Priprava plazmida CYP51-GFP za izražanje fuzijskega proteina med človeško lanosterolno ▫14alfa▫demetilazo in zelenim fluorescinom v sesalskih celicah
Seliškar, Matej
Lanosterol 14Ž-demetilaza spada v veliko naddruzino citokromov P450. Pri bakterijah so citokromi P450 topni citosolni proteini, medtem ko so pri evkariontih integralni membranski proteini. Po svoji ...funkciji so monooksigenaze, ki pri èloveku sodelujejo v biosintezi in metabolizmu sterolovin steroidnih hormonov ter metabolizmu masèobnih kislin in njihovih derivatov. Poleg tega so vkljuèeni v oksidativni metabolizem eksogenih lipofilnih snovi in s tem tudi zdravil, kar je prvi korak pri njihovem izloèanju.Lanosterol 14Ž-demetilaza je pri èloveku vkljuèena v poskvalenski del biosinteze holesterola. Katalizira oksidativno 14Ž-demetilacijo lanosterola, ki poteka v treh stopnjah. Encim se nahaja na citoplazemski strani endoplazemskega retikuluma, kamor je zasidran s svojim N-terminalnim koncem, ki najverjetneje vsebuje signal za zadrzevanje na endoplazemskem retikulumu. Veliko proteinov, stalno prisotnih na endoplazemskem retikulumu, je taksnih, da z vezikularnim transportom potujejo do Golgijevega aparata, od koder se zaradi retencijskega signala vrnejo na endoplazemski retikulum. Za nekatere proteine je tudi ze znano, kateri del proteina sluzi kot retencijski signal. Za lanosterol 14Ž-demetilazo so dolgo mislili, da je stalno prisotna na endoplazemskem retikulumu in da zanjo ni znaèilno krozenje z endoplazemskega retikuluma preko Golgijevega aparata nazaj na endoplazemski retikulum ali potovanje v ostale dele celice. Novejse raziskave kazejo, da je taksen transport v celici mozen.V okviru diplomske naloge smo pripravili molekularno orodje, ki nam bo sluzilo za studij znotrajceliène lokalizacije lanosterol 14Ž-demetilaze in nam omogoèilo doloèiti, kateri deli aminokislinskega zaporedja tega proteina so pomembni za znotrajcelièno lokalizacijo. Pripravili smo plazmid CYP51-GFP za izrazanje fuzijskega proteina med èlovesko lanosterol 14Ž-demetilazo in zelenim fluoresceinom v èloveskih celicah. Zeleni fluorescin je protein, ki se zadnjih deset let veliko uporablja za raziskave znotrajceliène lokalizacije in potovanja proteinov. Pri vzbujanju z UV svetlobo doloèene valovne dolzine fluorescira zeleno, kar lahko opazujemo v zivih celicah. Ta protein smo povezali s C-terminalnim koncem lanosterol 14Ž-demetilaze, ker je N-terminalni konec verjetno pomemben za usidranje v membrano endoplazemskega retikuluma in mora ostati prost. Pripravili smo ekspresijske plazmide za fuzijske proteine z razliènimi N in C-terminalnimi konci lanosterol 14Ž-demetilaze, da bomo lahko v kasnejsem raziskovalnem delu ugotovili, kaksen vpliv imajo te spremembe na njegovo znotrajcelièno lokalizacijo. Po pripravi plazmidov smo naredili transfekcijo nesmrtnih èloveskih celiènih linij z enim od plazmidov in celice opazovali pod konfokalnim fluorescenènim mikroskopom 24 h, 48 h in 72 h po transfekciji. Izrazanje fuzijskega proteina v èloveskih celicah je bilo uspesno, saj smo opazili fluorescenco v obmoèju citoplazme, ki oznaèuje lokacijo lanosterol 14Ž-demetilaze, oznaèene z zelenim fluoresceinom. Za podrobno spremljanje lokalizacije in morebitno potrditev novejsih teorij o potovanju lanosterol 14Ž-demetilaze preko Golgijevega aparata nazaj na endoplazemski retikulum bomo morali pripraviti stabilne celiène linije, ki bodo konstitutivno izrazale fuzijski protein med èlovesko lanosterol 14Ž-demetilazo in zelenim fluorescinom.
Vrsta gradiva - diplomsko delo
Založništvo in izdelava - Ljubljana : [Seliškar M.], 2002
Knjižnica dp 577 Seliškar Matej Priprava IN: 0006498
prosto - za čitalnico
Vnos na polico
Dodajanje gradiva na polico je uspelo.
Dodajanje gradiva na polico je spodletelo.
Dodajanje gradiva na polico ni bilo potrebno.
Bibliografsko gradivo je bilo uspešno dodano na polico.
Dodajanje bibliografskega gradiva na polico ni uspelo.
Gradivo je že na polici.
Trajna povezava
URL:
Faktor vpliva
Dostop do baze podatkov JCR je dovoljen samo uporabnikom iz Slovenije. Vaš trenutni IP-naslov ni na seznamu dovoljenih za dostop, zato je potrebna avtentikacija z ustreznim računom AAI.
Leto
Faktor vpliva
Izdaja
Kategorija
Razvrstitev
JCR
SNIP
JCR
SNIP
JCR
SNIP
JCR
SNIP
Izberite knjižnično izkaznico:
Baze podatkov,
v katerih je revija indeksirana
Ime baze podatkov
Področje
Leto
Povezave do osebnih bibliografij avtorjev
Povezave do podatkov o raziskovalcih v sistemu SICRIS
Storitev za pridobivanje naslova trenutno ni dostopna, prosimo, poskusite še enkrat.
S klikom na gumb "V redu" boste potrdili zgoraj izbrano prevzemno mesto in dokončali postopek rezervacije.
S klikom na gumb "V redu" boste potrdili zgoraj izbrano prevzemno mesto in naslov za dostavo ter dokončali postopek rezervacije.
S klikom na gumb "V redu" boste potrdili zgoraj izbrani naslov za dostavo in dokončali postopek rezervacije.
Obvestilo
Trenutno je storitev za avtomatsko prijavo in rezervacijo nedostopna. Gradivo lahko rezervirate sami na portalu Biblos ali ponovno poskusite tukaj kasneje.
Citiranje
Funkcionalnost trenutno ni na voljo. Prosimo, poskusite kasneje.
