Penelitian ini merupakan upaya dalam perolehan kalus sebagai sumber metabolit sekunder melalui kultur kalus tanaman kencur (Kaemferia galanga) melalui modifikasi media tanam kultur kalus dengan berbagai konsentrasi sukrosa dan kombinasi zat pengatur tumbuh (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid dan BAP). Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan, Fakultas Pertanian, Universitas Muhammadiyah Purwokerto, waktu penelitian selama 8 bulan. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap dengan perlakuan konsentrasi sukrosa ( 20, 30 dan 40 g/l) dan perlakuan kombinasi 2,4 D (0,5 – 2 ppm) dan BAP ( 0 - 0,2 ppm). Hasil penelitian menunjukkan kombinasi perlakuan sukrosa ( 20 – 40 g/l) dan zat pengatur tumbuh 2,4 D ( 1 – 3 ppm) dan BAP (0 – 0,2 ppm) dalam medium proliferasi kalus, perlakuan sukrosa memberikan pengaruh terhadap variabel bobot segar kalus, bobot kering kalus serta morfologi kalus yang terbentuk. Perlakuan sukrosa 30 % dalam media proliferasi kalus memberikan hasil terbaik untuk variabel pengamatan bobot kalus yaitu seberat 3,8 gram, bobot kering kalus seberat 0,151 gram dengan keremahan kalus yang cukup tinggi dan warna kalus putih jernih.