Fitoplazme ('Candidatus Phytoplasma') su nekultivabilne bakterije bez stanične stjenke izrazito reduciranih genoma koje parazitiraju u floemu biljaka i stanicama kukaca. Gospodarski značajne bolesti ...žutica vinove loze (grapevine yellows; GY) uzrokuju fitoplazme ribosomskih skupina 16SrV-C i V-D (flavescence dorée; FD) i 16SrXII-A (stolbur; bois noir; BN, ‘Candidatus Phytoplasma solani’). Iako uzrokuju gotovo jednake simptome, ove se fitoplazme razlikuju u epidemiologiji te je njihova precizna identifikacija neophodna. Filogenija fitoplazmi temelji se na polimorfizmu evolucijski očuvane genske regije za 16S rRNA, čestom bakterijskom filogenetskom markeru (Gundersen et al., 1994; IRPCM, 2004). Međutim, molekularne analize genske regije 16S rDNA nisu dovoljne za utvrđivanje varijabilnosti među izolatima fitoplazmi unutar iste skupine, te se uz tu regiju analiziraju i dodatni molekularni fitoplazmatski markeri. Identifikacija i karakterizacija fitoplazmi ima značajnu ulogu u epidemiologiji i monitoringu fitoplazmoza. Preciznija klasifikacija fitoplazmi ribosomskih skupina 16SrXII-A i 16SrV vrlo je važna u određivanju točnog uzroka i porijekla novih pojava ekonomskih važnih fitoplazmoza te predviđanju smjera njihovog širenja. Metoda multigenske analize (multilocus sequence typing; MLST) temelji se na istraživanju varijabilnosti evolucijski različito konzerviranih gena. Pri istraživanju fitoplazmi multigenskom metodom ciljani molekularni markeri su najčešće konstitutivni (housekeeping) geni, ali i varijabilni geni specifični za određenu vrstu kao što su geni koji kodiraju za membranske proteine. MLST predstavlja reproducibilan i mjerljiv sustav prikladan za epidemiološke studije jer za karakterizaciju istraživanih izolata pojedinih patogena koristi nukleotidne sljedove koji su lako usporedivi s nukleotidnim sljedovima drugih izolata. Cilj ovog istraživanja bio je provesti multigensku tipizaciju izolata fitoplazmi ribosomske skupine 16SrXII-A analizom gena tuf, vmp1, secY i stamp te izolata fitoplazmi ribosomske skupine 16SrV analizom gena map, secY, uvrB-degV i vmpA i izoliranih iz zaraženih trsova vinove loze (Vitis vinifera L.), kukaca-vektora i korovnih biljaka s područja Hrvatske te pritom istražiti varijabilnost spomenutih izolata. Premda prethodna istraživanja upućuju na značajnu gensku varijabilnost fitoplazmi unutar skupine 16SrXII-A (Langer i Maixner, 2004; Šeruga Musić et al., 2008; Cimerman et al., 2009; Fialova et al., 2009; Aryan et al., 2014) iznenađujuć je broj genotipova utvrđen analizom izolata fitoplazme BN (stolbur) u Hrvatskoj u okviru ove disertacije. Iako je variabilnost BN fitoplazme već bila predmet ranijih istraživanja (Šeruga Musić et al., 2011), ovako detaljna i opsežna tipizacija izolata fitoplazme BN provedena je po prvi put. Temeljem multigenske analize zabilježeno je 3 tuf, 5 secY, 7 vmp1 te čak 10 stamp filogenetskih skupina. Njihovom kombinacijom u pojedinim izolatima utvrđeno je čak sedamnaest različitih genotipova od čega su tri genotipa bila zastupljena većim brojem uzoraka. Najzastupljeniji genotip bio je S6-ST6-V18-tuf-b (24%), zatim S1-ST9-V4-tuf-b (15%) te S39-S46-V3-tuf-a (12%) koji zajedno obuhvaćaju više od polovice analiziranih izolata. Prisutnost drugih genotipova zabilježena je u znatno manjem broju izolata. Geni vmp1 i stamp ali i gen secY pokazali su se znatno varijabilnijim i informativnijim markerima u odnosu na gen tuf omogućivši preciznije razlučivanje između blisko povezanih izolata fitoplazme BN. Uspoređujući rezultate dobivene analizom pojedinih gena s rezultatima istraživanja drugih zemalja može se utvrditi epidemiološki značaj pojedinih tipova izolata. Tako prisutnost oba tuf tipa, tuf-a i tuf-b ukazuje na uključenost obe korovne biljke Urtica dioica L. i Convolvulus arvensis L. u BN epidemiologiju u Hrvatskoj. Analiza secY gena potvrdila je genotip S6 kao jedan od najučestalijih u Europi (Foissac et al., 2013b). Od dva prevladavajuća vmp1 profila u Hrvatskoj, V4, zabilježen je i kao prevladavajuć u Republici Makedoniji (Kostadinovska et al., 2014) te kao široko rasprostranjen genotip u Euro-Mediteranskom području (Foissac et al., 2013). Također je utvrđena podudarnost u povezanosti V3 i tuf a genotipa (Foissac et al., 2013) kao i u Španjolskoj (Sabaté et al., 2014). Uz to, pronalazak V2-TA profila, prvotno potvrđen u kukcu Reptalus panzeri i vinovoj lozi u Srbiji (Cvrković et al., 2014) a zatim i u Republici Makedoniji (Kostadinovska et al., 2014) sugerira nove mogućnosti rasprostranjenja BN fitoplazme. U pogledu analize gena stamp, izolati BN fitoplazme iz Hrvatske mogu se svrstati u dva od četiri velika genetska klastera – klaster IA u koje se ubrajaju i zemlje zapadne Europe: Španjolska, Italija i Francuska te klaster II u koje se ubraja središnja Europa i Balkan: Njemačka, Bugarska, Mađarska i Republika Makedonija. U sklopu ove disertacije po prvi puta je napravljena detaljna karakterizacija fitoplazme FD utvrđene u uzorcima vinove loze te u vektoru Scaphoideus titanus Ball. Provedene filogenetske analize nukleotidnih sljedova gena map fitoplazme FD pokazale su grupiranje u dvije FD skupine/klastera. Analize nukleotidnih sljedova gena uvrB-degV gena nisu u potpunosti pokazale pokazale podudarnost s rezultatima analize gena map i secY. Posebno interesantnom pokazala se analiza varijabilnog gena vmpA za čije istraživanje su u sklopu ove disertacije dizajnirane nove početnice. Sveukupno su utvrđena 2 map, 4 uvrB-degV i 5 secY genotipa. Filogenetska analiza vmpA gena pokazala je podjelu u 3 klastera demonstrirajući tako značajnu ulogu vmpA gena u istraživanju epidemiologije FD fitoplazme. Budući da se svaki map-FD klaster/skupina razlikuje po geografskoj rasprostranjenosti (map-FD2-Francuska i Italija; map-FD3 Italija, istočno europska regija), prisutnost map-FD2 i map-FD3 klastera u Hrvatskoj lakše je tumačiti u svjetlu podataka obivenih iz susjednih zemalja - Srbije gdje je utvrđen map-FD3 klaster (Kuzmanović et al., 2008) i Slovenije gdje je potvrđena prisutnost oba klastera (Mehle et al., 2011) koji sugeriraju moguće puteve unosa. Nalazi fitoplazme FD i BN, redom u vektorima S. titanus i Hyalesthes obsoletus Signoret. potvrdili su njihovu ulogu u rasprostranjivanju i prenošenju fitoplazmi u Hrvatskoj te dali uvid u kompleksnu ekologiju patosistema fitoplazma – vektor – biljka. U sklopu ove disertacije potvrđeni su prijašnji rezultati (Šeruga et al., 2000; Šeruga Musić et al., 2009) široke rasprostranjenosti fitoplazme BN u Hrvatskoj. Prisutnost fitoplazme FD u vinovoj lozi, prvi put utvrđena 2009. godine (Šeruga Musić et al., 2011) samo na jednoj lokaciji na području središnje Hrvatske, tijekom ovog istraživanja potvrđena je na nekoliko novih lokaliteta geografski udaljenih vinskih regija. U četiri godine istraživanja, uočena je tendencija širenja GY-bolesti a osobito pojavljivanja novih žarišta fitoplazme FD. Na pojedinim lokalitetima utvrđena je prisutnost obje fitoplazme, no pri analizama pojedinih izolata nije utvrđena zaraza iste biljke s oba uzročnika. Rezultati dobiveni u sklopu ove disertacije pružili su dublji uvid u raznolikost i rasprostranjenost, te epidemiološki značaj pojedinih tipova izolata fitoplazmi vinove loze prisutnih na teritoriju Republike Hrvatske. Prikupljeni molekularni podaci omogućili su usporedbu podataka sa studijama drugih zemalja na tom području i ukazali na mogući put unosa patogena u Hrvatsku što je osobito bitno za karantensku fitoplazmu FD. Dokazana je vrijednost multigenske analize kao učinkovite, ponovljive i pouzdane metode u diferencijaciji između srodnih sojeva fitoplazmi.
Phytoplasmas ('Candidatus Phytoplasma') are non-cultivable wall-less bacteria found in plant phloem and insect vector cells. Economically important Grapevine yellows (GY) diseases in Croatia are caused by phytoplasmas belonging to the ribosomal groups 16SrV-C and -D (flavescence dorée; FD) and 16SrXII-A (stolbur; bois noir; BN, ‘Candidatus Phytoplasma solani’) which cause similar symptoms but differ considerably in epidemiology. The aim of this thesis was to analyse BN and FD phytoplasma genetic variability through multilocus sequence typing (MLST) of molecular markers differing in conservation and evolution from infected grapevine (Vitis vinifera L.), wild plants and insect vectors collected in Croatia. MLST analysis of BN phytoplasma isolates revealed the presence of 17 different genotypes encompasing three tuf, five secY, seven vmp1 and ten stamp genotypes. The analysis of FD phytoplasma isolates demonstrated the existence of two map, four uvrB-degV and five secY genotypes. The vmpA gene analysis discriminated three clusters. This is the first multigene genotyping performed on FD phytoplasma isolates and first extensive research on BN phytoplasma isolates in Croatia. Results obtained through this comprehensive four-year research revealed considerable genetic diversity of epidemiological relevance and the geographical distribution of differentiated grapevine phytoplasmas strains. Furthermore, possible paths of pathogen introduction in Croatia are indicated.
ABC transporteri sudjeluju u očuvanju crijevne barijere, te utječu na biodostupnost lijekova. Promjene njihove ekspresije mogu doprinijeti narušavanju barijere i razvoju upale, kao što je slučaj u ...upalnim bolestima crijeva. Njihova uloga u patogenezi upalnih bolesti crijeva nije u potpunosti razjašnjena. U ovom istraživanju odredili smo ekspresiju triju transportera: MDR1, MRP1 i BCRP, kod odraslih i djece oboljele od Crohnove bolesti (odrasli; n=25, djeca; n=26) i ulceroznog kolitisa (odrasli; n=27, djeca; n=20). Paralelno smo odredili i ekspresiju proupalnih citokina interferona (IFN)-γ, interleukina (IL)-2, IL-6, IL-1β i IL-17A, kao i njihove negativne regulatore, SOCS1 i SOCS3. Ispitanici su podijeljeni u četiri grupe: neliječeni bolesnici dijagnosticirani de novo, grupa bolesnika pod terapijom, te grupa u remisiji odnosno grupa zdrave kontrole (odrasli; n=10, djeca; n=15). Ovo istraživanje pokazuje izmijenjene ekspresije transportera koji koreliraju s povišenim ekspresijama citokina u oboljelih ispitanika. Nadalje, povišena ekspresija proupalnih citokina, popraćena povišenim ekspresijama njihovih negativnih regulatora, potvrđuju upalni proces kao dominantni patološki mehanizam u upalnim bolestima crijeva. Dakle, promjene ekspresija ABC transportera mogle bi imati funkcionalnu važnost u progresiji bolesti i liječenju.
Efflux transporters are crucial for the maintenance of gut homeostasis and influence drug bioavailability. Changes in their expression can disrupt the barrier which consequently results with inflammatory response, as observed in inflammatory bowel diseases (IBD). Their exact role in IBD pathogenesis is inconclusive. We have measured the expression of transporeters MDR1, MRP1 and BCRP in pediatric and adult patients with Crohn's disease (adults; n=25, pediatric; n=26) and ulcerative colitis (adults; n=27, pediatric; n=20). In paralell, we have assessed the expression of inflammatory cytokines IFN-γ , IL-2, IL-6, IL-1β and IL-17A, as well as their negative regulators, SOCS1 and SOCS3. Subjects were grouped as: newly diagnosed/untreated, active disease/treated, remission and controls (adults; n=10, pediatric; n=15). We showed that altered expression of efflux transporters correlated with cytokine expressions in IBD patients compared to controls. Furthermore, high cytokine expression, followed by high expression of their matched negative regulators, confirmed inflammatory process as the dominant pathological mechanism in IBD. In conclusion, alterations in ABC transporter expression could have functional importance in disease progression and treatment.
Neuropeptid Y (NPY) izražavaju stanice iz loze osteoblasta. In vitro studije su pokazale da NPY ima negativan učinak na diferencijaciju osteoblasta. Vođeni pretpostavkom da NPY izražen u stanicama ...loze zrelih osteoblasta može kontrolirati diferencijaciju mezenhimskih progenitorskih stanica istražili smo in vivo ulogu neuropeptida Y kao regulatora osteogeneze. U tu svrhu uzgojili smo transgeničnog miša (Col2.3NPY-ires GFPtopaz). Lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu (RT-qPCR) i NPY EIA analiza pokazali su pojačani izražaj NPY-a u transgeničnim miševima. Col2.3NPY miševi imali su 25% smanjen udio trabekularne kosti i 7-10% tanje trabekule. Analiza genske ekspresije nije pokazala nikakve razlike u ekspresiji OC, BSP i DMP-1 kod transgeničnih životinja. Col2.3NPY mCOB kulture imale su 6 puta manju površinu mineralizacije te smanjeni izražaj markera osteogeneze. Ovaj mišji model pokazao je da lokalno izražen NPY ima važnu ulogu u regulaciji koštane mase te regulira promjene u koštanoj masi. Svi ovi rezultati pokazali su da periferni signalni put NPY-a ima bitnu ulogu u koštanoj pregradnji.
Neuropeptide Y is expressed by osteoblast lineage cells and when administered in vitro can inhibit osteoblast lineage differentiation. We hypothesize that NPY, generated by mature osteoblast lineage cells, can control and modulate differentiation of osteoprogenitor cells. In this study we have evaluated the effects of bone-specific overexpression by generating Col2.3NPY-ires GFPtopaz transgenic mice. RT-qPCR and NPY EIA analysis showed increased expression of NPY in transgenic mice. Col2.3NPY mice had 25% lower trabecular volume and 7-10% lower trabecular thickness. Gene expression analysis in Col2.3NPY mice did not show any changes in expression levels of OC, BSP and DMP-1. Terminal osteoblast differentiation was impaired in Col2.3NPY mCOB cultures as indicated by a 6-fold decrease in mineralized area and decreased expression of all osteogenic markers. Our model has shown that locally expressed NPY plays an important role in regulation of bone mass. All these findings suggest that peripheral mechanism of the NPY signaling is important in bone remodeling.
Cilj istraživanja bio je utvrditi povezanost između ekspresije čimbenika stanične smrti – Fas, FasL, perforina i HSP70 i bioloških karakteristika neuroblastoma. Uključena su sva djeca s dijagnozom ...neuroblastoma operirana na KBC Zagreb u razdoblju od 1994. do 2013. godine, a kriterije je zadovoljilo 42 ispitanika. Na parafinskim blokovima izuzetim prije početka kemoterapije imunohistokemijskim bojanjem određen je izražaj Fas i FasL molekule na stanicama neuroblastoma, broj citotoksičnih T limfocita u okolini stanica neuroblastoma, izražaj perforina na citotoksičnim T limfocitima te izražaj HSP70 na stanicama neuroblastoma. Utvrđeno je da je Fas smanjeno izražen na metastatskim stadijima tumora pa se može pretpostaviti da tumor smanjenjem ekspresije Fas-a na svojoj površini može izbjeći lokalni odgovor imunološkog sustava i tako metastazirati. Također je utvrđena povezanost ekspresije HSP70 i stadija neuroblastoma. Viši stadiji imaju smanjenu ekspresiju što je u suprotnosti s većinom tumora koji su do sada istraživani, no s druge strane se slaže s istraživanjima na nefroblastomu, drugom najčešćem solidnom tumoru dječje dobi. Najvjerojatnije objašnjenje, prema dosadašnjim istraživanjima, je da kod tumora dječje dobi sudjelovanje HSP70 u inhibiciji apoptoze nije toliko značajno kao sudjelovanje u diferencijaciji tumora te da njegova pojačana ekspresija u neuroblastoma dovodi do sazrijevanja tumora.
The aim of this study was to investigate the correlation between the expression of cell death factors - Fas, FasL, perforin and HSP70 and biological characteristics of neuroblastoma. All children diagnosed with neuroblastoma operated at KBC Zagreb in the period since 1994. to 2013. were included and 42 of them met our criteria. On paraffin blocks excluded before the start of chemotherapy through immunohistochemical staining the expression of Fas and FasL molecules on neuroblastoma cells, the number and expression of perforin on cytotoxic T lymphocytes in the vicinity of neuroblastoma cells and expression of HSP70 in neuroblastoma cells was analyzed. Reduced Fas expression was found in metastatic tumor stages so it can be assumed that by lowering expression of Fas on its surface, tumor can avoid the local immune response and thus metastasize. The connection of HSP70 expression and stage neuroblastoma is also found. Higher stages have decreased expression of which is in contrast with the majority of tumors that have been studied, but on the other hand agrees with research on nephroblastoma, the second most common solid tumor in children. The most likely explanation for that, according to available data and considering pediatric tumors, is that the role of HSP70 in inhibition of apoptosis is not as important as participation in the differentiation of the tumor and its overexpression in neuroblastoma leads to the maturation of the tumor.
Istraživanjem je analizirana pojava peritumorskih pukotina u duktalnom invazivnom karcinomu dojke, ekspresija matriks metaloproteinaze-2 i p63 u tumorskim stanicama te povezanost pojave peritumorskih ...pukotina s ekspresijom matriks metaloproteinaze-2 i p63. Također je analizirana korelacija pojave peritumorskih pukotina te ekspresije matriks-mateloproteinaze-2 i p63 s ostalim obilježjima tumora - uključujući dob bolesnica, histološki gradus, veličinu tumora, status pazušnih limfnih čvorova, TNM klasifikaciju, stadij bolesti, ekspresiju estrogenskih i progesteronskih receptora te ekspresiju proteina Her2/neu. Rezultati istraživanja pokazuju da se peritumorske pukotine statistički značajno češće pojavljuju kod starijih bolesnica (p=0,010) i u većim tumorima (p=0,018). Nije nađena statistički značajna povezanost ekspresije matriks metaloproteinaze-2 s pojavom peritumorskih pukotina niti u odnosu na ostala promatrana obilježja. Pozitivna ekspresija p63 je nađena u samo jednom karcinomu, histološkog gradusa III. Pozitivna ekspresija p63 u mioepitelnim stanicama okolnog zdravog tkiva dojke, te izostanak imunoreaktivnosti u karcinomima s peritumorskim pukotinama, upućuje na povezanost pojave peritumorskih pukotina s gubitkom mioepitelnih stanica.
In this study we analyzed the presence and correlation of peritumoral retraction clefting and the expression of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and p63 in invasive ductal breast carcinoma. The occurrence of peritumoral clefting and expression of MMP-2 and p63 was also correlated to patient age, tumor size and histological grade, axillary lymph node status, TNM stage, stage of the disease and the expression of Her2/neu, estrogen and progesterone receptors. The results show a statistically significant higher occurrence of peritumoral clefting in older patients (p=0,010) and larger tumors (p=0,018). The expression of MMP-2 did not show statistically significant correlation to peritumoral clefting nor to other parameters. p63 expression was found only in one grade III carcinoma. p63 expression in the myoepithelial cells of the surrounding normal breast tissue and the lack in carcinomas showing peritumoral clefting, indicates the correlation between the loss of myoepitelial cells and the occurrence of peritumoral retraction clefting.
Serotonin (5HT) regulira razvoj vlastitih neurona i ciljnih tkiva tijekom neurogeneze pa odstupanje od optimalnih koncentracija 5HT tijekom razvoja mozga može dovesti do strukturnih i funkcionalnih ...anomalija. U ovom smo istraživanju kroničnom perinatalnom primjenom neposrednog prekursora sinteze 5HT, 5-hidroksitriptofana (5HTP, 25mg/kg), ili inhibitora razgradnje 5HT, tranilcipromina (TCP, 2mg/kg) povisili razinu 5HT u štakora s ciljem istraživanja posljedica po homeostazu 5HT u odraslom mozgu. Tijekom primjene 5HTP je značajno povisio razinu 5HT samo u perifernom odjeljku (hiperserotoninemija), a TCP i u perifernom i u središnjem odjeljku. Obje primjene uzrokovale su (dugo)trajne posljedice po funkciju središnjeg 5HT-odjeljka, koje su se očitovale kroz promjene u razini i metabolizmu serotonina, ekspresiji 5HT-regulirajućih gena te ponašanja vezanog uz serotonin. Činjenica da su razvojni poremećaji u metabolizmu serotonina (dugo)trajno narušili funkciju središnjeg 5HT-odjeljka upućuje na gene koji reguliraju metabolizam 5HT kao na moguće kandidate u istraživanjima poremećaja ponašanja vezanima uz 5HT sustav. Posljedice dviju primjena bile su analogne, ali su odražavale efekt doze: središnja homeostaza 5HT bila je diskretno narušena u životinja s razvojnim promjenama samo u perifernoj 5HT-homeostazi (5HTP), a opsežno u životinja s razvojnim promjenama i u središnjoj i u perifernoj 5HThomeostazi (TCP). To upućuje na zaključak da je za ozbiljno narušavanje funkcije 5HT, kakvo je opaženo u psihijatrijskim bolestima, nužna razvojna neuravnoteženost u središnjem 5HT-odjeljku i govori u prilog teoriji o hiperserotoninemiji kao o biljegu, a ne uzročniku promjena u središnjoj homeostazi serotonina.
Serotonin (5HT) regulira razvoj vlastitih neurona i ciljnih tkiva tijekom neurogeneze pa odstupanje od optimalnih koncentracija 5HT tijekom razvoja mozga može dovesti do strukturnih i funkcionalnih anomalija. U ovom smo istraživanju kroničnom perinatalnom primjenom neposrednog prekursora sinteze 5HT, 5-hidroksitriptofana (5HTP, 25mg/kg), ili inhibitora razgradnje 5HT, tranilcipromina (TCP, 2mg/kg) povisili razinu 5HT u štakora s ciljem istraživanja posljedica po homeostazu 5HT u odraslom mozgu. Tijekom primjene 5HTP je značajno povisio razinu 5HT samo u perifernom odjeljku (hiperserotoninemija), a TCP i u perifernom i u središnjem odjeljku. Obje primjene uzrokovale su (dugo)trajne posljedice po funkciju središnjeg 5HT-odjeljka, koje su se očitovale kroz promjene u razini i metabolizmu serotonina, ekspresiji 5HT-regulirajućih gena te ponašanja vezanog uz serotonin. Činjenica da su razvojni poremećaji u metabolizmu serotonina (dugo)trajno narušili funkciju središnjeg 5HT-odjeljka upućuje na gene koji reguliraju metabolizam 5HT kao na moguće kandidate u istraživanjima poremećaja ponašanja vezanima uz 5HT sustav. Posljedice dviju primjena bile su analogne, ali su odražavale efekt doze: središnja homeostaza 5HT bila je diskretno narušena u životinja s razvojnim promjenama samo u perifernoj 5HT-homeostazi (5HTP), a opsežno u životinja s razvojnim promjenama i u središnjoj i u perifernoj 5HThomeostazi (TCP). To upućuje na zaključak da je za ozbiljno narušavanje funkcije 5HT, kakvo je opaženo u psihijatrijskim bolestima, nužna razvojna neuravnoteženost u središnjem 5HT-odjeljku i govori u prilog teoriji o hiperserotoninemiji kao o biljegu, a ne uzročniku promjena u središnjoj homeostazi serotonina.
Serotonin (5HT) regulates the development of its own neurons and target tissues during neurogenesis, therefore deviations from optimal 5HT concentrations during brain development can lead to structural and functional anomalies. In this thesis, through the chronic perinatal treatment with the immediate serotonin synthesis precursor, 5- hydroxytryptophan (5HTP, 25 mg/kg), or with an inhibitor of 5HT degradation, tranylcypromine (TCP, 2 mg/kg), we have increased 5HT concentrations in rats with the aim of investigating the effects on adult brain 5HT homeostasis. During the treatment 5HTP significantly increased 5HT levels in the peripheral compartment (hyperserotonemia), and TCP in the peripheral and central compartment. Both treatments had long-lasting/permanent consequences on the function of the central 5HT compartment, evident through changes in 5HT concentration and metabolism, expression of 5HT-regulating genes and serotonin related behavior. The fact that developmental disturbances in 5HT metabolism induced permanent disturbances in function of central 5HT compartment points to the genes that regulate 5HT metabolism as potential candidates for research in 5HT-related behavioral disorders. The effects of both treatments where analogous, showing a dose-effect: central 5HT homeostasis was mildly altered in animals with developmental disturbances only in peripheral 5HT homeostasis (5HTP), and drastically altered in animals with developmental disturbances in both central and peripheral 5HT homeostasis (TCP). These findings suggest that severe alterations in 5HT function observed in psychiatric diseases may be caused by developmental disbalance in the central 5HT compartment and speak in favor of the theory of hyperserotonemia as a marker, not a cause, of disturbances in central serotonin homeostasis.
Sekundarna osteoporoza je komplikacija dugoročne terapije heparinom. Istražili smo ulogu heparina u BMP6 signalnom putu i osteogenoj aktivnosti in vitro korištenjem stanične linije mioblasta miša ...C2C12-BRE-Luc i in vivo u dva modela osteoporoze u miševa. BMP6 specifično veže heparin koji inhibira BMP6-potaknutu fosforilaciju Smad1/5/8 u C2C12-BRE-Luc stanicama. Predtretman kloratom i heparinazom III inhibira BMP6 signalizaciju, za koju su N- i O-sulfatne strukture neophodne. Heparin inhibira BMP6-potaknuti izražaj alkalne fosfataze i osteokalcina. U potkožnom testu heparin ovisno o dozi inhibira BMP6-inducirano formiranje nove kosti i hrskavice. U modelu osteoporoze nakon menopauze heparin ovisno o dozi inhibira sposobnost BMP6 za poboljšanje kvalitete kosti, što je pokazano pomoću DEXA-e i μCT-a. U modelu heparinom inducirane osteoporoze istovremeno tretiranje s BMP6 sprječava negativan učinak heparina na kosti, što je pokazano nepostojanjem značajne razlike u BMD i parametrima spužvaste kosti u odnosu na kontrolne životinje. Ovi rezultati pokazuju po prvi puta da vezivanje heparina za BMP6 može doprinijeti razvoju heparinom inducirane osteoporoze te da terapija heparinom u kombinaciji s BMP6 može spriječiti heparinom induciranu osteoporozu.
Secondary osteoporosis is a complication of long-term heparin therapy. We investigated the role of heparin in BMP6 signaling and osteogenic activity in vitro in C2C12-BRE-Luc mouse myoblast cell line and in vivo in two osteoporosis models in mice. BMP6 specifically binds to heparin, which inhibits BMP6-induced phosphorylation of Smad1/5/8 in C2C12-BRE-Luc cells. Pretreatment with chlorate and heparinase III inhibits BMP6 signaling, for which the N-and O-sulfate structures are necessary. Heparin inhibits BMP6-induced expression of alkaline phosphatase and osteocalcin. In the subcutaneous test heparin dose-dependently inhibits BMP6-induced formation of new bone and cartilage. In the model of postmenopausal osteoporosis heparin dose-dependently inhibits the ability of BMP6 to improve the quality of the bone, as shown by DEXA and μCT. In the model of heparin-induced osteoporosis simultaneous treatment with BMP6 prevents the negative effect of heparin on bone, as shown by the lack of significant differences in BMD and trabecular bone parameters compared to control animals. These results show for the first time that binding of heparin to BMP6 may contribute to the development of heparin-induced osteoporosis and that heparin therapy in combination with BMP6 can prevent heparin-induced osteoporosis.
Razmnožavanje u biljaka ovisi o pravilno razvijenom muškom i ženskom gametofitu. S obzirom na tešku dostupnost i vremensku ograničenost gametofita u životnom ciklusu biljke, proučavanje procesa koji ...dovode do razvoja gametofita predstavlja izazov. Usavršavanjem tehnika mikrodisekcije i novih metoda analize cjelokupnog transkriptoma, napravljen je korak prema razumijevanju molekularnih mehanizama uključenih u ove procese. Cilj ovog doktorskog rada je funkcionalna karakterizacija MATHBTB proteina iz kukuruza (ZmMAB1) čiji je gen višestruko zastupljen u cDNA bibliotekama jajne stanice i zigote kukuruza. Filogenetička analiza je ukazala da ZmMAB1 pripada proširenoj grupi gena u MATHBTB porodici koja broji 31 član i prethodno nije opisana u kukuruzu. Utišavanaje gena ZmMAB1 putem RNAi dovelo je do gubitka kromosoma i kraćeg diobenog vretena u mejozi tijekom mikrosporogeneze. Prijelazom iz mejoze u mitozu došlo je do nepotpunog razdvajanja dvaju jezgara na suprotne polove što je onemogućilo daljni razvitak muškog i ženskog gametofita u mab1 (RNAi) mutantima. Takav fenotip zajedno sa vrlo specifičnom ekspresijom ZmMAB1 tijekom prve mitotske diobe u mega- i mikrogametogenezi, te zigoti upućuje na ulogu proteina ZmMAB1 u asimetričnim diobama. Ta uloga je potvrđena i heterolognom ekspresijom gena ZmMAB1 u uročnjaku. Također, ZmMAB1 intereagira sa kulinom 3, te kao dio kompleksa ubikvitin ligaze E3 sudjeluje u procesu proteasomalne razgradnje što ujedno daje i naznaku o regulaciji mejoze i mitoze kroz selektivnu ubikvitinizaciju.
Plant reproduction depends on proper development of the male and the female gametophyte. Due to the reduced size of the angiosperm gametophyte and especially inaccessibility of the female gametophyte, it is challenging to study these fundamental processes. Recent advances in microdissection techniques combined with powerful tools for transcriptome analysis have begun to shed a light on molecular mechanisms underlying the processes. The aim of this thesis was to functionally characterize a maize MATH-BTB (ZmMAB1) protein, which was encoded by a gene highly represented in cDNA libraries of isolated maize egg cells and zygotes. A phylogenetic analysis has shown that ZmMAB1 belongs to an expended group of a previously undescribed maize MATH-BTB gene family with 31 members. RNAi silencing of ZmMAB1 leads to chromosome segregation defects and short spindles during male meiosis. After meiosis-mitosis transition two identical nuclei are formed in mab1 (RNAi) mutants disrupting male and female germline progression. Cell division phenotypes of mutant plants together with its specific gene expression profile during the first mitotic division during male and female gametogenesis and in the zygote implied the importance of ZmMAB1 during asymmetric cell divisions. This hypothesis was further confirmed by heterologous expression of ZmMAB1 in Arabidopsis thaliana. Additionally, interaction of ZmMAB1 with cullin 3 suggests its role in proteasomal degradation as a part of an ubiquitin E3 ligase complex. These finding provide novel insights into the meiotic and mitotic regulatory network through selective ubiqiuitination.
Laringofaringealni refluks je trenutno nedovoljno istražena bolest, a smatra se da je djelomično odgovoran za nastanak bolesti grkljana. Nastaje povratom kiselog sadržaja iz želuca, ali postoje ...naznake o grkljanu kao mjestu stvaranja kiseline, uslijed djelovanja protonske pumpe u sluznici. U literaturi također postoji mali broj radova o detaljnoj morfometriji grkljana. Stoga je cilj ovog rada bio detaljno istražiti morfometrijske korelacije grkljana i utvrditi pojavnost protonske pumpe u različitim dijelovima grkljana. U radu je prisutnost protonske pumpe utvrđivana imunohistokemijskim dokazivanjem na uzorku od 50 kadavera i 11 živih pacijenata kod kojih je učinjena laringektomija. Morfometrijskom analizom dokazane su korelacije mjerenih parametara s ciljem dodatnog razumijevanja razvoja dijelova grkljana. Dokazana je prisutnost protonske pumpe u seromukoznim žlijezdama grkljana u području supraglotisa. Po prvi je put utvrđena prisutnost protonske pumpe u ljudskim hondrocitima štitne i epiglotične hrskavice. Dokazana ekspresija protonske pumpe ostavlja prostor za dodatna istraživanja laringofaringealnog refluksa, ali i patofiziologije hrskavičnih poremećaja.
Laryngopharyngeal reflux is quite spread, but still not suffitiently investigated dissease that is at least partly connected to pathogenesis of other laryngeal disseases. It is generally known to be developed by upward recurrence of acid gastric content, but there are some signs that acid can be produced in larynx as well, because of the proton pump activity in the laryngeal mucosa. There is also quite small number of studies about detailed laryngeal morphometry.Theafore the goal of our study was to investigate laryngeal morphometric corelations and to identify the existance of proton pump in different parts of larynx.The presence of proton pump was determined by imunohistochemistry in a group of 50 cadavers and 11 live patients after laryngectomy. Morphometric analysis showed corelation between measured parameters for better understanding of development of laryngeal parts. The presence of proton pump was proved in seromucos glands in laryngeal supraglottic area, but it is also, for the first time, found in human hondrocites of thyroid and epiglottic cartilage.These new findings of proton pump expression open the space for additional research, not only of laryngopharyngeal reflux, but also the pathophysiology of cartilaginous disorders.
Za analizu humane DNA koriste se tetranukleotidni STR sustavi, dok se za analizu uzoraka animalnog podrijetla najčešće koriste dinukleotidni mikrosateliti. Međunarodno društvo za animalnu genetiku ...(ISAG), za ispitivanje podrijetla goveda, preporučilo je 30 najčešćih dinukleotida prisutnih u različitim kombinacijama u postojećim komercijalnim kitovima. Korištenjem jednog od alata (Tandem-Repeats Finder) „in silico mining“ pretraživanjem mikrosatelitnih sljedova iz baze podataka DNA sljedova (UniGene NCBI) za goveda, odabrani su novi, visoko polimorfni mikrosateliti (tetranukleotidi), do sada neprimijenjeni u postupcima utvrđivanja identiteta kod goveda. Testirani su na uzorku od 110 goveda i uspoređeni s mikrosatelitima uključenim u komercijalni set reagensa tvrtke Applied Biosystems. Ispitan je i velik broj postojećih, preporučenih mikrosatelita. Odabrana je statistički najznačajnija kombinacija - novorazvijeni multiplex STR sustav (12 STR lokusa), u sklopu kojeg je razvijena i integrirana alelna ljestvica. Dobiveni rezultati omogućiti će primjenu biljega čija će uporaba povećati vrijednost i preciznost budućih DNA analiza kod goveda, te ih približiti vrijednostima analiza DNA humanog podrijetla.
Tetra nucleotides STR systems are used to analyse the DNA of human origin. In the analyses of samples of animal origin dinucleotide microsatellites are most commonly used. For the study of bovine origin International Society for Animal Genetics (ISAG) has recommended 30 of the most common dinucleotide microsatellites that are present in different combinations in existing commercial kits. By using one of available tools (Tandem-Repeats Finder) for "in silico mining" search of microsatellite sequences from a database of DNA sequences (UniGene NCBI) for cattle, a new highly polymorphic microsatellites were chosen - up till now not applied in the procedures of establishing the bovine identity. They were tested on a sample of 110 cattle and compared with microsatellites included in the existing commercial kit of Applied Biosystems. The large number of the existing, recommended microsatellites was also examined. Then the statistically most significant combination was chosen– newly developed multiplex STR system -12 STR loci and the allelic ladder for selected combination has been developed and integrated. The acquired results will enable the aplication of markers the use of which will increase the value and accuracy of future DNA analysis in cattle. It will also bring them closer to the DNA analysis of human origin.
