•Two out of eight isolates obtained from cattle milk and feces showed characteristics of propionibacteria.•Probe Pap446 identified two isolates as Acidipropionibacterium acidipropionici.•The identity of these isolates was confirmed by molecular techniques. Acidipropionibacterium acidipropionici is widely used for many applications, such as propionic acid production, cereal silage, and also as probiotic. Due to this plethora of applications, new isolates of A. acidipropionici with improved features are being searched for. These new isolates must be accurately identified, however, most approaches become expensive and time-consuming when the number of isolates is high. On the contrary, fluorescence in situ hybridization allows the affordable, reliable, and rapid identification of microorganisms in pure cultures and environmental and medical samples. Therefore, the aim of this work was to apply a fluorescent in situ hybridization probe for the reliable identification of new A. acidipropionici isolates. To this end, probe Pap446, specific for A. acidipropionici, was validated by hybridization assays with strains of this species from different origins, other species of the same genus or family, and unrelated genera. Eight isolates with propionibacterium characteristics were obtained from milk and feces of cows. Probe Pap446, hybridized only with isolates III and VI. The identity of these isolates was further confirmed by PCR using group and species-specific primers for propionibacteria and 16S rDNA sequencing. Acidipropionibacterium acidipropionici es ampliamente usada para diversas aplicaciones, como producción de ácido propiónico, ensilado de cereales y probiótico. Debido a esta variedad de aplicaciones, continuamente se buscan nuevos aislamientos de A. acidipropionici con características nuevas. Estos nuevos aislamientos deben ser identificados correctamente, pero la mayoría de las técnicas disponibles resultan costosas e insumen mucho tiempo cuando el número de aislamientos es elevado. Por el contrario, la hibridación fluorescente in situ permite una identificación barata, confiable y rápida de microorganismos en cultivos puros y en muestras ambientales y médicas. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue la aplicación de una sonda oligonucleotídica en un protocolo de hibridación fluorescente in situ para la identificación confiable de nuevos aislamientos de A. acidipropionici. Con este fin, se validó la sonda Pap446, específica de A. acidipropionici mediante ensayos de hibridación con cepas de esta especie de diferente origen, otras especies del mismo género o familia, y géneros no relacionados. Se obtuvieron ocho aislamientos con características de propionibacterias a partir de leche y heces de vacas. La sonda Pap446, hibridó únicamente con los aislamientos III y VI. La identidad de estos aislamientos fue confirmada a través de PCR con cebadores específicos para propionibacterias y para A. acidipropionici, y mediante secuenciación del ADNr 16S.