-
Vpeljava tehnologije kapljične digitalne verižne reakcije s polimerazo v razvoj bioloških zdravil = Implementation of droplet digital polymerase chain reaction technology in biological drugs development : magistrski študij laboratorijska biomedicinaDermota, TjašaKapljična digitalna verižna reakcija s polimerazo (ddPCR) je novejša oblika digitalne verižne reakcije s polimerazo (dPCR). Metoda temelji na tvorbi približno 20.000 kapljic, ki nastanejo v emulziji ... voda v olju (V/O), verižni pomnožitvi s polimerazo in končni absolutni kvantifikaciji kapljic s prisotnim pomnoženim produktom. Metoda je uporabna na številnih področjih, v okviru magistrske naloge pa smo želeli preveriti, če jo lahko uporabljamo tudi za razvoj rekombinantnih bioloških učinkovin v biofarmacevtski industriji. Pri izbiri ustreznih klonov igra ključno vlogo karakterizacija števila kopij, integritete in stabilnosti transgena. V podjetju Lek d.d. v ta namen uporabljajo verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (qPCR) in metodo prenosa po Southernu, ki pa ju želijo nadomestiti z novejšo metodo - ddPCR. Metodo ddPCR smo najprej optimizirali in nato preverili njeno uporabnost za genetsko karakterizacijo klonov ovarijskih celic kitajskega hrčka (CHO), uporabljenih v proizvodnji rekombinantnih proteinov, zlasti monoklonskih protiteles. Preverili smo analitske parametre ddPCR pri določanju števila kopij in integritete vstavljenih transgenov, izražanja lahke in težke verige protiteles v celičnih linijah in možnost uporabe ddPCR za kvantifikacijo rezidualne DNA v različnih stopnjah čiščenja zdravilne učinkovine. Določili smo široko dinamično območje, ki ga pokriva ddPCR tako za določanje koncentracije DNA (4 % 8000 kopij/[mikro]L), kot tudi mRNA (8 % 20.000 kopij/[mikro]L). Gre za visoko občutljivo metodo, saj je limita detekcije 1,5 % 3 kopije tarčnega gena/[mikro]L pri vzorcih DNA, ter 1,2 kopij/[mikro]L pri RNA vzorcih. Variabilnost metode pri kvantifikaciji DNA se giblje med 10 in 15 % in je nekoliko višja pri uporabi barvila EvaGreen v primerjavi s hidrolizirajočimi sondami. DdPCR smo primerjali z uveljavljenimi metodami in ugotovili, da je metoda primerna za določanje števila kopij in izražanja transgenov ter rezidualne DNA. Pri preverjanju integritete vstavljenih transgenov je ddPCR izkazala 80 % občutljivost, 88 % specifičnost in 82 % točnost glede na metodo prenosa po Southernu. Pri določanju stabilnosti vstavljenih transgenov je ddPCR izkazala 40 % občutljivost, 100% specifičnost ter 70 % točnost glede na prenos po Southernu. V razvoju bioloških zdravil je metoda ddPCR primerna za preverjanje integritete transgenov in določanje števila kopij pri presejanju klonov, saj je hitrejša in v primeru določanja števila kopij tudi točnejša. Za uporabo pri določanju stabilnosti pa bi ddPCR potrebovala še nadaljnjo optimizacijo.Vrsta gradiva - magistrsko delo ; neleposlovje za odrasleZaložništvo in izdelava - Ljubljana : [T. Dermota], 2021Jezik - slovenskiCOBISS.SI-ID - 52884483
Avtor
Dermota, Tjaša
Drugi avtorji
Doljak, Bojan |
Vogelsang, Matjaž
Teme
Biološka zdravila |
Analizna kemija |
ddPCR |
kapljična digitalna verižna reakcija s polimerazo |
celice CHO |
ovarijske celice kitajskega hrčka |
integriteta transgena |
stabilnost klona |
rezidualna DNA |
ekspresija transgena |
optimizacija ddPCR |
optmizacija digitalne verižne reakcije s polimerazo
Knjižnica/institucija |
Kraj | Akronim | Za izposojo | Druga zaloga |
---|---|---|---|---|
Fakulteta za farmacijo, Ljubljana | Ljubljana | FFALJ |
v čitalnico 1 izv.
|
Vnos na polico
Trajna povezava
- URL:
Faktor vpliva
Dostop do baze podatkov JCR je dovoljen samo uporabnikom iz Slovenije. Vaš trenutni IP-naslov ni na seznamu dovoljenih za dostop, zato je potrebna avtentikacija z ustreznim računom AAI.
Leto | Faktor vpliva | Izdaja | Kategorija | Razvrstitev | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
JCR | SNIP | JCR | SNIP | JCR | SNIP | JCR | SNIP |
Baze podatkov, v katerih je revija indeksirana
Ime baze podatkov | Področje | Leto |
---|
Povezave do osebnih bibliografij avtorjev | Povezave do podatkov o raziskovalcih v sistemu SICRIS |
---|---|
Dermota, Tjaša | |
Doljak, Bojan | 19785 |
Vogelsang, Matjaž | 26574 |
Izberite prevzemno mesto:
Prevzem gradiva po pošti
Obvestilo
Gesla v Splošnem geslovniku COBISS
Izbira mesta prevzema
Mesto prevzema | Status gradiva | Rezervacija |
---|
Prosimo, počakajte trenutek.