Macrophages of the reticuloendothelial system and brain act as major reservoir for HIV because of their long term survival after HIV infection and ability to spread virus particles to bystander CD4 ...positive lymphocyte cells. The objective of the present study was to investigate mannan-coated nanoparticles for macrophage targeting of didanosine. Different didanosine loaded nanoparticles were prepared using the double desolvation technique and were characterized in vitro, ex vivo and in vivo. Results of the ex vivo cellular uptake study indicated 5--fold higher uptake of didanosine from the mannan-coated nanoparticles formulation (62.5 ± 5.4%) by the macrophages in comparison with didanosine solution in phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4) (12.1 ± 2.3%). The better cellular uptake from the nanoparticles formulation was further confirmed by fluorescence microscopy using hydrophilic 6-carboxyfluorescein as a marker. Results of the quantitative biodistribution study showed 1.7, 12.6 and 12.4 times higher localization of didanosine in the spleen, lymph nodes and brain, respectively, after administration of mannan-coated nanoparticles compared to that after injection of didanosine solution in PBS (pH 7.4). Results of the present study showed that the mannan-coated nanoparticles targeted didanosine to the macrophage by mannosyl receptor mediated endocytosis.
Makrofagi retikuloendotelnog sustava i mozak djeluju kao glavni rezervoari za HIV zbog njihovog dugoročnog preživljavanja nakon infekcije HIV-om i sposobnosti da usmjere virusne čestice u CD4 pozitivne limfocite. Cilj rada bio je ispitati nanočestice obložene mananom za ciljanu isporuku didanozina u makrofage. Koristeći metodu dvostruke desolvatacije pripravljene su različite nanočestice s didanozinom te su zatim karakterizirane in vitro, ex vivo i in vivo. Rezultati ex vivo ispitivanja ukazuju da je unos didanozina u makrofage 5 puta veći iz nanočestica obloženih mananom (62,5 ± 5,4%) u usporedbi s otopinom didanozina u fosfatnom puferu (PBS, pH 7,4) (12,1 ± 2,3%). Bolji celularni unos iz nanočestica potvrđen je fluorescentnom mikroskopijom koristeći hidrofilni 6-karboksifluorescein kao marker. Rezultati kvantitativne biodistribucije pokazuju da je lokalizacija didanozina u slezeni, limfnim čvorovima i mozgu 1,7, 12,6, odnosno 12,4 puta veća nakon primjene nanočestica obloženih mananom nego nakon primjene otopine didanozina u PBS-u (pH 7,4). Nanočestice s mananom usmjeravaju didanozin u makrofage procesom endocitoze u kojoj posreduju receptori za manozu.
Makrofagi retikuloendotelnog sustava i mozak djeluju kao glavni rezervoari za HIV zbog njihovog dugoročnog preživljavanja nakon infekcije HIV-om i sposobnosti da usmjere virusne čestice u CD4 ...pozitivne limfocite. Cilj rada bio je ispitati nanočestice obložene mananom za ciljanu isporuku didanozina u makrofage. Koristeći metodu dvostruke desolvatacije pripravljene su različite nanočestice s didanozinom te su zatim karakterizirane in vitro, ex vivo i in vivo. Rezultati ex vivo ispitivanja ukazuju da je unos didanozina u makrofage 5 puta veći iz nanočestica obloženih mananom (62,5 ± 5,4%) u usporedbi s otopinom didanozina u fosfatnom puferu (PBS, pH 7,4) (12,1 ± 2,3%). Bolji celularni unos iz nanočestica potvrđen je fluorescentnom mikroskopijom koristeći hidrofilni 6-karboksifluorescein kao marker. Rezultati kvantitativne biodistribucije pokazuju da je lokalizacija didanozina u slezeni, limfnim čvorovima i mozgu 1,7, 12,6, odnosno 12,4 puta veća nakon primjene nanočestica obloženih mananom nego nakon primjene otopine didanozina u PBS-u (pH 7,4). Nanočestice s mananom usmjeravaju didanozin u makrofage procesom endocitoze u kojoj posreduju receptori za manozu.
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Cilj istraživanja: Prvenstveni cilj ovoga rada bila je uspostava modela za praćenje putovanja MHC molekula I. razreda, ali i ostalih ...površinskih molekula, u neinficiranim stanicama i u stanicama inficiranim MCMV divljim-tipom ili različitim mutantama virusa MCMV kojima nedostaje/ju geni čija je funkcija u literaturi opiasana. Poznato je da se MHC-I molekule puno brže uklanjaju sa površine inficirane stanice nego sa površine neinficirane stanice, upravo je stoga mjerena kinetika uklanjanja površinskih MHC-I molekula. Također su istražena načela ulaska MHC-I molekula u put recikliranja te njihov ulazak u degradacijski put, odnosno u kasne endosome.
Materijal i metode: U pokusima smo koristili staničnu liniju mišjih embrionalnih fibroblasta (MEF-a). U istraživanjima smo koristili neinficirane i inficirane stanice te određivali možebitne razlike. Slijedeće rekombinante virusa MCMV su korištene: Δm138-MCMV (ΔMC95.15) s delecijom fcr1 (m138) gena , Δie1-MCMV s delecijom egzona 4 ie1 gena, Δie2-MCMV s delecijom ie2 (m128) gena, Δie3-MCMV s delecijom ie3 gena, Δm4m6m152-MCMV s delecijom tri poznata imunoinvaziva koji utječu na sazrijevanje MHC-I molekula te MCMV divlji-tip, koji je kao i gotovo sve MCMV-delecijske mutante proizvedene i umnažan na kulturi MEF porijeklom iz BALB/c miševa. Δie3-MCMV uzgajan je na komplementarnoj NIH3T3 BAM25 staničnoj liniji. U svrhu praćenja MHC-I molekula koristili smo monoklonska protutijela (mPt): MA-215 za konformirane Kd i 34-5-8S za konformirane Dd. Transferinski receptor (TfR) smo pratili pomoću mPt R17, a molekule GM1 pomoću obilježene podjedinice B kolera toksina. Kako bismo utvrdili koji su putovi uključeni u ulazak molekula u stanicu, endosomalno putovanje, recikliranje i degradaciju, koristili smo različite kemijske inhibitore. Kinetiku internalizacije pratili smo protočnom citometrijom, a unutarstanično putovanje konfokalnom mikroskopijom koristeći princip površinskog vezivanja odgovarajućeg mPt i njegovog praćenja nakon određene kinetike internalizacije. Internalizirane molekule kolokalizirali smo međusobno, te s određenim endosomalnim markerima. Recikliranje molekula pratili smo pomoću dva različita protokola metodom protočne citometrije i konfokalne mikroskopije. U cilju identifikacije sudbine površinskih proteina, koristili smo metode površinske biotinilacije, imunoprecipitacije, elektroforeze na poliakrilamidnim gelovima (SDS-PAGE), Western-blota i kemiluminiscencije.
Rezultati: Obrazac izražaja MHC-I molekula kako na površini tako i u unutrašnjosti stanice mijenja se u uvjetima MCMV-infekcije. MHC-I molekule nishodno se reguliraju s površine inficirane stanice procesom koji nije isključivo za njih specifičan, potom se nakupljaju u hibridnom odjeljku koji je pozitivan na mnogobrojne biljege unutarstaničnih endosomalnih putova ili odjeljaka (EEA-1+, TfR, GM130). MHC-I molekule internaliziraju se brže u inficiranim nego u neinficiranim stanicama putem koji je neovisan o dinaminu. Niti jedan od ispitivanih kemijskih inhibitora endocitoze (klorpromazin, imipramin, filipin i AlF4-) nije značajnije blokirao internalizaciju MHC-I molekula. Nishodna regulacija MHC-I molekula s površine inficirane stanice je proces 5-6 puta brži od konstitutivne internalizacije te je najvjerojatnije induciran virusnim proteinima. MCMV usmjerava MHC-I molekule nakon internalizacije sa površine stanice, u odjeljak u kojem ih i nakuplja. Internalizirane MHC-I molekule nalaze se u mjehurićima koji ne mogu otpustiti EEA-1 odnosno rane endosomalne membrane, što bi bio jedan od razloga njihovog odgođenog ulaska u endolizosomalni put u proces degradacije. Iz odjeljka koji se formira u MCMV-inficiranim stanicama u kojem se nakupljaju mnogobrojne internalizirane molekule moguće je recikliranje, ali je kapacitet recikliranja smanjen. Retencijski odjeljak sadrži većinom membrane ranih endosoma s obzirom da samo mali dio molekula može reciklirati pri 16 °C i uz prisustvo LY294002, što su karakteristike jukstanuklearnog reciklirajućeg odjeljka. Najvjerojatniji uzrok promjene recikliranja u MCMV-inficiranim stanicama je smanjenje ukupne količine Rab11 molekule te smanjenje mogućnosti stvaranja reciklirajućh membranskih domena. Ulazak u put degradacije za mnoge je molekule odgođen u MCMV-inficiranim stanicama neovisno o njihovu putu ulaska u stanicu te je otežano formiranje endolizosomalnih mebrana. U MCMV-inficiranim stanicama dolazi do promjena u izražavanju pojedinih molekula Rab. Razina Rab5 u inficiranim stanicama ne smanjuje se poput ostalih molekula Rab, te dolazi do otežane pretvorbe Rab5 u Rab7, kao i do smanjenja razine Rab7 u inficiranim stanicama, što za posljedicu ima odgođeno odvođenje molekula u put degradacije. Za nishodnu regulaciju MHC-I molekula s površine inficirane stanice odgovoran je ili ie3 gen ili oni geni koji su pod kontrolom ie3 gena. m06/gp48 protein odgovoran je za usmjeravanje kako novo-sintetiziranih tako i internaliziranih MHC-I molekula u proces degradacije.
Zaključak: Endosomalno remodeliranje je mehanizam evoluirao u svrhu MCMV morfogeneze u inficiranih stanica, jer ne utječe samo na MHC-I molekule, nego i na druge endocitirane molekule koje koriste različite endosomalne putove. Ovo remodeliranje se nadopunjuje blokiranjem izlaza MHC-I molekula iz sekretnog puta što dovodi do ubrzanog gubitka MHC-I molekula s površine stanice u ranim razdobljima infekcije.- Objectives: The aim of this study was to establish experimental model that will enable us to follow constitutive internalization of MHC class I. molecules and other cell surface expressed molecules in uninfected or in the cell infected with either MCMV wild-type or with different MCMV deletion mutant. It is well known that MHC-I molecules are downregulated with higher rate from infected cell than from uninfected cell, so we measured the kinetics of MHC-I molecules downregulation. Additionally, we investigated the principles of MHC-I molecules endocytosis, their recycling pathway and also MHC-I molecules entrance in degradation pathway respectively, in late endosomes.
Material and methods: Experiments were performed on murine embrional fibroblasts (MEFs). In our experiment we used uninfected and cell infected with numerous MCMV: Δm138-MCMV (ΔMC95.15) with the deletion of the fcr1 (m138) gene, Δie1-MCMV with the deletion of exon 4 ie1 gene, Δie2-MCMV with the deletion of the ie2 (m128) gene, Δie3-MCMV with the deletion of the ie3 gene, Δm4m6m152-MCMV with deletion of three well known immunoevasins that affect MHC-I molecules maturation. The MCMV wild-type and MCMV deletion mutants were propagated on BALB/c MEFs. The Δie3-MCMV was grown on the complementing cell line NIH3T3 BAM25. In order to follow MHC-I molecules, we have used a monoclonal antibodies (mAbs): MA-215 for conformed Kd molecules and 34-5-8S for conformed Dd molecules. Transferrin receptor (TfR) was followed by mAb R17, and GM1 molecules with labeled cholera toxin B subunits. In order to determine which pathways are involved in endocytosis, endosomal trafficking, recycling and degradation of these molecules, we used different chemical inhibitors of endocytosis. The kinetics of surface molecules was followed by flow citometry and their intracellular trafficking by confocal microscopy after binding of appropriate mAbs. Internalized molecules were colocalized with each other as well as with specific endosomal markers. After rearranging two different protocols from the literature we followed molecules recycling by flow citometry and confocal microscopy. In order to monitor the kinetics of degradation, we used the method of surface biotinilation and imunoprecipitation, electrophoresis on polyacrylamide gels (SDS-PAGE), Western-blot and chemiluminiscence.
Results: The pattern of MHC-I molecules expression on the cell surface and intracellular was changing during the infection. MHC-I molecules were downregulated from the surface of infected cell with process that is not specific for them since the other cell surface expressed molecules have also been downregulated. After their downregulation MHC-I molecules were accumulated in hybrid compartment which is positive on various markers of endosomal pathways and compartments (EEA-1+, TfR, GM130). Kinetics of MHC-I molecules internalization were significantly faster in infected cells than in uninfected cells following the pathway that is dynamin independent. Neither of the tested chemical inhibitors (chlorpromazine, imipramin, filipin and AlF4-) did not block internalization of MHC-I molecules. Downregulation of cell surface expressed MHC-I molecules is process that is 5-6 times faster than constitutive internalization and it is probably induced with viral proteins. MCMV directs after internalization from the cell surface MHC-I molecules in the retention compartment. Internalized MHC-I+ vesicles are unable to release EEA-1 respectively early endosomal membrane what could clarify their delayed entry into endolysosomal route in the process of degradation. In MCMV-infected cells many of the internalized molecules have been accumulated in the retention compartment from which recycling was possible although the capacity of the recycling was reduced. Retention compartment contains most of the membrane of early endosomes since only small amount of the molecules was capable to recycle on 16 °C even in the presence of LY294002, which are the characteristics juxtanuclear recycling compartment. The most likely cause of changes in the recycling of MCMV-infected cells was reduction of the total amount of Rab11 molecules that decreased the possibility of creating recycling membrane domains. Degradation pathway has been affected in MCMV-infected cells for numerous molecules regardless to their pathway of entry into the cell. Besides the amount of the Rab11 molecules in MCV-infected cells the level of other Rab molecules was altered. The level of Rab5 in infected cells did
Provider: - Institution: - Data provided by Europeana Collections- Cilj istraživanja: Prvenstveni cilj ovoga rada bila je karakterizacija konstitutivne internalizacije konformiranih i nekonformiranih ...MHC molekula I razreda, odnosno karakterizacija njihove endocitoze, recikliranja i degradacije. Poznato je da razlika u konformaciji MHC-I molekula uzrokuje njihovo razdvajanje u sekretornom putu. Stoga su u ovom radu istražena načela njihova razdvajanja tijekom endocitoze i putovanja kroz endosomalne odjeljke. Na temelju eksperimentalnih mjerenja cilj nam je bio i uspostavljanje matematičkog modela za kinetičku analizu endosomalnih putova.
Materijal i metode: Istraživanja smo proveli na mišjim fibroblastima J26 transficiranim s genom koji kodira molekule HLA-B7 (J26-B7), HLA-Cw6 (J26-Cw6) ili HLA-G1 (J26-G1), na humanoj tumorskoj staničnoj liniji HeLa koja konstitutivno izražava sve klasične HLA molekule I razreda, Balb 3T3 mišjim fibroblastima, te L-Ld stanicama (mišji fibroblasti transficirani genom za molekule H2-Ld). Za praćenje MHC molekula I razreda koristili smo monoklonska protutijela (mPt): mPt W6/32, koje prepoznaje sve klasične konformirane HLA molekule i konformirane HLA-G1 molekule, mPt HC-10, koje prepoznaje sve klasične nekonformirane HLA molekule, mPt MEM-G/1 koje prepoznaje nekonformirane molekule HLA-G1, mPt 30-5-7 koje prepoznaje konformirane H2-Ld molekule, te mPt 64-3-7 koje prepoznaje nekonformirane H2-Ld molekule. Transferinski receptor (TfR) smo pratili pomoću mPt R17, a molekule GM1 pomoću obilježene podjedinice B kolera toksina. Neionski detergent Triton X-100 nam je poslužio za ispitivanje nazočnosti molekula u lipidnim splavima. Oponašanjem uvjeta endosomalnog pH izvan stanice, utvrdili smo promjenu konformacije MHC molekula I razreda u zadanim uvjetima. Kako bismo utvrdili koji putovi su uključeni u endocitozu, endosomalno putovanje, recikliranje i degradaciju ovih molekula, koristili smo različite kemijske inhibitore. Kinetiku internalizacije pratili smo protočnom citometrijom, a unutarstanično putovanje konfokalnom mikroskopijom koristeći princip površinskog vezivanja odgovarajućeg monoklonskog protutijela i njegovog praćenja nakon određene kinetike internalizacije. Internalizirane molekule kolokalizirali smo međusobno, te s određenim endosomalnim markerima. Recikliranje molekula pratili smo modificirajući tri različita protokola iz literature i to protočnom citometrijom i konfokalnom mikroskopijom. U cilju praćenja kinetike degradacije koristili smo metodu površinske biotinilacije, te imunoprecipitacije, elektroforeze na poliakrilamidnim gelovima (SDS-PAGE), Western-blota i kemiluminiscencije. Za matematičko modeliranje i simulacije endocitoznih procesa koristili smo programski paket Mathematica (Wolfram Research Europe Ltd.). Rezultati: Konformirane MHC-I molekule dobro su izražene na staničnoj površini za razliku od nekonformiranih molekula. Djelovanjem kiselog pH (fiziološke i nefiziološke vrijednosti) izražaj konformiranih MHC-I molekula pada, dok izražaj nekonformiranih raste. Različite konformacije MHC-I molekula u ustaljenom stanju samo djelomično se kolokaliziraju unutar stanice i to prvenstveno u ranim endosomalnim odjeljcima. Niti jedan od ispitivanih kemijskih inhibitora (klorpromazin, Dynasore, filipin i AlF4-) nije blokirao internalizaciju MHC-I molekula. Nekonformirane MHC-I molekule se znatno brže internaliziraju i degradiraju od konformiranih MHC-I molekula što je najvjerojatnije posljedica činjenice da se konformirane MHC-I molekule usmjeravaju u reciklirajuće odjeljke, a nekonformirane MHC-I molekule u degradacijski put. Tome u prilog govori rezultat da se konformirane MHC-I molekule nakon internalizacije nalaze prvenstveno u jukstanuklearnom području zajedno s Tf/TfR i Rab11 GTPazom, dobro poznatim biljezima jukstanuklearnih reciklirajućih endosoma. Internalizirane konformirane MHC-I recikliraju s učinkovitošću od oko 30%, znatno manje od TfR/Tf koji recikliraju s učinkovitošću od 85-99%, što ukazuje da konformirane MHC-I molekule ulaze u zasebne reciklirajuće odjeljke. Ubrzo nakon internalizacije konformirane i nekonformirane MHC-I se kolokaliziraju s biljegom ranih endosoma (EEA-1), kao i međusobno, ali nedugo zatim stupanj kolokalizacije se smanjuje što znači da se razmjerno brzo razdvajaju. To razdvajanje blokira LY294002 (blokator PI3K), kao i konkanamicin A (blokator endosomalne H+ crpke). Djelovanjem Tx-ispiru se konformirane MHC-I molekula i TfR sa staničnih membrana, dok se nekonformirane MHC-I molekule i GM1 ne ispiru. Matematičkim modeliranjem potvrđeni su eksperimentalni rezultati, te izračunati slijedeći parametri: stopa endocitoze, stopa recikliranja i stopa degradacije.
Zaključak: Konformirane MHC-I molekule kao i TfR nalaze se u detergent-osjetljivim membranskim mikrodomenama za razliku od nekonformiranih MHC-I molekula i GM1, kako na staničnoj površini tako i u unutrašnjosti stanice. Internalizacija MHC-I molekula nije ovisna o klatrinu i dinaminu, već najvjerojatnije o funkciji malih GTPaza (Cdc42 i Arf6). Sortiranje, odnosno odvajanje endosomalnih putova konformiranih i nekonformiranih MHC-I molekula odvija se na razini ranih endosoma i ovisno je o pH. Nakon sortiranja konformirane MHC-I molekule se prvenstveno usmjeravaju u recikliranje, a nekonformirane u degradaciju.- Objectives: The aim of this study was to characterize constitutive internalization of conformed and non-conformed MHC class I molecules, with respect to their endocytosis, recycling and degradation. Conformational difference is known to segregate MHC-I molecules in secretory pathway. Therefore, we investigated endocytic pathway and putative segregation principles of these molecules during endocytic trafficking. Additionally, based on experimental measurements our goal was to establish a mathematical model for kinetics analysis of endosomal transport.
Material and methods: Experiments were performed on murine fibroblasts J26 transfected with HLA-B7 (J26-B7), HLA-Cw6 (J26-Cw6) or HLA-G1 molecules (J26-G1), on human HeLa cell line that constitutively expresses all classical HLA class I molecules, Balb 3T3 murine fibroblasts, and murine L cells stably transfected with Ld molecules (L-Ld). In order to follow MHC class I molecules, we used the following monoclonal antibodies (mAb): mAb W6/32 for all classical conformed HLA-I molecules and for conformed HLA-G1 molecules, mAb HC-10 for all classical non-conformed HLA-I molecules, mAb MEM-G/1 for non-conformed HLA-G1 molecules, mAb 30-5-7 for conformed H2-Ld molecules, and mAb 64-3-7 for non-conformed H2-Ld molecules. Transferrin receptor (TfR) was followed by mAb R17, and GM1 molecules with labeled cholera toxin B subunits. Non-ionic detergent Triton X-100 was used for testing the presence of molecules in lipid rafts. Conditions of endosomal pH were simulated outside the cell and the conformation changes of MHC-I molecules were under given conditions. In order to determine which pathways are involved in endocytosis, endosomal trafficking, recycling and degradation of these molecules, we used different chemical inhibitors. The kinetics of surface molecules was followed by flow citometry and their intracellular trafficking by confocal microscopy after binding of appropriate mAbs. Internalized molecules were colocalized with each other as well as with specific endosomal markers. After rearranging three different protocols from the literature we followed molecules recycling by flow citometry and confocal microscopy. In order to monitor the kinetics of degradation, we used the method of surface biotinilation and imunoprecipitation, electrophoresis on polyacrylamide gels (SDS-PAGE), Western-blot and chemiluminiscence. For mathematical modeling and simulation of endocytic processes we used a software package Mathematica (Wolfram Research Europe Ltd.). Results: Conformed MHC-I molecules are well expressed on the cell surface, unlike non-conformed molecules. Expression of conformed MHC-I molecules decreases due to treatment with acid pH (physiological and non- physiological values), while expression of non-conformed MHC-I molecules increases. Different conformations of MHC-I molecules in steady state conditions are only partially colocalized intracellular, primarily in the early endosomal compartments. Neither of the tested chemical inhibitors (chlorpromazine, Dynasore, filipin and AlF4-) did not block internalization of MHC-I molecules. Kinetics of internalization, as well as degradation of non-conformed MHC-I molecules are significantly faster than kinetics of conformed MHC-I molecules, due to fact that conformed MHC-I molecules recycle, unlike non-conformed molecules. These thesis are supported also by the finding that conformed MHC-I molecules after internalization are directed primarily in juxtanuclear region where they colocalize with Tf/TfR, and with Rab11. Internalized conformed MHC-I molecules recycle with 30% efficiency, while TfR/Tf recycling efficiency is 85-99%. Shortly after internalization conformed and non-conformed MHC-I molecules colocalize with early endosomal marker EEA-1, as well as to each other, but soon thereafter the level of colocalization decreases. This separation is blocked due to the influence of LY294002 (inhibitor of PI3K) or concanamycin A (inhibitor of endosomal H+ pump). Treatment with Tx-100 removes conformed MHC-I molecules and TfR from the cell membranes, while non-conformed MHC-I molecules and GM1 are resistant to the Tx-100 treatment. Experimental results are confirmed by mathematical modeling, by which the following parameters are also calculated: the rate of endocytosis, the rate of recycling and the rate of degradation.
Conclusion: Conformed MHC-I molecules, as well as transferrin receptor are localized in detergent-sensitive membrane micro domains, while non-conformed MHC-I molecules and GM1 are localized in detergent-resistant membrane micro domains, not only on the cell surface, but also intracellu
PDF
