S ciljem istraživanja imunološke aktivnosti neutrofila, od šest visokoproizvodnih (VP) i šest niskoproizvodnih (NP) Karan Fries (KF) krava prikupljeni su uzorci krvi -15, -7, -5, -3, -2, -1 dana ...prije partusa, zatim tijekom partusa, te 1, 2, 3, 5, 7 i 15 dana nakon partusa. Analizirana je razina kortizola u plazmi, aktivnost fagocita (AF), razine enzima (elastaze, kolagenaze, katepsina G) te ekspresija TLR-2, TLR-4 i IL-8. Kod obje skupine krava, VP KF i NP KF, utvrđeno je povećanje ukupnog broja leukocita (UBL) i postotka neutrofila pri teljenju, ali razine su kod VP KF krava bile signifikantno više (P<0,05) nego kod NP KF krava. Broj nesegmentiranih neutrofila bio je također signifikantno (P<0,05) viši kod VP krava. Signifikantna (P<0,05) imunosupresija u odnosu na AF utvrđena je kod VP u usporedbi sa NP KF kravama tijekom peripartusnog razdoblja, s najnižom razinom imunosupresije pri teljenju obje skupine krava. Razine kortizola bile su signifikantno (P<0,01) više tijekom teljenja i negativno povezane s funkcijom neutrofila. Razlike između skupina također su ostale signifikantne (P<0,05) i u slučaju više razine kortizola utvrđene kod VP KF krava. Elastaza, kolagenaza i katepsin signifikantno su (P<0,05) opadali tijekom teljenja. Elastaza je smanjena za približno 2,5 puta na dan teljenja NP KF krava dok kod VP KF krava takvo jako smanjenje nije opaženo. Razine kolagenaze i katepsina bile su signifikantno (P<0,05) više kod NP krava. U odnosu na NP krave, ekspresije TLR-2 gena kod VP krava bile su signifikantno (P<0,05) niže tijekom cijelog peripartusnog razdoblja. Ekspresija TLR-4 gena bila je signifikantno (P<0,05) niža 15. dan prije i poslije teljenja VP krava. IL-8 je bio signifikantno različit (P<0,05) samo tijekom prepartusnog razdoblja. Snižena funkcija neutrofila kod krava križanki s visokim proizvodnim potencijalom doprinosi njihovoj manjoj otpornosti na bolesti i čini ihosjetljivijima na infekcije tijekom peripartusnog razdoblja.
Izoelektrična točka, duljina molekule, molekularna masa i slijed aminokiselina bitno utječu na topljivost proteina. U ovom smo se radu fokusirali na sastav aminokiselina i ispitali one koje najviše ...utječu na razinu ekspresije topljivog protutijela albumina iz ljudskog seruma (HSA dAb). Grupiranjem i primjenom linearnog modela analizirana je topljivost 65 varijanti proteina. Bitan utjecaj na ekspresiju topljivog protutijela dAb imale su specifične kombinacije aminokiselina, i to (S, R, N, D, Q) u supernatantu, (G, R, C, N, S) u lizatu peleta i (R, S, G) u ukupnom topljivom protutijelu dAb. Od 20 aminokiselina, arginin je imao negativan, a glicin i serin su imale pozitivan učinak na razinu ekspresije topljivog proteina. Preciznost linearnog modela predviđanja topljivosti proteina bila je 80 %. Zaključeno je da se povećanjem udjela polarnih aminokiselina, osobito glicina i serina, te smanjenjem udjela arginina bitno povećala ekspresija topljivog proteina HSA dAb.
Odnos prema osobama s invaliditetom doživio je duboku i široku transformaciju na bolje u relativno kratkom vremenu. Od duboke i intenzivne segregacije, zbog čega su mnoge osobe nerijetko čitav život ...provodile u domovima svojih obitelji, daleko od očiju javnosti, do mnogo prihvatljivijeg ponašanja prema njima u suvremenosti. Odnos prema osobama s invaliditetom temeljem njihova izgleda jedan je od tradicionalnih izvora segregacije, u mnogomu prisutan još i danas. U ovom se članku želi ukazati na to, kako taj odnos nije rezultat “nekulturnog” ponašanja pojedinaca, koji segregiraju “stigmatizirane” pojedince, već je rezultat u kulturi duboko ukorijenjenih stavova ili “kriterija” za procjenjivanje lijepog i njegovo odvajanje od manje lijepog ili nelijepog. To je zapravo socijalni konstrukt jednog dijela naše stvarnosti, koji se prenosi socijalizacijskim procesima iz generacije u generaciju.
Inzulinu sličan faktor rasta 1 (IGF1) ima ključnu ulogu u razvoju ploda i postnatalnom rastu. Cilj je ovog istraživanja bio okarakterizirati cijelu kodirajuću sekvenciju IGF1 gena koza u dvije ...autohtone pasmine iz Indije: malabari i crna atapadi. S tim u vezi željelo se utvrditi polimorfizme IGF1 gena i istražiti njihove učinke na obilježja tjelesne razvijenosti, te ustanoviti relativnu ekspresiju IGF1 mRNA u mišićnom tkivu koza s malom i velikom tjelesnom masom. Kod 298 koza umnožena su sva 4 eksona IGF1 gena i okarakterizirana uz pomoć PCR-SSCP. Na eksonu 2 utvrđena su dva genotipa (CC i CT). Analiza sekvencije PCR produkata od svakog genotipa pokazala je novi polimorfizam pojedinačnog nukleotida, g. 80C>T (GenBank No. KM974180) koja je uzrokovala neistovjetnu mutaciju (Thr48Met) i razlike u strukturi proteina IGF1. Analiza povezanosti lokusa pokazala je da CT genotipovi imaju u odnosu na CC genotipove veću dužinu tijela (P<0,01), veći opseg prsiju (P<0,01) i veći indeks dužine tijela (P<0,05). Dva nova PCR-RFLP-a su označena za brzu detekciju genotipova. Kvantitativna PCR analiza u stvarnom vremenu pokazala je nesignifikantne razlike (P>0,05) u ekspresiji IGF1 mRNA u mišićnom tkivu koza s malim i velikim tjelesnim masama. Rezultati istraživanja upućuju da bi alele IGF1 gena mogli smatrati ciljanom skupinom za unaprjeđenju obilježja rasta u koza.
Usporedno s razvojem DNA molekularnih markera kao ishodišnih tehnologija analiza DNA, 90-tih godina prošlog stoljeća znanstvenici su počeli razvijati novu tehnologiju nazvanu DNA-čip. Naziv dolazi od ...toga što se, tehnički gledano, na maloj staklenoj površini nalaze oligonukleotidni lanci poznatog slijeda baza, što podsječa na elektronički čip. Ostali nazivi koji se spominju u literaturi su: biochip, DNA microarray, gene array, gene chip i drugi. Prema namjeni eksperimenata razvijena su tri glavna tipa DNA-čipa: sekvencijski čip, ekspresijski čip i čip komparativne hibridizacije. Osnovna podjela DNA-čipova na oligonukleotidne i cDNA (komplementarna DNA) proizlazi iz njihove svrhe i načina korištenja. Identifikacija mutacija i DNA varijacija na cjelokupnom genomu te sekvenciranje i analiza genoma može se izvesti oligonukleotidnim DNA-čipom, dok se cDNA-čip najčešće koristi u proučavanju ekspresije gena, detekciji određenih proteinskih komponenti u hrani, detekciji mutiranih gena, te pri određivanju sigurnosti konzumiranja GMO biljaka. Važnim područjem korištenja DNA-čipa smatra se analiza genske ekspresije i otkrivanje polimorfizma na razini nukleotida (SNP - Single Nucleotide Polymorphisms).
U ovom je radu u soju bakterije bakterije Zymomonas mobilis ZM4 eksprimirana flipaza iz kvasca Saccharomyces cerevisiae. Najprije je homolognom rekombinacijom u bakterijski kromosom ugrađen ...selektivni biljeg omeđen FRT sekvencijama. Potom je u bakteriju unesen plazmid pBBR1MCS-2 koji sadrži kvaščev gen Flp pod regulacijom promotora gena gap iz soja ZM4 (Pgap, koji kodira za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu) ili cI857-PR iz bakteriofaga λ. Gen Flp uspješno je eksprimiran, te je učestalost gubitka selektivnog markera omeđenog FRT sekvencijama iznosila približno 100 %. Osim toga, vektor za ekspresiju gena Flp lako je uklonjen trostrukim precjepljivanjem na podlogu bez antibiotika, pa se može zaključiti da je razvijena učinkovita metoda za uklanjanje selektivnog biljega iz transformanata bakterije Zymomonas mobilis.
Kontaminiranje hrane mikotoksinima je globalni problem. S tim u svezi nekoliko je neriješenih pitanja. Prvo, više od 25% svjetske proizvodnje žitarica kontaminirano je mikotoksinima. Osobito ...mikotoksini fuzarijuma (tzv.poljski mikotoksini) kontaminiraju do 100% žitarica. Budući da ovi mikotoksini dolaze iz polja teško ih je suzbiti pa i različiti tehnički postupci uključujući i selekciju biljaka na otpornost na mikotoksine nisu dali značajnije rezultate. Drugo, razvijene analize odnose se samo na oko 30 važnijih mikotoksina. Zato ako je i nalaz analitičkog laboratorija da "nisu nađeni mikotoksini" znači da nije nađeno 10-30 analiziranih mikotoksina. Što se tiče ostalih, nema odgovora. Treće, uzorkovanje za analizu mikotoksina vrlo je teško i važan je izvor pogrešaka. Četvrto, nema sigurnih razina mikotoksina zbog sinergetskih interakcija mnogih mikotoksina: nekoliko mikotoksina u malim koncentracijama
može prouzročiti više problema nego jedan štetan u većoj količini. Noviji rezultati pokazuju da u mnogo slučajeva svojstva aktivne membrane raznih mikotoksina određuju njihovu toksičnost. Doista, ugrađivanje mikotoksina u strukture membrane uzrokuje razne štetne promjene. Te su promjene povezane s promjenom sastava masnih kiselina strukture membrane i s peroksidacijom drugog lanca PUFA-e u membrani. Ovo konačno oštećuje receptore membrane, prouzročivši promjene drugog niza enzima koji povezuju membranu i odgovorni su za reguliranje važnih puteva. Konačno, to prouzrokuje promjene u propusnosti membrane, fleksibilnosti i drugim važnim značajkama koje određuju funkciju membrane. Štetno djelovanje mikotoksina na DNK, RNA i sintezu bjelančevina zajedno s proapoptotičnim djelovanjem dalje djeluje na važne metaboličke puteve. Konačno dolazi do promjene u fiziološkim funkcijama, uključujući rast, razvoj i reprodukciju. Važnost oksidacijskog stresa i peroksidacije lipida u svim tim procesima potvrđuje zaštitno djelovanje prirodnih antioksidanata protiv toksičnosti mikotoksina. Međutim, zaštitno djelovanje antioksidanata, uključujući selen, ograničene je vrijednosti i kombinacija. Vezanje mikotoksina s prirodnim antioksidantima mogao bi biti sljedeći korak u sprječavanju štetnog djelovanja u proizvodnji životinja i peradi.
Da bi se uspješno proizvela ksilanaza za primjenu u prehrambenoj industriji, gen koji kodira ksilanazu II (Xyn II) iz plijesni Aspergillus usamii kloniran je u vektor pPIC9K i elektroporacijom ...integriran u genom kvasca Pichia pastoris KM71. Rekombinantni sojevi P. pastoris (His+Muts) uzgojeni su na podlogama s minimalnom količinom dekstroze te izdvojeni pomoću PCR metode. Procjenom aktivnosti i molekularne mase enzima (SDS-PAGE metodom) utvrđeno je da je dodatak metanola inducirao ekstracelularnu ekspresiju Xyn II u kvascu P. pastoris. U pokusu na tresilici izmjerena je najveća aktivnost ksilanaze od 1760 U/mL i specifična aktivnost od 3846,83 U/mg. Optimalna pH-vrijednost za aktivnost rekombinantne Xyn II bila je 4, a optimalna temperatura 50 °C. Ksilanaza je bila stabilna na temperaturama nižim od optimalne, te u rasponu pH=3-5. Pomoću SDS-PAGE metode procijenjena je molekularna masa enzima od 21 kDa. Michaelis-ova konstantna iznosila je Km=4,55 mg/mL, maksimalna brzina reakcija bila je vmax=15,15 mM/s, a kinetička konstanta kcat=455 s-1. Aktivnost enzima potaknuta je dodatkom EDTA i Ca2+ iona, a inhibirana ionima Mn2+ i Fe2+. U radu je prvi put opisana mogućnost masovne proizvodnje proteina iz A. usamii s pomoću kvasca P. pastoris.
L-asparaginaza je antineoplastični agens koji selektivno smanjuje razinu L-asparaginaze u krvi i sprečava proliferaciju kanceroznih stanica. L-asparaginaze iz bakterije Escherichia coli koriste se za ...klinička ispitivanja zbog njihove specifičnosti za supstrat i ograničene aktivnosti glutaminaze. Gen ansB za kodiranje L-asparaginaze II izoliran je iz E. coli MTCC 739, kloniran pomoću pelB sekvencije prokariotskog vektora pET20b i izražen u stanicama E. coli DE3. Pojačana je ekspresija rekombinantnog proteina postignuta pomoću 10 μM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozidaze, pri čemu je izraženi protein bio topljiv, a na C završetku imao je heksahistidinsku oznaku. Rekombinirani je protein pročišćen kromatografijom pomoću nikal(II)-nitrilotrioctene kiseline. Ispitani su ovi parametri: optimalna temperatura i pH-vrijednost za aktivnost enzima, te utjecaj temperature na njegovu stabilnost. Utvrđeno je da je pročišćeni protein imao optimalnu aktivnost pri 37 °C i pH=6.
Ciklooksigenaze su ključni enzimi u biosintezi prostanoida. Postoje dvije izoforme: COX-1 koja je povezana s održavanjem fizioloških uvjeta u sluznici debelog crijeva; te inducibilna izoforma COX-2 ...koja je uglavnom povezana s patološkim procesima uključujući karcinom debelog crijeva. Cilj ovog istraživanja bio je ispitati ulogu COX izoformi u razvoju i napredovanju sporadičnoga karcinoma debeloga crijeva, mehanizme njihove regulacije te povezanost regulatornih polimorfizama gena COX-1 i COX-2 sa sklonošću obolijevanju i ekspresijom mRNA i proteina. Naši rezultati su pokazali da COX-1 ima zaštitnu, a COX-2 tumorigenu ulogu u sluznici debelog crijeva. Gubitak COX-1 učestali je događaj u karcinogenezi, dok COX-2 pokazuje veću varijaciju između uzoraka. Porast COX-2 ekspresije povezan je s lošijim preživljenjem oboljelih. Dokazali smo povezanost regulatornih polimorfizama sa sklonošću obolijevanju i ekspresijom gena COX-2. Ekspresija proteina odgovara mRNA ekspresiji te nema povezanosti s ekspresijom miR-200 što pokazuje da je ekspresija gena COX-1 i COX-2 primarno regulirana na razini transkripcije.
Cyclooxygenases are the key enzymes in prostanoid biosynthesis. Two isoforms exist: COX-1, associated with maintainance of physiological conditions in colon; and inducible COX-2 that is mainly related to various pathologies including colorectal cancer. The aim of our study was to examine the role of COX isoforms in development and progression of sporadic colorectal cancer, mechanisms of their regulation and whether regulatory polymorphisms in COX genes are related to cancer susceptibility, mRNA and protein expression. Our results show that COX-1 has protective, and COX-2 tumorigenic role in colorectal mucosa. Loss of COX-1 is very frequent in carcinogenesis, while COX-2 shows greater variation between samples. Higher COX-2 expression correlates to worse patient survival. We proved the role of regulatory polymorphisms in cancer susceptibility, and COX-2 expression. Protein expression correlates with mRNA expression, and there is no associtation with miR-200, which indicates transcriptional regulation as the key regulatory mechanism of COX expression.
PDF
