Poligalakturonaze (EC 3.2.1.15) kataliziraju hidrolizu pektina i/ili pektinske kiseline i mogu se primijeniti u prehrambenoj industriji, npr. za bistrenje soka ili ekstrakciju pektina. U radu je ...ispitan rast rekombinantnog kvasca Saccharomyces cerevisiae, te heterologna ekspresija kisele poligalakturonaze iz Aspergillus kawachii u šaržnom i prihranjivanom šaržnom uzgoju. U sintetičkom su mediju šaržnim uzgojem određeni kinetički i stehiometrijski parametri rekombinantnog kvasca. Pritom su dobivene ove vrijednosti: koncentracija ukupne biomase od 2,2 g/L; koncentracija proteina od 10 mg/L; enzimska aktivnost od 3 U/mL i produktivnost od 0,006 U/(mL·h). U prihranjivanom su šaržnom uzgoju primijenjene razne strategije prihranjivanja galaktozom: (i) nakon što kvasac utroši glukozu za rast, jednokratnim dodatkom galaktoze postiže se produktivnost od 0,19 U/(mL·h); (ii) nakon utroška glukoze, dvaput se doda galaktoza u jednakim koncentracijama, pri čemu je produktivnost 0,21 U/(mL·h) i (iii) simultanim prihranjivanjem glukozom i galaktozom dobivena je produktivnost od 1,32 U/(mL·h). Zaključeno je da se najbolji rezultati postižu simultanim prihranjivanjem glukozom i galaktozom. Određene su i biokemijske značajke rekombinantnog enzima: molekularna masa od približno 60 kDa, izoelektrična točka od 3,7 i sposobnost enzima da hidrolizira poligalakturonsku kiselinu pri pH=2,5.
Hemoragijska vrućica s bubrežnim sindromom (HVBS) uzrokovana je infekcijom patogenim hantavirusima koji su endemski na području Europe i Azije. Najvažniji patogeni hantavirusi koji izazivaju HVBS su: ...Hantaan (HTNV), Seoul (SEOV), Puumala (PUUV) i Dobrava (DOBV). U Europi, kao i u Hrvatskoj, najveći broj infekcija je uzrokovan PUUV-om. Infekcija hantavirusima kod HVBS bolesnika može uzrokovati širok spektar različitih kliničkih stanja, ovisno o uzročniku, od inaparentne ili blage bolesti do fulminantne hemoragijske bolesti s teškim bubrežnim zatajenjima i smrću. U Hrvatskoj se većina bolesnika s HVBS-om prezentira s blagim oblikom bolesti i visokim febrilitetom, ali zabilježeni su i srednje teški i teški oblici HVBS-a uzrokovani PUUV-om. Bubrezi su primarni ciljni organ u HVBS-u te može doći do njihovog akutnog zatajenja i bubrežnih lezija različitog stupnja. Klinički pokazatelji zatajenja bubrega su: povišene vrijednosti kreatinina i ureje u serumu, proteinurija, te smanjeni stupanj glomerularne filtracije. Razlozi zatajenja bubrega nisu poznati, ali se pretpostavlja da veliku ulogu imaju imunopatogenetski mehanizmi, a potencijalni direktni učinak virusa, kao ni apoptoza in vivo nisu dokazani. Nalazi bubrežne biopsije bolesnika oboljelih od HVBS-a, uzrokovanog PUUV-om, pokazali su pojavu akutnog tubulointersticijskog nefritisa s infiltracijom limfocita, plazma stanica i monocita/makrofaga. Posljednjih 15-ak godina identificiran je novi način posttranskripcijske regulacije genske ekspresije pomoću malih RNA molekula, tzv. miRNA, sastavljenih od 18 do 25 nukleotida. Ova klasa RNA molekula regulira translaciju glasničkih RNA ovisno o stupnju podudarnosti sekvence nukleotida miRNA i glasničke RNA. Pokazano je da ove molekule u stanicama sisavaca sudjeluju u nizu fizioloških procesa i da njihova ekspresija znatno varira, ne samo od organa do organa, nego i unutar raznih tkiva istog organa. Istraživana je i njihova uloga u raznim patološkim stanjima bubrega kao što su dijabetična nefropatija, tubulointersticijska fibroza, rak bubrega ili nefritis, pri čemu je uočena znatna deregulacija pojedinačnih miRNA. Usporedbom ekspresijskog profila miRNA između tri stanične linije ljudskog porijekla inficiranih s četiri različita hantavirusa, patogena i nepatogena, saznalo se da je ekspresijski profil miRNA jedinstven za svaku vrstu hantavirusa i ovisan o inficiranim stanicama. Nedavno je pokazano da virus Anda, koji inače uzrokuje teže oblike HPS-a, interferira s normalnom funkcijom miRNA, što doprinosi povećanoj permeabilnosti inficiranih endotelnih stanica. Posebne stanične strukture, tzv. „P-bodies“, su mjesto gdje miRNA sazrijevaju unutar stanice. U tim istim strukturama su dokazani hantavirusni nukleokapsidni (N) proteini, što implicira moguću upletenost tog proteina u sazrijevanju miRNA, koje utječu na procesuiranje glasničke RNA. Dokazano je da se hantavirusni protein N veže za stanične glasničke RNA te tako utječe na smanjivanje njihove i povećavanje translacije virusne glasničke RNA tijekom procesa „cap-snatching“. Osim u raznim tkivima, dokazana je prisutnost miRNA i u raznim tjelesnim tekućinama, npr. serumu ili urinu. Istraživanja tijekom prethodnih godina pokazala su da miRNA mogu djelovati kao prediktori težine kliničke slike za razna patološka stanja bubrega kao što su: rak, kronični glomerulonefritis, IgA ili diabetička nefropatija. Mogu se koristiti u različite svrhe, bilo kao indikator učinkovitosti terapije u bolesnika, bilo u dijagnostici kako bi se potvrdila prisutnost neke bolesti ili prognostički radi procjene progresije ili ishoda bolesti. Danas se u različitim bolestima primjenjuju prediktori težine kliničke slike kako bi pomogli pri ranoj dijagnozi, prevenciji bolesti, identifikaciji ciljnih molekula za lijekove, odgovoru na lijekove itd. Ova doktorska disertacija po prvi put istražuje utjecaj infekcije i replikacije PUUV na ekspresiju miRNA hsa-miR-21-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27a-3p, hsa-miR-127-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-let-7e-5p in vitro i ex vivo. Pomoću stanične linijske kulture epitelnih stanica bubrega (HEK293) istražen je učinak infekcije i replikacije PUUV in vitro u jednom staničnom modelu na ekspresiju i lučenje prethodno spomenutih miRNA. Transfekcijom ekspresijskog plasmida koji sadrži otvoreni okvir čitanja PUUV N proteina istražen je učinak pojedinačne komponente PUUV virusa na ekspresiju i lučenje prethodno spomenutih miRNA. Osim u in vitro pokusima mjerena je razina pojedinačnih miRNA u urinu bolesnika s HVBS-om s potvrđenom infekcijom PUUV. Mjerena razina je uspoređena s razinom skupina s akutnom infekcijom urinarnog trakta, pijelonefritisom (PN), i skupinom zdravih kontrola. HEK293 stanice inficirane PUUV pokazale su ograničenu deregulaciju ekspresije odabranih miRNA. Pojačana ekspresija je nađena za miR-21 i miR-27a nakon 24 sata od infekcije. Izmjerene razine miRNA u supernatantima bila su jako niske, djelomično nedetektabilne. Dobivene promjene lučenja miRNA nakon infekcije PUUV nisu omogućile jasnu analizu, vjerovatno zbog jako niske razine istih. Suprotno radnoj hipotezi, tranzijentna ekspresija N proteina PUUV nije doprinijela očekivanim rezultatima, i čini se da samostalna ekspresija N proteina PUUV nema značajnu ulogu na biogenezu miRNA, barem ne u ovom eksperimentalnom modelu. Po prvi put je dokazana povećana prisutnost miR-21 i miR-27a u urinu bolesnika s HVBS-om ili PN. Dodatno je pokazano da je miRNA let-7e značajno povišena samo u urinu bolesnika s HVBS-om. Podjelom skupina bolesnika s HVBS-om prema težini kliničke slike, ustanovljena je značajna deregulacija miR-21, miR-24, miR-27a, miR-127 i let-7e u bolesnika s težim oblikom te bolesti. Nasuprot tome, u bolesnika s lakšim oblikom HVBS-a je pronađena deregulacija samo za miR-21 i let-7e. Ovaj različitih profil miRNA mogao bi predstavljati prognostički marker za teža oboljenja nakon infekcije s PUUV-om. Statistička analiza razine miRNA u urinu i laboratorijskih parametara u bolesnika s HVBS-om pokazala je pozitivnu korelaciju povišenih miR-21, miR-27a i miR-127 sa serumskim razinama ureje i kreatina. Sveobuhvatno se pokazalo da infekcija i replikacija PUUV-a utječe na ekspresiju i prisutnost dijela izabranih miRNA. Unutar staničnog modela su uočene samo ograničene promjene u ekspresiji miR-21 i miR-27a nakon infekcije PUUV-om, dok su u urinu bolesnika s HVBS-om nađene promjene kod istih i dodatno drugih miRNA. Pozitivna korelacija povišenih razina miR-21, miR-27a i miR-127 sa serumskim razinama ureje i kreatina, koji su opće prihvaćeni pokazatelji težine kliničke slike HVBS-a, upućuje na mogućnost korištenja ovih miRNA kao prognostičkih biomarkera razvoja težine kliničke slike. Daljnja istraživanja morat će pokazati koliko pronađene razlike u prisutnosti ovdje istraživanih miRNA mogu poslužiti kao prognostički markeri, HVBS-a, a osobito će trebati potvrditi moguću specifičnost i ulogu let-7e. Dodatno će se trebati razjasniti i uloga miR-21 i miR-27a u raznim bubrežnih bolestima, obzirom na njihovu detekciju u brojnim različitim patološkim stanjima bubrega.
This study investigates the expression or secretion of selected microRNAs (miRNAs) in vitro in HEK293 cells infected with Puumala virus (PUUV) or transiently transfected with PUUV N protein, and ex vivo in urine samples of patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) infected with PUUV, using real-time PCR. Limited deregulation of miR-21 and miR-27a expression was detected in HEK293, while miRNA abundance in supernatants was aberrant. Contrary to our hypothesis, transient expression of PUUV N did not yield significant changes in miRNA expression. In urinary samples of HFRS patients and patients with acute pyelonephritis, miR-21 and miR-27a were more abundant, while let-7e could be HFRS specific. In mild patients with HFRS only miR-21 and let-7e were deregulated, whereas in severe patients miR-24, miR-27a, and miR-127 were also altered. Detected miRNAs could present HFRS biomarkers correlating significantly with urea and creatinine levels, which represent hallmarks of HFRS progression and severity.
Cilj ovoga istraživanja bio je istražiti komponente urođene i stečene imunosti ključne u ranom perifernom imunološkom odgovoru na hantavirusnu infekciju kao i mogući regulacijski učinak miRNA na ...periferni imunološki odgovor. U mononuklearnim stanicama periferne krvi bolesnika s hemoragijskom vrućicom s bubrežnim sindromom (HVBS) uzrokovanim virusom Puumala (PUUV) određivana je relativna ekspresija gena urođene i stečene imunosti kao i miRNA, tehnologijom real-time PCR array-a. Rezultati su pokazali supresiju ranog imunološkog odgovora na PUUV, tj. ekspresije gena koji kodiraju sintezu receptora za prepoznavanje obrazaca mikroorganizama, kemokina i kemokinskih receptora, drugih citokina, transkripcijskih faktora kao i pojedinih signalnih molekula. Funkcionalne analize pokazale su da supresija ekspresije opisane skupine gena modulira upalni odgovor stanica putem interferencije s različitim staničnim signalnim putovima. Po prvi je puta pokazana biološka značajnost miRNA u regulaciji imunološkog odgovora tijekom HVBS-a. Detektirane promjene na razini imunološkog odgovora mogu se dovesti u korelaciju s težinom bolesti, ali ne i s količinom virusa u krvi. MAPK8, CCR5, IL-10, STAT1, STAT4, miR21 i miR19a mogli bi biti potencijalni prediktori patogeneze HVBS-a.
The aim of this study was to explore the components of innate and adaptive immunity important in the early peripheral immune response to hantaviral infection as well as possible regulatory effect of miRNA to peripheral immune response. Using real-time PCR array technology, the relative expression of immune response genes and miRNA was measured in peripheral blood mononuclear cells of patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) infected with Puumala virus (PUUV). The results showed suppression of the early immune response to PUUV i.e. genes coding for the synthesis of pattern recognition receptors, chemokines and their receptors, other cytokines, transcription factors as well as some signalling molecules. Functional analysis showed that down regulation of the expression of described set of genes modulates the inflammatory response by interfering with various cell-signalling pathways. For the first time, the biological importance of miRNA has been shown in the regulation of immune response during HFRS. Changes detected at the immune response level have been associated with disease severity but not with viral load in the blood. MAPK8, CCR5, IL-10, STAT1, STAT4, miR21 and miR19a could be potential predictors of HFRS pathogenesis.
Human cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous human pathogen responsible for devastating
congenital disease and life-threatening complications in immune-suppressed patients.
Available treatments have ...many shortcomings and effective vaccine is still lacking. Major
obstacles to progress in vaccine and antiviral drug development are (1) species specificity of
HCMV, and (2) gaps in our understanding of viral genes and their interaction with host genes.
First limitation is circumvented by the use of model animal viruses, especially murine
cytomegalovirus (MCMV). We sought to alleviate the second problem by studying MCMV
transcriptome using two approaches: classical cDNA library analysis and next generation
sequencing (RNASeq). This dual analysis revealed incredible complexity of MCMV
transcriptome, detected numerous novel viral spliced and unspliced transcripts as well as
transcription from intergenic regions, and showed that expression levels of viral transcripts
vary by several orders of magnitude. Unexpectedly, most top expressed genes were of
unknown functions and were improperly annotated. Therefore, this analysis provides the first
comprehensive overview of MCMV transcriptome, underscores the necessity of
transcriptomic analyses in providing evidence-based genome annotation and could serve as
the first step towards re-annotation of MCMV genome. The most abundant viral transcript,
recently identified as a noncoding RNA regulating cellular microRNAs 18, 84, was shown
to also code for a novel protein(s). This is the first viral transcript that functions both as a
noncoding RNA and an mRNA. In this work it is also shown that this transcript’s 5’ UTR
plays a role in NK cell recognition of infected cells via activating Ly49 receptors.
Analysis of host transcriptome showed that lytic infection revealed that many unexpected
gene groups are disregulated in response to the infection. Such systematic analysis may shed
new light on cytomegalovirus pathogenesis and suggests new areas of research.
Human cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous human pathogen responsible for devastating
congenital disease and life-threatening complications in immune-suppressed patients.
Available treatments have many shortcomings and effective vaccine is still lacking. Major
obstacles to progress in vaccine and antiviral drug development are (1) species specificity of
HCMV, and (2) gaps in our understanding of viral genes and their interaction with host genes.
First limitation is circumvented by the use of model animal viruses, especially murine
cytomegalovirus (MCMV). We sought to alleviate the second problem by studying MCMV
transcriptome using two approaches: classical cDNA library analysis and next generation
sequencing (RNASeq). This dual analysis revealed incredible complexity of MCMV
transcriptome, detected numerous novel viral spliced and unspliced transcripts as well as
transcription from intergenic regions, and showed that expression levels of viral transcripts
vary by several orders of magnitude. Unexpectedly, most top expressed genes were of
unknown functions and were improperly annotated. Therefore, this analysis provides the first
comprehensive overview of MCMV transcriptome, underscores the necessity of
transcriptomic analyses in providing evidence-based genome annotation and could serve as
the first step towards re-annotation of MCMV genome. The most abundant viral transcript,
recently identified as a noncoding RNA regulating cellular microRNAs 18, 84, was shown
to also code for a novel protein(s). This is the first viral transcript that functions both as a
noncoding RNA and an mRNA. In this work it is also shown that this transcript’s 5’ UTR
plays a role in NK cell recognition of infected cells via activating Ly49 receptors.
Analysis of host transcriptome showed that lytic infection revealed that many unexpected
gene groups are disregulated in response to the infection. Such systematic analysis may shed
new light on cytomegalovirus pathogenesis and suggests new areas of research.
Svrha istraživanja
Humani citomegalovirus široko je rasprostranjen patogen, a posebno je opasan za trudnice,
novorođenčad i imunosuprimirane pacijente. Nažalost, efikasnog cjepivo nema, a postoji
potreba i za efikasnijim i manje toksičnim antiviralnim lijekovima. Glavne prepreke razvoju
novih antiviralnih ljekova i cjepiva jesu: (1) specifičnost za vrstu i (2) praznine u našem
znanju i razumjevanju virusnih gena, interakcijama virusnih gena i domaćina te kako te
interakcije izazivaju bolest. Prva prepreka uspješno se nadvladava korištenjem animalnih
virusa, posebice mišjeg citomegalovirusa (MCMV). S ciljem nadvladavanja druge prepreke u
ovom je radu provedena detaljna analiza transkriptoma mišjeg citomegalovirusa (MCMV) te
analiza transkriptoma stanica domaćina tijekom litičke infekcije citomegalovirusom.
Materijali i metode
Transkriptom MCMV analiziran je na dva načina: klasičnom analizom cDNK knjižnice i
sekvencioniranjem dobivenih klonova te analizom transkriptoma uz pomoć sekvencioniranja
nove generacije (odnosno RNK-sekvencioniranjem, eng. RNASeq) koja omogućava paralelno
praćenje i transkriptoma domaćina uz transkriptom virusa. Analiza transkriptoma domaćina
rezultira vrlo dugačkim listama diferencijalno reguliranih gena iz kojih je teško izvući neko
biološko značenje. Stoga su liste diferencijalno reguliranih gena domaćina podvrgnute analizi
termina genske ontologije (eng. gene ontology analysis odnosno GO analiza) i analizom dereguliranih
bioloških puteva. Transkripcijski kompleksne regije genoma MCMV dodatno su
analizirane Northern hibridizacijom i metodom RT-PCR dok je korelacija između količine
transkripata i proteina odabranih gena analizirana metodom Western blot. Na kraju, funkcija
novog, prekrojenog transkripta MAT (most abundant transcript; najzastupljeniji transkript)
analizirana je uz pomoć reporterskih stanica koje nose aktivacijske Ly49 receptore.
Rezultati
Ovaj rad predstavlja prvu detaljnu analizu transkriptoma MCMV-a korištenjem
komplementarnih metoda analize cDNK knjižnice i RNASeq analizom, a rezultirala je
identifikacijom brojnih novih transkripata MCMV, uključujući i nove prekrojene transkripte
kao i transkripte koji se prepisuju sa intergenskih regija. Ustanovljeno je da najjače izraženi
virusni transkripti imaju nepoznatu funkciju i često su pogrešno anotirani. Najjače izražen
transkript (tzv. MAT transkript) prvi je virusni transkript koji ima i kodirajuću i nekodirajuću
funkciju. Naime, nedavno je pokazano da se na njegovom 3' netranslatiranom kraju (3' UTR,
od eng. 3' untranslated region) nalazi vezno mjesto za staničnu mikro-RNK 18, 84, dok je u
ovom radu pokazano da on također kodira i barem još dva proteina. Uz ove dvije navedene
funkcije, u ovom je radu otkriveno da je 5' netranslatirani kraj (5'UTR) MAT transkripta bitan
virusni faktor kojeg na inificranim stanicama prepoznaju stanice prirodne ubojice pomoću
aktivacijskih receptora Ly49.
Analiza transkriptoma stanica domaćina pokazala je da litička infekcija virusom MCMV
izaziva izrazite promjene u ekspresijskom profilu gena domaćina: ekspresija gotovo trećine
gena miša promijenila se uslijed infekcije virusom MCMV. Geni čija se ekspresija pojačava
tijekom infekcije uglavnom su geni uključeni u upalne i imunološke procese, međutim neki
pripadaju i skupini transkripcijskih faktora te genima povezanim s razvojem i
diferencijacijom. Ovi rezultati u skladu su s dosadašnjim saznanjima o CMV-u kao virusu
koji izaziva upalu te uzrokuje razvojne poremećaje tijekom kongenitalnih infekcija. Brojni
geni čija se ekspresija smanjila tijekom infekcije povezani su sa funkcijama čija je uloga u
infekciji za sada nepoznata poput dugačkih intergenskih nekodirajućih RNK, antisense RNK
ili malih nukleolarnih RNK. GO analiza rezultirala je detekcijom disreguliranih bioloških
puteva koji još do sada nisu bili povezani sa citomegalovirusnom infekcijom, a koji imaju
potencijal rasvjetljavanja nekih nepoznanica u patogenezi citomegalovirusne infekcije.
Zaključci
Jedno od najznačajnijih otkrića u ovome radu jest dokaz izuzetne kompleksnosti
transkriptoma MCMV-a koji dosad nije bio ovako sustavno istraživan niti su postojale
transkriptomske mape. Ova analiza transkriptoma MCMV-a predstavlja važan prvi korak ka
razvoju boljih genomskih mapa i reanotaciji genoma MCMV-a. Analiza odgovora stanica
domaćina na infekciju dala je novi pogled na molekularne interakcije između virusa i
domaćina i otvorila brojna nova područja istraživanja koja imaju potencijal da p pronađu nove
mogućnosti liječenja bolesti izazvanih CMV-om.
Ključne riječi
mišji citomegalovirus, MCMV, transkriptom, ekspresija gena, izbjegavanje imunološkog
Fenilalanin-amonij-lijaza (EC 4.3.1.24) katalizira neoksidativnu deaminaciju L-fenilalanina pri čemu nastaje trans-cimetna kiselina, prekurzor za sintezu većine biljnih fenolnih sekundarnih ...metabolita. Enzim povezuje primarni sa sekundarnim metabolizmom i ima glavnu ulogu pri reguliranju sinteze fenolnih spojeva. Učinak pojačane ekspresije fenilalanin-amonij-lijaze na rast i nakupljanje fenolnih metabolita istražen je u transgenom korijenju ukrasne koprive transformiranom s genom PAL1 iz uročnjaka Arabidopsis thaliana. U transgenom korijenju aktivnost fenilalanin-amonij-lijaze razlikovala se od 67 do 350 % u usporedbi s normalnim korijenjem. Linije s pojačanom ekspresijom enzima rasle su kudikamo slabije, sintetizirale manje ukupnih fenola, ružmarinske kiseline kao glavnoga fenolnog metabolita u tkivu ukrasne koprive te klorogenske kiseline. Povećala se i sinteza kavene kiseline u linijama s pojačanom aktivnosti fenilalanin-amonij-lijaze. Dodatak hidrolizata kazeina i L-tirozina u hranjivu podlogu nije bitno utjecao na sintezu fenolnih produkata i ružmarinske kiseline. Dobiveni rezultati pokazuju da prekomjerna aktivnost fenilalanin-amonij-lijaze, odnosno prekomjerna količina trans-cimetne kiseline, negativno reguliraju rast i sintezu fenolnih produkata.
Cilj: Dati metaanalizu faktora prehrane koji utječu na procese u CNS-u.Metode: Diferencijalni pregled relevantne svjetske znanstvene literature.Rezultati: Izloženi su osnovni prijelazi: homo sapiens ...- homo nticus - homo creans. Dat je pregled utjecaja industrije hrane prema glavnim vrstama prehrambenih namirnica i njihovog općeg mehanizma djelovanja na CNS. Masnoće, ugljikohidrati i bjelančevine te njihov utjecaj na CNS. Osnovni periodi prehrane čovječanstva: prehrana prije 200.000 godina: minerali, vitamini i masnoće; prehrana prije 20.000 godina: uvođenje žitarica; prehrana prije 2000 godina: agrokultura. Prehrana danas: industrija. Antioksidanti, vitamini, lijekovi. Osnovni ciklusi potrebe CNS-a za hranom. Zaključak: Ukazano je na potrebu i glavne odrednice tzv funkcionalne prehrane za kvalitetan kreativni rad.
Ciljevi istraživanja: Karcinom pločastih stanica usne šupljine (KPSUŠ) peti je po učestalosti među zloćudnim tumorima, karakteriziran visokom učestalošću lokoregionalnog povrata bolesti. Budući da ...standardni prognostički pokazatelji ne daju pouzdane informacije o biološkom ponašanju tumora i mogućnosti povrata bolesti traga se za novim markerima koji bi mogli imati prognostičku i terapijsku vrijednost. Osteopontin (OPN) je multifunkcionalni protein koji je nedavno predložen kao prognostički marker u više tipova tumora. OPN sudjeluje u interakciji tumorskih stanica i njihovog mikrookoliša koja igra ključnu ulogu u progresiji i metastaziraju tumora i odražava se na morfologiju tumora u području invazivne tumorske fronte. Tumoru pridruženi makrofagi smatraju se ključnom sastavnicom tumorskog mikrookoliša koja može imati različit utjecaj na rast i metastaziranje tumora.
Cilj našeg istraživanja bio je utvrditi da li povećana ekspresija OPN-a ima ulogu u progresiji KPSUŠ-a te da li je povezana s morfologijom, odnosno gradusom invazivne tumorske fronte (GITF-om). Također, željeli smo ispitati prognostičku vrijednost sadržaja makrofaga u tumorskom mikrookolišu te njegov odnos prema ekspresiji osteopontina.
Ispitanici i metode: U studiju je uključeno 86 bolesnika kojima je u periodu od 2000.-2007. godine dijagnosticiran KPSUŠ na Klinici za maksilofacijalnu i oralnu kirurgiju, KBC-a Rijeka. Tkivne mikroaree tumora obojane su imunohistokemijskom metodom pomoću protutijela koja prepoznaju OPN, Ki67 marker proliferacije te CD68 marker makrofaga i analizirane uz pomoć računalnog programa. Ekspresija osteopontina i sadržaj makrofaga u tumoru uspoređeni su sa standardnim prognostičkim parametrima i preživljavanjem bolesnika te s Ki67 proliferacijskim indeksom. Na cjelovitim histološkim rezovima obojanim s hemalaun-eozinom određen je GITF i uspoređen s kliničkopatološkim parametrima i ekspresijom osteopontina u tumoru.
Rezultati: Ekspresija OPN-a u tumorskim stanicama (t-OPN) značajno je viša u odnosu na epitel nepromijenjene sluznice (p<0.001). Porast ekspresije t-OPN-a praćen je porastom ekspresije OPN-a u stromalnom odjeljku tumora (s-OPN) (p=0.023) te udružen s višim N stadijem (p=0.045) i TNM stadijem (p=0.033). Viši GITF udružen je s N stadijem (p=0.006) i TNM stadijem (p=0.025) te s višom ekspresijom t-OPN-a u površinskom dijelu tumora (p=0.038). U univarijatnoj analizi viša ekspresija t-OPN-a (p=0.022) i viši GITF (p=0.003) udruženi su s kraćim preživljenjem bolesnika. U multivarijatnoj analizi usporedbom sa standardnim prognostičkim pokazateljima ekspresija t-OPN-a se pokazala nezavisnim prediktivnim čimbenikom preživljenja (p=0.048). Uključivanjem GITF-a u multivarijatnu analizu ekspresija t-OPN-a gubi status nezavisnog prediktivnog čimbenika (p=0.085), dok ga GITF pokazuje (p<0.001). Ekspresija t-OPN-a nije bila udružena s tradicionalnim histološkim gradusom (p=0.260), proliferacijskim indeksom (p=0.145) niti sa sadržajem makrofaga u tumoru (p=0.904). Ekspresija s-OPN-a i sadržaj makrofaga u tumoru nisu bili udruženi s prognostičkim parametrima preživljenjem bolesnika. Bolesnici s visokom ekspresijom t-OPN-a i visokim sadržajem makrofaga u tumoru živjeli su značajno kraće u odnosu na one s niskim pojedinačnim ili oba parametra (p=0.014).
Zaključak: Povećana ekspresija OPN-a kao pojedinačni parametar te udružena s visokim sadržajem makrofaga može poslužiti kao čimbenik predviđanja loše prognoze, odnosno kraćeg preživljavanja bolesnika s KPSUŠ-om. Gradus ITF-e također predviđa tijek bolesti i ima veću vrijednost u odnosu na tradicionalni histološki gradus. Određivanje ovih parametara u patohistološkoj dijagnostici karcinoma pločastih stanica usne šupljine omogućuje prepoznavanje skupine bolesnika s većim rizikom za povrat bolesti kojima bi koristile dodatne metode liječenja.
Objectives: Squamous cell carcinoma of the oral cavity (SCCOC) is the fifth most common among malignant tumors, characterized by a high incidence of locoregional recurrence. Since the standard prognostic indicators do not provide reliable information on the biological behavior of the tumor and the possibility of recurrence, the search for new markers that may have prognostic and therapeutic value is needed. Osteopontin (OPN) is a multifunctional protein that has recently been proposed as a prognostic marker in multiple tumor types. It is involved in the interaction of tumor cells and their microenvironment, which plays a key role in the tumor progression and metastasis and is reflected in the morphology of the tumor in the area of invasive tumor front. Tumor associated macrophages are considered to be a key component of the tumor microenvironment, which can have a different impact on the growth and metastasis of tumors.
The aim of our study was to determine whether increased expression of osteopontin plays a role in the progression SCCOC's and whether it is related to the morphology of the invasive tumor front. Also, we wanted to examine the prognostic value of the macrophage content in the tumor microenvironment and its relationship to osteopontin expression.
Patients and Methods: The study included 86 patients that were surgically treated for SCCOC between 2000 and 2007 at the Department of Maxillofacial and Oral Surgery, Clinical Hospital Center Rijeka. Tumor microaree were stained by immunohistochemical methods using antibodies that recognize OPN, Ki67 proliferation marker, and CD68 macrophage marker, and analyzed by using a computer program. Expression of osteopontin and macrophage content in the tumor were compared with the standard prognostic parameters and survival of patients, as well as with the Ki67 proliferative index. The whole tumor-tissue sections, stained with hemalaun-eosin, were evaluated for the invasive tumor front grade (GITF) and compared with the clinicopathological parameters and osteopontin expression.
Results: The expression of OPN in tumor cells (t-OPN) was significantly higher compared to normal oral mucosa (p<0.001). Increase in the t-OPN expression was followed by the increased OPN expression in the stromal compartment of the tumor (s-OPN) (p=0.023), and associated with higher N stage (p=0.045), and TNM stage (p=0.033). Higher GITF was associated with higher N stage (p=0.006) and TNM stage (p=0.025), and a higher t-OPN expression in the superficial part of the tumor (p=0.038). In univariate analysis higher t-OPN expression (p=0.022) and a higher GITF (p=0.003) were associated with shorter survival of patients. In multivariate analysis, by comparing with standard prognostic factors, t-OPN expression was independent predictive factor for survival (p=0.048). When the GITF was included, t-OPN lost the status of an independent predictor (p=0.085), while GITF gained the status (p<0.001). Expression of t-OPN was not associated with traditional histological grade (p=0.260), Ki67 proliferative index (p=0.145) nor with the macrophage content in the tumor (p=0.904). Expression of the s-OPN and macrophage content in the tumor were not associated with prognostic parameters and survival of patients. Patients with combined high t-OPN expression and the high macrophage content in the tumor lived significantly shorter than those with low individual or both parameters (p=0.014).
Conclusion: Increased OPN expression as a single parameter or associated with a high macrophage content can serve as a predicting factor of poor prognosis, and shorter survival in patients with SCCOC. ITF grade also predicts the course of the disease and has a better prognostic value compared to traditional histological grade. Determination of these parameters in pathohistological diagnosis of squamous cell carcinoma of the oral cavity allows the identification of patients at high risk for relapse which would benefit from additional treatment methods.
Uvod: Analiza genske ekspresije zasnovana na mikropostrojima je tijekom proteklog desetljeća prepoznata kao koristan alat od strane znanstvene zajednice, ali nije ušla u rutinsku dijagnostičku ...primjenu. Kako je skupa i podložna značajnim eksperimentalnim varijacijama, na trenutnom tehnološkom stupnju razvoja ta tehnologija nije prikladna za rutinske kliničko-dijagnostičke primjene. U svrhu premošćivanja jaza između mogućnosti navedene tehnologije i potreba kliničke dijagnostike razvijeni su različiti računalni alati za smanjenje dimenzionalnosti. Njihova osnovna svrha je odabir malog skupa kandidata za biomarkere iz ogromnog skupa sadržanog u profilima genske ekspresije prikladnog za rutinsko postavljanje dijagnoze.
Cilj: Slučajna šuma (engl. Random Forest, RF) se nametnula kao pouzdan pretkazatelj. Ipak, njene su mogućnosti u odabiru relevantnih gena privukle manje pažnje. Cilj ove studije je evaluacija prikladnosti na RF-u zasnovanoga odabira biomarkera iz skupova genskih profila. Tri takva skupa, preuzeta iz literature, prikupljena tijekom manjih kliničkih pokusa izabrana su u navedenu svrhu.
Rezultati: Dobiveni rezultati ukazuju da RF može lako identificirati dobre uni-varijatne klasifikatore, tj. pojedinačne biomarkere kada je složenost skupa mala. Za nešto složenije probleme pouzdani dvodimenzionalni klasifikator može se također pronaći. Ipak, ako je odnos između dijagnoze/prognoze i profila genske ekspresije vrlo složen ili ako je skup premalen, na RF-u zasnovano smanjenje dimenzionalnosti ne omogućava odabir pouzdanog skupa kandidata za biomarkere.
Zaključci: Unutar ograničenja zadanih složenošću skupa RF predstavlja prikladan alat za izbor kandidata za biomarkere.
Rad nastoji ispitati sociokulturnu pozadinu i psihosocijalne posljedice seksualnih stilova urbanih žena u Hrvatskoj. Za razliku od u društvenim znanostima prevladajućeg naglaska na rizicima ili ..."tamnoj strani” ljudske spolnosti, ova je analiza usmjerena k razumijevanju pozitivnih aspekata spolnosti. Rasprava se temelji na empirijskom istraživanju seksualnog ponašanja i stavova o spolnosti provedenom 1998. godine na uzorku od 580 urbanih žena u dobi 18-48 godina. Bihevioralno operacionalizirani, seksualni stilovi su označeni kao standardni, tranzicijski i nestandardni seksualni stil. Statistička analiza potvrđuje njihovu sociokulturnu ukorijenjenost (različite prediktorske strukture). U drugom dijelu rada, autor raspravlja izravne veze između seksualnih stilova i seksualne komunikacije, raspona aktivnosti i zadovoljstva (nestandardni je seksualni stil vezan uz najveću razinu užitka, ali i povećani rizik psihičkih troškova uzrokovanih normativnim pritiscima), kao i podrijetlo razlika u izbom seksualnog stila. Potonje valja sagledati u svjetlu suvremenih kulturnih promjena koje karakterizira trend permisivnosti i deklarativni seksualni egalitarizam.
Galektin-3, lektin koji specifično prepoznaje -galaktozidne strukture, djeluje kao jak
proinflamatorni signal koji modulira staničnu proliferaciju i adheziju, kemotaksiju,
fagocitozu te sintezu ...upalnih medijatora. Mnoge tvari s imunomodulatornim djelovanjem
djeluju na signalne puteve u kojima sudjeluju i transkripcijski faktori čija su vezna mjesta
prisutna u promotorskoj regiji gena za galektin-3 (LGALS3). Zbog česte uporabe ovih tvari u
terapijske svrhe te važnosti galektina-3 u fiziologiji stanica monocitno-makrofagne loze, u
ovom je radu ispitan utjecaj nesteroidnih (aspirina i indometacina) i steroidnih
(hidrokortizona i deksametazona) tvari s imunomodulatornim djelovanjem primijenjenih u
različitim terapijskim rasponima na ekspresiju LGALS3 i galektina-3 u nediferenciranim i
diferenciranim stanicama monocitne stanične linije THP-1 tijekom 72-satnog kultiviranja.
Niti jedna od ispitanih tvari u primijenjenim koncentracijama tijekom 72 sata kultiviranja
nije citotoksično djelovala na stanice. Količina mRNA za galektin-3 određena je primjenom
metode RT-PCR praćene analizom na uređaju AbiPrism 310 Genetic Analyser, a količina
galektina-3 u staničnim homogenatima Western-imunoblot metodom. Rezultati su pokazali
da ispitivane tvari mijenjaju ekspresiju LGALS3 i galektina-3 te da njihovi učinci ovise o
diferenciranosti stanica, koncentraciji primijenjene tvari kao i vremenu izlaganja. U
nediferenciranim stanicama sve ispitane tvari svih primijenjenih koncentracija inhibiraju
ekspresiju i LGALS3 i galektina-3, a inhibitorni je učinak u korelaciji s vremenom izlaganja.
Tijekom 48-satne preobrazbe nediferenciranih stanica u diferencirane, dolazi do snažne
indukcije ekspresije i LGALS3 (3 puta) i galektina-3 (3,5 puta). U diferenciranim stanicama
sve ispitivane tvari u početku inhibiraju ekspresiju LGALS3 nakon čega dolazi do uspostave
konstitutivne razine mRNA, dok na proteinskoj razini dugotrajnije izlaganje ispitivanim
tvarima potiče ekspresiju galektina-3. U oba slučaja, intenzitet promjena kao i njihov
vremenski slijed ovise o vrsti i koncentraciji primijenjene tvari. Na temelju dobivenih
rezultata moguće je zaključiti da primijenjene tvari s imunomodulatornim djelovanjem
utječu na različite signalne puteve kao i mehanizme regulacije ekspresije galektina-3 na
genskoj i proteinskoj razini, a da promjene ovise o vrsti i koncentraciji tvari te vremenu
izloženosti, kao i o diferencijacijskom stupnju stanica. Dobiveni rezultati predstavljaju važan
korak u razumijevanju djelovanja tvari s imunomodulatornim djelovanjem na galektin-3 u
stanicama monocitno-makrofagne loze, a time i na njihove brojne fiziološke funkcije.
Galectin-3, a β-galactoside binding lectin, acts as a strong pro-inflammatory signal that
modulates cell proliferation and adhesion, chemotaxis, phagocytosis and synthesis of
inflammatory mediators. Many immunomodulatory drugs affect signaling pathways that
comprise transcriptional factors which binding sites are present in the promoter region of
galectin-3 gene (LGALS3). Because of the frequent therapeutic application of
immunomodulatory drugs and the importance of galectin-3 in the physiology of monocytes
and macrophages, we investigated effects of non-steroidal (aspirin and indomethacin) and
steroidal (hydrocortisone and dexamethasone) immunomodulatory drugs, applied in
different therapeutic ranges, on the expression of LGALS3 and galectin-3 in nondifferentiated
and differentiated cells of monocytic THP-1 cell-line during 72 hours of
cultivation. None of the studied drugs in applied concentrations during 72 hours of
cultivation had cytotoxic effect on the cells.
The targeted mRNA level was evaluated using relative RT-PCR technique and analysis on
the AbiPrism 310 Genetic Analyser. Galectin-3 expression in cell homogenates was
determined by western-immunoblot analysis. The results showed that the chosen
immunomodulatory drugs affect LGALS3 and galectin-3 expression and that their effects
depend on cell differentiation level, concentration of the applied drug, as well as time of
exposure. In undifferentiated cells all of the studied drugs (in all applied concentrations)
inhibit expression of LGALS3 and galectin-3, and inhibitory effect correlates with time of
exposure. Differentiation of monocytic THP-1 cells into macrophages during 48-hours
strongly induces expression of LGALS3 (3 times) and galectin-3 (3,5 times). In differentiated
cells, all studied drugs inhibited LGALS3 expression at the beginning, but during further
incubation constitutive level of galectin-3 mRNA was reestablished. On the protein level,
prolonged exposure to all applied drugs induce galectin-3 expression. Intensity and timecourse
of both, mRNA and protein level changes depend on drug type and on applied
concentration. These findings indicate that the applied immunomodulatory drugs affect
different signaling pathways and mechanisms of regulation of galectin-3, on both mRNA
and protein level. The changes depend on drug type and concentration, time of exposure as
well as cell differentiation level. The results obtained in this study represent important step
in the understanding of the effects of immunomodulatory drugs on galectin-3 in
monocytes/macrophages, hence on their numerous physiological roles.
