Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Ova studija je osmišljena kako bi procijenili utjecaj oksidativnog stresa na extrapituitarnu sekreciju hormona rasta (GH) u oku, kao ...i analizirali međuovisnost razina produkcije očnog i serumskog GH u normalnim i uvjetima hipoksije. Ispitanici koji su predstavljali model oksidativnog stresa su 32 pacijenata s razvijenom proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR) i bili su liječeni kirurški pars plana vitrektomija (PPV). 49 pacijenata, ne-dijabetičara u kontrolnoj skupini (K) su izabrani između onih koji nisu patili od metaboličke bolesti, a ipak su morali biti operirani zbog drugih očnih bolesti. Uzorci vitreusa uzimani su tijekom PPV kirurškog zahvata, a istovremeno je uzeta i krv iz kubitalne vene. Mjerenja GH vrijednosti u serumu i vitreusu provedena su testom elektrokemijske luminiscencije (ECLIA). Procjena oksidativnog stresa izvedena je mjerenjem produkata uznapredovale oksidacije proteina (AOPP) i lipidne peroksidacije (LPO) pomoću testa enzimski vezane imunoabsorpcije (ELISA) u serumu i vitreusu. Serumske vrijednosti AOPP su bile značajno više nego vitrealne u obje skupine (p <0,001 za svaku skupinu), a za LPO samo u PDR skupini (p <0,001). Postoji značajna pozitivna korelacija između serumskih i vitrealnih vrijednosti LPO u skupini dijabetičara (r = 0,909, p <0,001).Vrijednosti GH u obije skupine značajno su veće u serumu, nego vitreusu (p <0,001). Usporedbom vrijednosti GH u serumu između kontrolne i PDR skupine, značajno više vrijednosti su pronađene kod dijabetičara (p = 0,012). Vitrealne vrijednosti GH izmjerene u obje skupine su slične, nešto više u dijabetičara. Rezultati našeg istraživanja su potvrdili postojanje sekrecije GH u oku i otkrili da je njegova produkcija u oku samostalna i neovisna o GH hipofize, a također je neovisna o utjecaju oksidativnog stresa.- This study was designed to evaluate influence of oxidative stress environment on extrapituitary growth hormone (GH) secretion in the eye as well as to analize interdependence between eye GH levels and serum GH levels in normal and hypoxic conditions. 32 patients with developed proliferative diabetic retinopathy (PDR) represented oxidative stress model and were treated surgically by pars plana vitrectomy (PPV). 49 patients, non-diabetics in control group were selected from those who have not suffered from metabolic diseases and yet they had to be operated due to other ocular disorders. Vitreous samples were taken during PPV surgical procedure and simultaneously blood from the cubital vein was collected. Measurements of GH values in serum and vitreous samples were conducted by electrochemical luminescence assay (ECLIA). Evaluation of oxidathive stress was carried out using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of Advanced Oxidation Protein Products (AOPP) and Lipide Hydroperoxide (LPO) in serum and vitreous as well. Serum values of AOPP were significantly higher than vitreal in both groups (p<0,001 for each group), and for LPO only in PDR group (p<0,001). Significant positive correlation between serum and vitreous LPO values in diabetic group (r=0,909; p<0,001) was observed. GH values in both groups were significantly higher in serum, than vitreous (p<0,001 for each group) and comparing GH serum values between control and PDR group, significantly higher amounts were found in diabetics (p=0,012). Vitreous GH values measured in both groups were similar, slightly higher in diabetics. Results of our study have confirmed existence of GH secresion in the eye and disclosed that GH production in eye is autonomous and independent to pituitary GH and is also independent to oxidative stress influence.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Većina psihoaktivnih vrsta gljiva sadrži psilocibin, psilocin, beocistin ili nor-beocistin, a zbog djelovanja psilocina sličnog ...LSD-u koriste se kao rekreacijska droga i zabranjene su. Dokazivanje aktivnih tvari iz forenzičkih uzoraka toksikološkim metodama GC-MS i LC-MS nije moguće iz otrusine spora ili micelija prije procesa fruktificiranja. Glavni cilj ovog rada bio je ukazati na potencijal primjene molekularnih i morfoloških metoda u forenzičkoj analizi psihoaktivnih gljiva. Morfološkom analizom 63 forenzička uzorka uspješno je identificirano 5 vrsta, a najzastupljenija je vrsta Psilocybe cubensis. Sekvenciranjem cijele regije ITS i dijela gena LSU forenzičkih uzoraka potvrđeni su rezultati morfološke analize i uspješno je identificirana šesta vrsta iz otrusine spora. Obje metode mogu se implementirati u rutinsku forenzičku analizu uzoraka gljiva. Potencijal istraživanog modela preliminarne identifikacije psihoaktivnih gljiva korištenjem specifičnih sondi TaqMan®MGB u reakciji Real Time PCR nije potvrđen. Analizom LC-MS otkriven je psihoaktivni status vrsta Stropharia semiglobata i Galerina badipes.- Most of psychoactive fungi contain psilocybin, psilocin, baeocystin or nor- baeocystin, and due to effects of psilocin, which are similar to LSD, they are illegal. Proving active substances from forensic samples through toxicological methods is not possible from spore print or from mycelia. Main goal of this thesis was to emphasize the potential of using molecular and morphological methods in forensic analysis of psychoactive fungi. Morphological analysis of 63 forensic samples resulted with 5 successfully identified species with Psilocybe cubensis as the most common. Through sequencing the ITS region and the part of LSU gene of forensic samples, morphological analysis results were confirmed and sixth species was successfully identified from spore print. Both methods can be implemented in the routine forensic workflow for fungi. Potential of the researched model for preliminary identification of psychoactive fungi by using specific TaqMan®MGB probes in RT-PCR reaction, was not confirmed. LC-MS analysis established the psychoactive status of species Stropharia semiglobata and Galerina badipes.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Cilj ovog istraživanja je prikazati učinke i razlike u toksičnosti te prooksidativne i antihemostatske mehanizme triju biljnih ...formulacija namijenjenih ljudskoj uporabi kao dodaci prehrani, a koja sadrže pripravak biljke Ginkgo biloba, dostupne na području Republike Hrvatske. Istražen je i njihov učinak u kombinaciji s antihemostatskim lijekovima, acetilsalicilnom kiselinom i varfarinom. Istraživanje je provedeno na životinjskom modelu štakora. Testovima agregacije i koagulacije dokazano je da svi korišteni biljni pripravci produžuju vrijeme agregacije trombocita dok na koagulaciju nemaju statistički značajan učinak. Dokazano je da korištenje biljnih pripravaka u kombinaciji s lijekovima mijenja vrijednosti mjerenih biljega oksidativnog stresa, aktivnost enzima superoksid dismutaze (SOD) i katalaze te koncentraciju reduciranog glutationa (GSH) i malondialdehida (MDA) u tkivu jetre, bubrega, slezene i mozga, te u krvi. Dobiveni rezultati ukazuju na potrebu veće pozornosti prilikom upotrebe pripravka ginka i različitih antihemostatskih lijekova u svakodnevnoj kliničkoj praksi.- The aim of this study was to demonstrate the effects and the differences in toxicity and prooxidant and antihemostatic mechanisms of three herbal dietary supplements, containing extract of Ginkgo biloba, that are available in Croatia. The goal was also to investigate their efect in combination with antihemostatic drugs, acetylsalicylic acid and warfarin. The study was conducted on animal model. Platelet aggregation and coagulation tests proved that all used herbal products prolong platelet aggregation, while on coagulation they had no statistically significant effect. It has been shown that the use of herbal dietary supplements in combination with medicaments changes the value of the measured biomarkers of oxidative stress, the activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase and concentration of glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in tissues of liver, kidney, spleen and brain, and also in blood. The results suggested that the greater attention should be paid to the usage of these products in clinical practice.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Prekomjerno stvaranje reaktivnih kisikovih spojeva (ROS) u stanicama uzrokuje ireverzibilne modifikacije proteina, kao što je na ...primjer karbonilacija, koje utječu na njihovu strukturu i funkciju te na stabilnost proteoma. Istraživanja provedena na bakterijama i beskralješnjacima su pokazala postojanje korelacije između oštećenja proteoma i stanične smrti. Cilj ovog rada bio je utvrditi postoji li takva poveznica između stanične smrti i oštećenja proteina imortalnih staničnih linija dobivenih iz primarnog tumora (SW480) i metastaze (SW620) adenokarcinoma debelog crijeva. Izlaganjem staničnih linija oksidativnom stresu utvrdili smo da stanična linija SW620 ima nižu razinu oštećenih proteina od stanica SW480 te je otpornija na oštećenja proteoma izazvanih UVC zračenjem. Razlog povećane otpornosti proteoma stanica SW620 mogla bi biti niska razina ROS-a u odnosu na stanice SW480 i veća stabilnost proteoma. Usporednom analizom proteoma staničnih linija SW480 i SW620 u trenutku kada je smrtnost u populaciji iznosila 90% utvrdili smo da su mogući razlozi povećane osjetljivosti stanica SW480 narušene funkcije sustava za održavanje proteostaze i odstranjivanja oštećenih proteina te smo identificirali proteine koji bi mogli biti potencijalne mete u razvoju protutumorskih terapija.- The excessive production of reactive oxygen species (ROS) in cells induces irreversible protein modifications, carbonylation, that impairs protein structure and function, as well as proteome stability. The correlation between proteome damage and cell death is well established in bacteria and invertebrates and the aim of this research was to investigate the relationship between mortality and protein damage of immortal cell lines derived from primary tumor adenocarcinoma SW480 and its metastasis SW620. We found that SW620 cell line is more resistant to UVC-induced oxidative damage relative to SW480 cells. The reason for greater resistance of SW620 cells could be lower ROS level compared to SW480 and greater proteome stability. The differential analysis of proteomes of two cell lines after 90% UVC-induced mortality shows that SW480 displays greater sensitivity due to the damage of proteome quality system and the ability to remove oxidative damaged proteins. Also, we identified proteins that could be possible targets in anti-cancer therapy.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- U ovom su radu ispitane fitokemijske značajke, antimikrobna svojstva i biološki učinci lista obične planike. Određen je sadržaj ...ukupnih fenola, flavonoida, tanina, fenolnih kiselina, te polifenolni profil lista UHPLC-MS/MS (Orbitrap) metodom, sadržaj arbutina i hidrokinona HPLC-UV/DAD metodom, antioksidacijska svojstva FRAP, TEAC i DPPH metodama. MIK koncentracije su utvrđene dvostrukom mikrodilucijom, a mutagenost komet-testom i CBMN testom. Dokazano je 37 novih fenolnih spojeva. Sadržaj arbutina u listu bio je 0,3 %, dok hidrokinon nije detektiran. Metanol je bolje sredstvo za ekstrakciju polifenola od vode. Metanolni ekstrakt lista pokazao je bolji antioksidacijski, te antimikrobni učinak na ATCC i kliničke sojeve mikroorganizama. Arbutin nije pokazao antimikrobni učinak, dok je njegov metabolit hidrokinon pokazao pozitivan učinak na ispitivane uropatogene. U uvjetima in vitro i in vivo vodeni ekstrakt lista pri koncentraciji arbutina koja odgovara maksimalno dopuštenom dnevnom unosu ima nisku genotoksičnost. Potencijal vodenog ekstrakta lista obične planike kao fitoterpeutika za kliničku primjenu je velik.- This thesis investigated the phytochemical characteristics, antimicrobial properties and biological effects of strawberry tree leaves. Total phenol, tannin, flavonoid and phenolic acid content was determined as well as polyphenolic profile using the UHPLC-MS/MS Orbitrap method. Arbutin and hydroquinone concentrations were measured by HPLC-UV/DAD, antioxidative properties by FRAP, TEAC, DPPH, MIC concentrations by a Twofolded Microdilution method and mutagenicity by Comet-test and CBMN test. Thirty-seven new phenolic compounds were detected. Leaves contained 0.3% of arbutin while hydroquinone was not detected. Methanol was shown to be a more effective solvent for the extraction of polyphenols. Methanolic extract showed better antioxidative properties and better antimicrobial effect on standard ATCC and clinical microorganism strains. Arbutin did not show antimicrobial activity, while its metabolite hydroquinone showed positive antimicrobial activity against the tested uropathogens. Water extract applied at an arbutin concentration corresponding to the maximum allowable daily intake showed low genotoxicity in vitro and in vivo. Strawberry tree water leaf extract has great potential as a phytotherapeutic in clinical application.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Serotoninski prijenosnik (5HT prijenosnik, 5HTT) predstavlja ciljnu molekulu djelovanja antidepresivnih lijekova iz skupine ...selektivnih inhibitora povratnog unosa serotonina (SSRI). Iako često korišteni, ovi lijekovi ostvaruju terapijski učinak samo kod manjeg broja (do 50 %) bolesnika, a razlozi za to nisu poznati. Nalaz povezanosti terapijskog odgovora s polimorfizmom gena za 5HTT uputio je na moguću ulogu konstitucijske serotoninske homeostaze u kliničkom odgovoru na SSRI. Primjenom originalnog životinjskog modela, Wistar-Zagreb 5HT štakor, čije sublinije imaju konstitucijski pojačanu (5HT-visoki) ili smanjenu (5HT-niski) aktivnost trombocitnog 5HTT, u ovom radu je istražen odnos između konstitucijske 5HT homeostaze i odgovora na tretman SSRI-om. Farmakološka aktivacija 5HT sustava izazvana je jednokratnom ili kroničnom primjenom SSRI-a fluoksetina, a cilj je bio usporediti sublinije s obzirom na učinke fluoksetina na (i) aktivnost 5HTT i razinu 5HT u mozgu i na periferiji, (ii) razinu mRNA za 5HTT i receptor 5HT1A u mozgu te (iii) odabrana ponašanja modulirana serotoninom. Jednokratni tretman fluoksetinom doveo je do inhibicije aktivnosti trombocitnog 5HTT, koja je bila jače izražena kod životinja iz 5HT-visoke sublinije, te do porasta razine plazmatskog 5HT, koji je bio veći kod životinja iz 5HT-niske sublinije. Kronična primjena lijeka dovela je do značajnog pada razine trombocitnog serotonina, koji je bio veći kod životinja iz 5HT-niske sublinije, te do pada plazmatskog serotonina, koji je bio veći kod životinja iz 5HT-visoke sublinije. Smanjenje ponašanja nalik na anksioznost, kao i porast istraživačke i lokomotorne aktivnosti nakon kroničnog tretmana fluoksetinom bilo je prisutno samo kod životinja iz 5HT-visoke sublinije, a praćeno je promjenama u mozgu koje su bile vidljive kao tendencija povećanja ekspresije gena za 5HT1A receptor u hipokampusu te ekspresije gena za 5HTT u regiji jezgara rafe. S druge strane, kod životinja iz 5HT-niske sublinije, kronična primjena fluoksetina dovela je do pada kortikalne ekspresije mRNA za 5HTT i receptor 5HT1A, te tendencije pada razine 5HT u moždanoj kori, dok učinci na ponašanje nisu bili značajni. Rezultati istraživanja pokazuju da je konstitucijska serotoninska homeostaza važan čimbenik odgovora na tretman fluoksetinom. Sublinije Wistar-Zagreb 5HT štakora mogu biti koristan model u istraživanju neurobiološke osnove različitog odgovora pojedinaca na terapiju antidepresivima, kao i za vrednovanje trombocita kao perifernog modela za predviđanje terapijskog odgovora.- Serotonin transporter (5HT transporter, 5HTT) represents the target molecule of selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) acting as antidepressant drugs. Although commonly used, these drugs produce a therapeutic effect only in a small number of patients (up to 50 %), and the reasons for that are not known. The association between therapeutic response and 5HTT gene polymorphism has pointed out to possible role of the constitutional serotonin homeostasis in clinical response to SSRI. Using the original animal model, Wistar-Zagreb 5HT rats, whose sublines have constitutional high (high-5HT) or low (low-5HT) of platelet 5HTT activity, we have investigated the relationship between constitutional 5HT homeostasis and responses to SSRI treatment. Following pharmacological activation of 5HT system, induced by single or repeated doses of SSRI fluoxetine, we have compared these sublines with respect to (i) the 5HTT activity and the 5HT levels in the brain and blood, (ii) the expression of 5HTT and 5HT1A receptor genes in the brain, and (iii) the selected behaviors modulated by serotonin. Acute treatment with fluoxetine led to inhibition of platelet 5HTT activity, which was more pronounced in animals from the high-5HT subline, and to increase of plasma 5HT level, which was higher in animals from the low-5HT subline. Chronic administration of the drug caused a significant decrease of platelet serotonin levels, which was higher in animals from the low-5HT subline, and a decrease of plasma 5HT levels, which was higher in animals from the high-5HT subline. The reduction of anxiety-like behavior, along with the increase of exploratory and locomotor activity after chronic treatment with fluoxetine was observed only in animals from the high-5HT subline, and was accompanied by the tendency towards increase of 5HT1A receptor gene expression in hippocampus and the tendency towards increased expression of 5HTT gene in raphe nuclei. On the other hand, in animals from the low-5HT subline, chronic application of fluoxetine led to decrease in 5HTT and 5HT1A receptor mRNA levels and tendency towards decrease in 5HT in the cerebral cortex. The obtained results show that constitutional serotonin homeostasis is an important factor in response to fluoxetine treatment. Furthermore, Wistar-Zagreb 5HT sublines may represent a useful model in studding the neurobiological basis of a different individual response to antidepressants, as well as in evaluating platelets as a peripheral model for predicting the therapeutic response.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Biološka aktivnost roda Centaurea pripisuje se spojevima iz skupine terpena i flavonoida čija su antioksidacijska, antibakterijska, ...citotoksična i slična ljekovita svojstva dokazana. Cilj rada je odrediti sadržaj i sastav fitokemikalija ekstrakata hrvatske endemične biljne vrste Centaurea ragusina L. sakupljene na prirodnom lokalitetu, uzgojene u uvjetima in vitro i aklimatizirane na vanjske uvjete kao i njihovu antioksidacijsku, antibakterijsku i citotoksičnu aktivnost. U svrhu razjašnjenja biološke aktivnosti proučavane su interakcije ekstrakata, frakcija i spojeva s polinukleotidima. U etanolno vodenim ekstraktma izmjeren je najviši sadržaj fenola, flavonoida i hidroksicimetnih kiselina. Etanolno vodeni i etanolno etanolni ekstrakti pokazuju značajnu antioksidacijsku aktivnost neovisno o podrijetlu biljaka. Ekstrakti listova priređeni u etanolu, većina ispitivanih frakcija kao i dva izolirana seskviterpenska laktona pokazali su značajnu antibakterijsku aktivnost na Staphylococcus aureus ATCC 25923. Svi vodeni vodeni ekstrakti pokazuju značajni stabilizacijski učinak na DNA i RNA. Gotovo svi testirani ekstrakti te frakcije CRE01_06-10 pokazuju značajnu citotoksičnu aktivnost na testiranim tumorskim staničnim linijama.- Biological activity of Centaurea genus is mainly attributed to compounds of the terpenoid and flavonoid type which showed antioxidant, antimicrobial, cytotoxic and other therapeutic properties. The goal of this work was to determine polyphenol content and composition of phytochemicals in Croatian endemic plant species Centaurea ragusina L. collected at natural habitats, cultivated in vitro and acclimated plants as well as to estimate their antioxidant, antibacterial and cytotoxic activity. Ethanolic/aqueous extracts showed the highest level of total phenols, flavonoids and hydroxycinnamic acid. Ethanolic/aqueous and ethanolic/ethanolic extracts showed significant antioxidant activity regardless of the plant origin. Crude ethanolic/ethanolic extract of leaves, almost all tested fractions and two isolated sesquiterpene lactones showed significant antibacterial activity against Staphylococcus aureus ATCC 25923. All aqueous/aqueous extracts showed significant stabilisation effects of DNA and RNA. Almost all tested extracts and fractions CRE01_06-10 exhibited significant inhibitory activities against all tested cancer cell lines.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
Provider: - Institution: University of Rijeka. Department of Biotechnology. - Data provided by Europeana Collections- Uvod i cilj
Nedostatak S-adenozilhomocistein hidrolaze (AHCY) je poremećaj ...uzrokovan mutacijama u genu ahcy čime je smanjena aktivnost proteina AHCY. AHCY ima ključnu ulogu u pravilnom odvijanju ciklusa aminokiseline metionina u stanici, stoga nedostatak njegove funkcije uzrokuje težak metabolički poremećaj. Kao jedini enzim koji hidrolizira SAH, snažni inhibitor staničnih metiltrasferaza, AHCY ima i indirektnu ulogu u održavanju metilacijskog statusa stanice. Klinička slika ovog potencijalno letalnog oboljenja je karakterizirana kombinacijom mišićnih, neuroloških i jetrenih poremećaja. Unatoč dokazanoj esencijalnosti AHCY, promjene u molekularnim mehanizmima stanice u stanju nedostatka AHCY su dosada nedovoljno istražene. Cilj ove doktorske disertacije je analiza i razumijevanje molekularnih i staničnih uloga AHCY s krajnjom svrhom probira potecijalnih biomarkera oboljenja.
Materijali i metode
U sklopu ove disertacije su rađene studije novootkrivene Y328D mutante potvrđene u pacijentici oboljeloj od nedostaka funkcije AHCY, a za dodatna istraživanja na raspolaganju su bili i primarni fibroblasti pacijentice. Zbog ograničenja u radu s primarnim fibroblastima, tijekom izrade doktorske disertacije su se pripremili, validirali i istraživali modelni stanični sustavi za što se koristila kombinacija metoda klasične biologije i različitih omiks i visokoprotočnih tehnika.
Rezultati
Po prvi puta je tijekom istraživanja AHCY korištena metoda kojom se na temelju fluorescencije dviju komplementiranih podjedinica proteina Venus s kojima su označeni proteini od interesa može pratiti njihova interakcija u ljudskim stanicama. Dokazano je da Y328D mutanta gubi sposobnost homodimerizacije, a metoda je također uspješno prilagođena na visokoprotočno skeniranje interaktora proteina AHCY. Nadalje, uočena je smanjena razina mutiranih AHCY mRNA i proteina u fibroblastima pacijenta i u stanicama sa stabilno eksprimiranim mutiranim AHCY. U istim stanicama je također mikroskopijom pokazano da mutacije uzrokuju povećanu ili smanjenu količinu proteina u jezgri stanica u odnosu na divlji tip. U stanicama hepatocelularnog karcinoma s utišanim AHCY smanjena je proliferacija i migracija te su aktivirani stanični putevi koji signaliziraju oštećenje DNA. Tijekom analize transkriptoma i proteoma fibroblasta pacijenta i stanica hepatocelularnog karcinoma s utišanim AHCY, uočena je moguća veza proteina AHCY s patologijom različitih neuroloških, jetrenih i mišićnih oboljenja, a predložena su i dva potencijalna biomarkera oboljenja.
Zaključci
Promjene razine AHCY mRNA i proteina, kao i lokalizacije AHCY u stanici koje su uočene u svih istraživanih mutanti proteina AHCY mogu biti odgovorne ili pridonositi patologiji kod oboljenja nedostatka AHCY. Prema predloženom mehanizmu AHCY ima utjecaj na oštećenje DNA i stanični ciklus. Dva potencijalna biomarkera su predložena s ciljem nastavka njihovog budućeg istraživanja u svrhu prognostike i dijagnostike oboljenja nedostatka AHCY.- Introduction and aims
S-adenosylhomocysteine hydrolase (AHCY) deficiency is a disorder caused by lowered enzymatic activity of AHCY protein due to the mutations in ahcy gene. AHCY has a key role in proper functioning of the methionine cycle in cell, therefore the lack of AHCY function causes severe metabolic disorder. Since AHCY is a single enzyme that hydrolyses SAH, a strong inhibitor of cellular metiltransferazes, it has a central role in maintaining the methylation status of the cell. Clinical presentation of this potentially lethal disorder includes a combination of muscular, neurological and hepatic disorders. Despite the essential activity of AHCY, changes in molecular and cellular mechanisms in the state of AHCY deficiency have so far been poorly investigated. The aim of this doctoral thesis is the analysis and understanding of molecular and cellular roles of AHCY and prediction of potential disease biomarkers.
Materials and methods/methodological approach
In this thesis, we performed studies of newly discovered Y328D mutant confirmed in the recent case of AHCY deficiency. Patient fibroblasts were obtained from the mentioned case, however, due to the limitations in experimental work with primary fibroblasts, we prepared, validated and investigated model cellular systems by combining methods ranging from classical biology approach to different omics and high throughput techniques.
Results
A method that enables visualization of protein interactions in human cells based on fluorescence of two complemented parts of Venus protein fused to proteins of interest was used for the first time to research AHCY protein. It is proven that Y328D mutant lacks the ability to form homodimes in human cells, and the method has been also successfully adapted to high throughput screening of AHCY protein interactors. Further, we report lower levels of mutant AHCY mRNA and protein in patient fibroblasts as well as cells that stably express AHCY mutant proteins. Microscopy revealed higher or lower amounts of mutant AHCY protein in cell nuclei in mentioned cells when compared to wild type. In hepatocellular carcinoma cells with a silenced AHCY expression we report lowered proliferation and migration as well as activation of DNA damage induced cellular pathways. While analyzing the transcriptome and proteome of patient fibroblasts and hepatocellular carcinoma cells with silenced AHCY expression, potential implications of AHCY protein in the pathology of various neurological, hepatic and muscular diseases are recognized, and two potential disease biomarkers are suggested.
Conclusions
Changes in levels of mutant AHCY mRNA and protein, as well as changed cellular localization of mutant AHCY could be responsible for or contribute to the pathology of the AHCY deficiency. As proposed by our mechanism, AHCY can imapact cellular DNA damage and cell cycle. Two biomarkers are suggested for further research and usage in prognostics and diagnostics of AHCY deficiency.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Koštani morfogenetski protein 6 (BMP6) je ključni regulator hepcidina, proteina koji sudjeluje u održavanju homeostaze željeza. ...Istražili smo utjecaj željeza na BMP6 u tkivima i plazmi, te zašto ostale BMP molekule nisu u mogućnosti spriječiti hematokromatozu u Bmp6 -/- miševa. Kod miševa divljeg tipa, 4 sata nakon tretmana željezom dolazi do povećanja izražaja gena za BMP6 i hepcidin u jetri, dok je izražaj ostalih BMP molekula nepromijenjen. BMP6 je detektiran u cirkulaciji miševa i štakora, te je pružen prvi dokaz utjecaja željeza na povećanje razine BMP6 u plazmi. Naprotiv, u Bmp6 -/- miševa, tretman željezom dovodi do zakašnjele i slabije aktivacije Smad signalnog puta i sinteze hepcidina u jetri nakon 24 sata, zajedno s povećanim izražajem gena za BMP2, 4, 5 i 9 u duodenumu i BMP5 i BMP7 u jetri. Povećana sinteza BMP7 u jetri potencijalno doprinosi indukciji izražaja gena za hepcidin, što je dodatno podržano BMP7 terapijom koja dovodi do djelotvorne sinteze hepcidina i normalizacije serumskog željeza. No, sinteza BMP7 nije povezana s metabolizmom željeza, već s uzročnim oštećenjima jetre gdje BMP7 predstavlja mogući oblik obrambenog mehanizma od viška nakupljenog željeza. Rezultati pokazuju da akutna doza željeza aktivira kompenzacijske mehanizme s različitim BMP molekulama, ali nedovoljnog intenziteta da bi se spriječila hematokromatoza u Bmp6 -/- miševa. Učinkovita terapija s BMP7 sugerira da je BMP6 bitan, ali ne isključiv regulator homeostaze željeza in vivo.- Bone morphogenetic protein 6 (BMP6) is a key regulator of hepcidin expression, a key iron regulatory hormone. We investigated the effect of iron on Bmp6 expression in tissues and plasma, and why other BMPs could not prevent hemochromatosis in Bmp6 -/- mice. In WT mice, 4 hours following iron challenge liver Bmp6 and Hamp expression were increased, while expression of other Bmps was not affected. In parallel, we provided the first evidence that iron increased the circulating BMP6 level. On the contrary, in Bmp6 -/- mice, iron challenge lead to a 24 hours delayed and blunted activation of liver Smad signaling and hepcidin expression, that was accompanied by an increased expression of Bmp2, 4, 5 and 9 in the duodenum and Bmp5 and Bmp7 in the liver. High liver Bmp7 expression potentially contributed to the late hepcidin response, which was further supported by BMP7 therapy resulting in an effective hepcidin expression and normalization of serum iron. However, BMP7 synthesis was not associated with iron metabolism, but the causal hepatic injuries where BMP7 represented a form of defense mechanism to the excessive iron accumulation. Our data indicate that iron activated BMP compensatory mechanisms that were not sufficient for preventing hemochromatosis in Bmp6 -/- mice. However, the effective BMP7 therapy suggested that BMP6 is an essential but not exclusive in vivo regulator of iron homeostasis.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Tekućinska kromatografija visokog učinka (high performance liquid chromatography, HPLC) je jedna od najznačajnijih i najuspješnijih ...metoda koje se primjenjuju za razdvajanje i pročišćavanje raznih molekula. Većina kromatografskih nosača je dizajnirana za razdvajanje proteina te je primjena ove metode u istraživanju makromolekula i makromolekularnih kompleksa otežana. Građa klasičnih nosača se temelji na poroznim kuglicama, a razdvajanje na difuziji. Zbog neadekvatne veličine pora i sporog razdvajanja, primjena ove metode u istraživanju biomolekula nije osobito uspješna. Monolitni su kromatografski nosači napravljeni iz jednog dijela te imaju visoki stupanj poroznosti i veličinu kanala koja je adekvatna za većinu makromolekularnih kompleksa (prosječni promjer je 1,5 μm). Karakterizira ih laminaran protok tekuće faze i interakcije s ligandima koje se temelje na konvekciji, a ne na difuziji što ujedno omogućava brzi prijenos mase i znatno skraćuje vrijeme potrebo za odvijanje eksperimenta (Barut et al., 2008). Viroidi su male jednolančane kružne, i u većini istraživanih slučajeva, fitopatogene RNA-molekule koje ne posjeduju gene za proteine već sve svoje funkcije provode formiranjem raznih sekundarnih/tercijarnih struktura. Te iste strukture omogućuju visoku stabilnost viroida u biljci i izvan nje te su temelj njihove visoke infektivnosti. Rasprostranjivanje virusa vodenim putovima je dobro dokumentirano (Mehle i Ravnikar, 2012) dok prijenos viroida vodom do nedavno nije razmatran. Viroid vretenaste ušiljenosti gomolja krumpira (Potato spindle tuber viroid, PSTVd) može preživjeti i do pet tjedana u vodenom okruženju te zadržati svoju infektivnost (Mehle et al., 2011). Najpreciznija metoda njegove detekcije je kvantitativna lančana reakcija polimerazom uz prethodnu reverznu transkripciju (reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR). Zbog tipičnih stohastičkih efekata koji utječu na qPCR, ova metoda ne može sa sigurnošću detektirati patogen koji je prisutan u izrazito niskim koncentracijama (Morrison et al., 1998). Takva situacija je vrlo vjerojatna u vodenim uzorcima zbog učinka razrjeđenja te je prethodni korak koncentriranja uzorka nužan. Jedan od ciljeva ove doktorske disertacije je optimizacija postupka koncentriranja viroida iz vodenih uzoraka. Analizirano je kromatografsko ponašanje PSTVd-a i biljnih mRNA dvjema adsorbcijskim metodama: ionskom izmjenom i kromatografijom hidroforbnih interakcija. Najbolji prinos ostvaren je pomoću kromatografije hidrofobnih interakcija te je ta metoda korištena za koncentriranje viroida iz vodenih uzoraka. Prinos je analiziran kvantitativnom PCR-metodom. Virus mozaika postrne repe (Turnip yellow mosaic virus, TYMV) i virus grmolike kržljavosti rajčice (Tomato bushy stunt virus, TBSV) pripadaju malim biljnim sferičnim virusima (promjer ~30 nm). Oni su modeli koji su poslužili za razumijevanje ikozaedarske strukture te niza procesa koji se odvijaju tijekom virusne replikacije i tijekom raznih staničnih procesa (Dreher, 2004; Morgan, 2003; Yamamura i Scholthof, 2005). Iako navedeni virusi nemaju jak ekonomski značaj (nisu izrazito patogeni), i danas su atraktivni zbog potencijalne primjene u biomedicini i nanotehnologiji (virus based vectors i virus-like particles). U ovoj doktorskoj disertaciji TYMV i TBSV su prvi put kromatografski izdvojeni iz biljnog homogenata. Korištena je ionsko-izmjenjivača kromatografija jer navedeni virusi posjeduju različiti ukupni naboj pri određenom pH. Sadržaj frakcija je analiziran pomoću kvantitativne PCR-metode, SDS-poliakrilamidne gel-elektroforeze proteina i elektronske mikroskopije. Infektivnost virusnih čestica nakon kromatografije je provjerena inokulacijom zdravih biljaka sadržajem virusnih frakcija te detekcijom virus (RT-qPCR) u tim istim biljkama. Metoda optimizirana za TYMV je primijenjena u analizi izolata koji pripadaju dvjema skupinama sojeva: TYMV-1 i TYMV-2 (Symons et al., 1963). Pripadnici skupine TYMV-2 (TYMV-N i TYMV-D) imaju kraće retencijsko vrijeme nego pripadnici skupine TYMV-1 (TYMV-E i TYMV-Y). Istodobno je uočena mogućnost da se u slučaju izolata TYMV-D radi o miješanoj infekciji dvama sojevima gdje, ovisno o vremenskom periodu, do izražaja dolazi jedan od njih. Nadalje, u ovoj disertaciji je istražena mogućnost primjene monolitne kromatografije u razdvajanju individualnih virusa iz smjesnog uzorka. Pomoću CIM DEAE kolone i radnih pufera sa pH 6, uspješno su razdvojena četiri biljna virusa: tri ikozaedarska (TBSV, TYMV-N i TYMV-E) i jedan štapićasti (TMV). Virus mozaika duhana (Tobacco mosaic virus, TMV) pripada štapićastim virusima (helikalna simetrija) i on je kamen temeljac virologije (Harrison i Wilson, 1999). Primjenom uvjeta optimiziranih za tobamoviruse (CIM QA i pH 5,5) razdvajanje četiriju virusa je bilo manje uspješno te se može zaključiti da svaki virus zahtjeva posebnu optimizaciju što je prethodno dokumentirano u literaturi (Adriaenssens et al., 2012). Adenovirusi serotipa 5 (Ad5) su jedni od najraširenijih vektora u genskoj terapiji (Wiley Database, 2013). Analizirano je kromatografsko ponašanje više genetički modificiranih Ad5- vektora. Frakcije su analizirane SDS-poliakrilamidnom elektroforezom proteina i testom blue forming units. Promjene u heksonskom proteinu koje su dovele do gubitka naboja su rezultirale skraćenim retencijskim vremenom, dok promjene u dužini vlakna nisu imale utjecaj na retencijsko vrijeme. Zamjena vlakna jednog serotipa drugim (Ad5-vlakno je zamijenjeno Ad3-vlaknom) je dovelo do povećanja ukupnog naboja viriona te do produženja retencijskog vremena. Rezultati dobiveni u sklopu ove disertacije pridonose proširenju primjene monolitne kromatografije i metodološki unaprjeđuju istraživanje virusa i viroida. Monolitna kromatografija je brza, praktična i učinkovita metoda za razdvajanje različitih virusnih čestica i te koncentriranje viroidne RNA.- By using monolithic supports it is possible to apply chromatography in purification, separation, and concentration of various large molecules and macromolecular complexes. In this thesis, chromatographic behaviour of RNA molecules was analysed using ion-exchange and hydrophobic interaction modes. A concentrating protocol for Potato spindle tuber viroid, which improved the sensitivity of its reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) detection, was developed. Turnip yellow mosaic virus (TYMV) and Tomato bushy stunt virus were separated from plant homogenate with monolithic supports for the first time. Furthermore, several plant viruses were separated from an artificially mixed sample using ion-exchange chromatography. High recoveries were obtained and virus infectivity was maintained. Electron microscopy confirmed the integrity of the plant virus particles after chromatography. The method was also used to differentiate members of two groups of TYMV isolates representing different virus strains. Chromatographic behaviour of several structurally modified Adenovirus 5-based vectors was considered. The influence of changes in the hexon protein and in the fibre on retention time was observed. Results obtained within this thesis represent methodological advancement in the research of viroids and viruses, proving that monolith chromatography is a fast, practical and efficient method for separation of different virus particles and concentrating viroid RNA.- All metadata published by Europeana are available free of restriction under the Creative Commons CC0 1.0 Universal Public Domain Dedication. However, Europeana requests that you actively acknowledge and give attribution to all metadata sources including Europeana
