît comme une réponse adaptée au défi du diagnostic sérologique des infections à flavivirus.Nous avons en outre utilisé la même méthode de multiplexage mais avec des antigènes NS1 du WNV pour mettre en place un test DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) permettant de différencier les chevaux infectés par le WNV des chevaux vaccinés avec un vaccin recombinant WNV.Un autre écueil en médecine vétérinaire est le traitement des affections à flavivirus. En effet l’arsenal thérapeutique est limité et le traitement est avant tout symptomatique. Nous avons dans la seconde partie de ce travail testé in vitro une molécule antivirale à large spectre, le sr1057 sur nos virus d’intérêt (WNV et JEV). Cette molécule qui provient d’une stratégie de criblage développée par l’Institut Pasteur a probablement pour cible la cellule de l’hôte car elle est capable d’inhiber des virus très différents, à génome à ARN de polarité positive ou négative et ADN.Les résultats que nous avons obtenus avec ce composé sont en demi-teinte pour les flavivirus testés avec une efficacité démontrée pour le JEV mais plus modeste pour le WNV. Ils n’excluent cependant pas une possible utilisation de cet antiviral en médecine vétérinaire équine car une activité inhibitrice in vitro sur les virus de l’Herpes équin de type I et de l’artérite virale a été confirmée par d’autres collaborateurs.
Flaviviruses with a major impact in veterinary medicine are widely distributed (e.g. West Nile fever (WNF) has spread across the five continents and Japanese Encephalitis (JE) is reported in South-East Asia) and are mainly responsible for neurological diseases in humans and/or horses.After flavivirus infection, viremia in mammal hosts is generally short and consequently indirect methods are mostly used to diagnose flavivirus infections. However, frequent spatial overlapping in their circulation areas renders the interpretation of serological assays difficult. Indeed, cross-reactions between flaviviruses are observed in rapid serological tests such as in ELISA and immunofluorescence assays (IFA). Serological assay results should thus be confirmed by the tedious comparative virus neutralization test (VNT) using a panel of viruses known to circulate in the area. Moreover, the risk of emergence of new flaviviruses such as reported recently with the Zika virus in Brazil or in North America should be considered when studying flavivirus epidemiology.In the first section, a new strategy aiming at improving the serological diagnosis of flavivirus infections was developed using the multiplexing capacity of microsphere immunoassays (MIA). The flavivirus soluble envelope (sE) glycoprotein ectodomain is composed of three domains (D), e.g. DI, DII and DIII, with EDIII containing virus-specific epitopes. Recombinant EDIIIs of different flaviviruses were synthesized in the Drosophila S2 expression system. The microspheres coupled with rEDIIIs were assayed with equine and ovine sera from natural and experimental flavivirus infections or non-immune samples. Very encouraging results have been obtained and this innovative multiplex immunoassay based on flavivirus rEDIIIs appears to be a powerful alternative to ELISAs and VNTs for veterinary diagnosis of flavivirus-related diseases.MIA with WNV nonstructural 1 protein were also implemented to differentiate Infected from Vaccinated Animals (DIVA). Such a DIVA approach was only successful when horses had been immunized with a recombinant canarypox vaccine, while horses receiving inactivated WNV vaccine developed immune responses close to the ones induced after natural infection.Another pitfall in veterinary medicine is the lack of therapeutics for viral diseases and specifically for flaviviruses. The therapeutic arsenal is indeed rather limited and animals are generally administered supportive treatments only. In the second part, the results of the in vitro testing of a broad spectrum antiviral named sr1057 on WNV and JEV replication are presented. This chemical, identified from a unique screening strategy developed by Pasteur Institute, is probably targeting the host cell and was found to inhibit the replication of varied RNA and DNA viruses belonging to different virus families. The sr1057 compound was not as efficient at inhibiting the replication of flaviviruses as for other RNA+ viruses, with a modest antiviral effect demonstrated for WNV and a higher efficacy on JEV. This antiviral presents however potentials for applications in equine veterinary medicine because it efficiently inhibited equine herpes virus-1 and equine arteritis virus in vitro, as clearly shown by other collaborators.
Les maladies virales à transmission vectorielle émergentes et ré-émergentes comme la dengue, le chikungunya ou le zika sont responsables de nombreuses épidémies sévères à travers le monde. Récemment, ...la propagation rapide et très étendue du virus zika (ZIKV) ainsi que les complications neurologiques graves liées à l’infection par ZIKV ont incité l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) à déclarer le ZIKV comme une urgence de santé publique mondiale. Aujourd’hui, les mesures préventives ou curatives de l’infection par ZIKV sont quasiment inexistantes. D’autre part, la flore endémique de La Réunion est connue comme une source riche, renouvelable et prometteuse en produits naturels anti-infectieux. L’inscription à la pharmacopée française de 19 plantes médicinales réunionnaises souligne le potentiel thérapeutique des substances naturelles issues de la biodiversité locale. Les travaux ont été consacrés à l’identification de substances naturelles anti-ZIKV issues d’une sélection de sept plantes médicinales réunionnaises inscrites à la pharmacopée française. Dans une première étape, une extraction sans solvant assistée par micro-ondes a été appliquée sur les sept plantes médicinales sélectionnées afin d’obtenir des éco-extraits. Dans une deuxième étape, le criblage de l’activité antivirale, en utilisant un clone moléculaire du ZIKV avec un gène rapporteur, a permis d’identifier deux éco-extraits actifs provenant de Aphloia theiformis et de Psiloxylon mauritianum. Après avoir vérifié l’absence de cytotoxicité et de génotoxicité des extraits actifs, l’activité antivirale a été aussi démontrée sur d’autres types d’extraits réalisés via des méthodes d’extractions traditionnelles (infusion, décoction et macération). L’activité antivirale a été validée sur différentes souches de ZIKV (historique et épidémique) ainsi que sur les 4 sérotypes du virus de la dengue. Enfin, le mode d’action des deux extraits actifs a été étudié. Il a été montré que les éco-extraits d’A. theiformis et de P. mauritianum ciblent les phases précoces du cycle viral en inhibant l’attachement du virus à la cellule hôte. À l’aide de la microscopie électronique, il a été montré que l’éco-extrait d’A. theiformis déforme la particule virale empêchant cette dernière de s’attacher à la membrane de la cellule hôte. Ces résultats démontrent l’importance des plantes médicinales réunionnaises comme source de substances naturelles anti-infectieuses.
Emerging and re-emerging vector-borne viral diseases such as dengue, chikungunya or zika are responsible for many severe epidemics worldwide. Recently, the rapid spread of zika virus (ZIKV) worldwide and the serious neurological complications associated with ZIKV infection have prompted the World Health Organization (WHO) to declare ZIKV a public health emergency. Today, preventive or curative measures against ZIKV infection are almost non-existing. On the other hand, the endemic flora of Reunion Island is known as a rich, renewable and promising source of natural anti-infective products. The registration of 19 medicinal plants from Reunion Island in the French pharmacopoeia highlights the therapeutic potential of natural substances derived from local biodiversity. The work was dedicated to the identification of natural anti-ZIKV substances from a selection of seven medicinal plants from La Reunion registered in the French pharmacopoeia. In a first step, in collaboration with a local start-up (Bourbon Extracts), a solvent-free microwave-assisted extraction was applied to the seven selected plants in order to obtain eco-extracts. In a second step, the screening for antiviral activity, using a ZIKV molecular clone with a reporter gene, allowed the identification of two candidate plants: Aphloia theiformis and Psiloxylon mauritianum. After verifying the absence of cytotoxicity and genotoxicity of the active extracts, the antiviral activity was also demonstrated on other types of extracts using traditional extraction methods (infusion, decoction and maceration). The antiviral activity has been validated on different strains of ZIKV (historical and epidemic) as well as on the four serotypes of the dengue virus. Finally, the mode of action of the two active extracts has been studied. It has been shown that the eco-extracts from A. theiformis and P. mauritianum target the early steps of the viral cycle by inhibiting the attachment of the virus to the host cell. Using electron microscopy, it has been shown that the eco-extract of A. theiformis deforms the viral particle preventing its attachment to the membrane of the host cell. These results demonstrate the importance of medicinal plants from Reunion Island as a source of natural anti-infectious substances.
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