Neopterin as a marker of cellular immunological response Michalak, Łukasz; Bulska, Magdalena; Strząbała, Karolina ...
Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej,
2017-Aug-24, 2017-8-24, 20170824, Letnik:
71, Številka:
1
Journal Article
Recenzirano
Odprti dostop
Neopterin is a pyrazino-pyrimidine compound that belongs to the pteridine group. It is known to be a biochemical marker associated with cell-mediated immunity. It is produced by human ...monocytes/macrophages and dendritic cells from guanosine triphosphate (GTP) upon stimulation with interferon gamma (IFNγ), which is released by activated limphocytes Th. Neopterin is a very important clinic parameter, though the physiological role has not been exactly definited thus far. The level of neopterin reflects the stage of activation of the cellular immune system, which is important in the pathogenesis and progression of various diseases. Measuring its concentration in body fluids is used in many different areas of modern medicine, such as infectious disease, gastroenterology, transplantology and transfusiology, rheumatology or oncology. In neurological, cardio-vascular and autoimmune diseases, cell-mediated immunity is also activated, which is proved by the elevated level of this marker. Measurements of neopterin concentrations are also helpful in monitoring the therapy of patients infected with the HIV virus or treated by using immunomudulating therapy. As a result of measuring levels of neopterin in patients with neoplasms of digestive tract, increased concentration was proved, but it is not routinely used in everyday clinic practice.
Povećanje imunosne aktivnosti sintetičkim muramil dipeptidom istraženo je s obzirom na aktivaciju T limfocita i makrofaga jetre i prednjeg bubrega kalifornijske pastrve. Stanice uzgajane s klasičnim ...T-staničnim mitogenima pokazuju značajno veću proliferaciju u odnosu na nestimulirane stanice. Muramil dipeptid (MDP), lipopolisaharid (LPS) ili MDP u kombinaciji s LPS nisu potaknuli proliferaciju stanica. Utjecaj MDP na funkciju makrofaga dokazan je kroz mjerenja proizvedenog dušika u nadtalogu staničnih kultura kao pokazatelja aktivacije makrofaga i proizvodnje dušikova oksida. Inkubacija stanica s LPS, MDP, IFN-γ ili njihovih kombinacija rezultirala je u značajnom i vremenski ovisnom nakupljanju dušika u staničnim kulturama. Rezultati pokazuju da MDP nije mitogen za riblje imunološke stanice, ali djeluje na makrofage putem aktivacije sinteze dušikova oksida. Praćenje proizvodnje dušikova oksida može biti novi pristup u mjerenju nespecifične imunosti riba.
CILJEVI
Odrediti ulogu iglC gena u unutarstanicnom životu F. tularensis subsp. novicida u humanim
makrofagima i amebama putem kinetike rasta, modulacije apoptoze, biogeneze fagosoma i
...ultrastrukturalne organizacije stanica nakon infekcije.
METODE
Stanice A. castellanii i H. vermiformis te humani makrofagi inficirane su s F. tularensis
subsp. novicida i njenom mutantom iglC. U odreenim vremenskim periodima nakon
infekcije stanice su procesuirane za odreivanje ukupnog broja bakterija metodom kinetike
rasta, stupnja zakiseljavanja fagosoma metodom konfokalne mikroskopije dok je
ultrastrukturalana organizacija stanice odreivana elektronskom mikroskopijom.
Otpornost na apoptozu te aktivacija kaspaze-1 i 3 u humanih makrofaga inficiranih s F.
tularensis subsp. novicida ili iglC mutantom odreivana je imunofluorescentim bojenjem
putem konfokalane mikroskopije.
REZULTATI
F. tularensis subsp. novicida pokrece jezgrinu translokaciju p65 podjedinice NF-B u
humanim makrofagima, no translokacija NF-B je defektna kod iglC mutante. Iako se
kaspaza-1 i kaspaza-3 pokrecu tijekom ranih stadija infekcije humanih makrofaga s F.
tularensis subsp. novicida, stanicna smrt je odgoena, što je u korelaciji sa simultanom
aktivacijom NF-B.
F. tularensis subsp. novicida razmnožava se unutar ameba u fagosomu u kojem nije došlo do
acidifikacije dok je iglC mutanta defektna za razmnožavanje u ovim dvjema amebama.
ZAKLJUCCI
Ovo je istraživanje prvi puta pokazalo simultanu modulaciju kaspaze-1, kaspaze-3 i antiapoptoticnog
jezgrinog transkripcijskog cimbenika NF-B i osjetljivu ravnotežu meu njima
kako bi se ocuvala sposobnost za život inficirane stanice.
Francisella može rasti i preživjeti unutar amebe, a iglC je potreban za unutarstanicni rast u A.
castellanii i H. vermiformis. Za razliku od stanica sisavaca gdje se bakterija razmnožava u
citoplazmi u amebama se F. tularensis subsp. novicida razmnožava u fagosomu.
AIMS
To determine the role of the iglC gene in intracellular life of F. tularensis subsp. novicida
within human macrophages and amoeba through growth kinetics, modulation of apoptosis,
biogenesis of the phagosome and ultrastructural organisation of the cells after the infection.
METHODS
The cells of A. castellanii, H. vermiformis and human macrophages were infected with F.
tularensis subsp. novicida and its mutant iglC. In certain time periods after infection the cells
were processed in order to determine colony forming units by growth kinetics, to examine the
level of phagosome acidification by confocal microscopy and ultrastructural organisation of
the cell was determined by electron microscopy.
VII
Resistance to apoptosis and activation of caspase-1 and caspase-3 in human macrophages
infected with F. tularensis subsp. novicida or iglC mutant was determined with
immunoflourescence staining by confocal microscopy.
RESULTS
F. tularensis triggers nuclear translocation of the p65 subunit of NF-B in hMDMs, but
sustained nuclear translocation of NF-B is defective in the iglC mutant. Although caspase-1
and caspase-3 are triggered within F. tularensis-infected hMDMs during early stages of
infection, cell death is delayed, which is correlated with simultaneous activation of NF-B.
In vitro studies showed intracellular replication of F. tularensis subsp. novicida within A.
castellanii and H. vermiformis, but iglC mutant is defective for survival and replication in
these amoeba.
CONCLUSIONS
This study, for the first time showed simultaneous modulation of caspase-1, caspase-3 and the
anti-apoptosis nuclear transcription factor NF-B and sensitive balance among them in order
to preserve capability for survival of the infected cells.
Francisella is capable to grow and survive in amoeba, and iglC is necessary for intracellular
growth in A. castellanii and H. vermiformis. In contrast to mammalian cells where bacteria
replicate in the cytosol in amoeba F. tularensis subsp. novicida replicates within pahgosomes.
Cilj istraživanja: Kako bismo bolje razumjeli razloge uklanjanja mucina 1 (MUC1)
na mjestu implantacije, istraživali smo njegov utjecaj na decidualne CD14+ stanice
prvog tromjesečja trudnoće i ...njihovo međudjelovanje s decidualnim stanicama NK.
Materijali i metode: Internalizacija FITC-dekstran, određivanje površnih i
unutarstaničnih biljega, proliferacija CD14+ i/ili CD56+ stanica i citotoksičnost
CD56+ stanica prema CD14+ stanicama određivani su pomoću protočnog citometra.
Lučenje kemokina iz decidualnih CD14+ stanica određivali smo metodom ELISA.
Magnetsko izdvajanje koristili smo za pročišćavanje decidualnih CD56+ i CD14+
stanica.
Rezultati: Decidualne CD14+ stanice izražavaju zanemariv postotak CD1a i CD83,
neznatno izražavaju CD16, dok u znatnoj mjeri izražavaju manozni receptor (MR) i
DC-SIGN, pro-upalni kemokinski receptor 5 (CCR5) i receptor mamilicu, CD163, u
usporedbi s CD14+ stanicama periferne krvi. Stimulacija decidualnih CD14+ stanica
lipopolisaharidom nije utjecala na internalizaciju FITC-dekstana. MUC1 se veže i
internalizira pomoću MR na način ovisan o koncentraciji, povećava izražaj IL-1
receptora tip II i smanjuje izražaj IL-15 u decidualnim CD14+ stanicama. U prisustvu
makrofaga stimuliranih s MUC1 smanjuje se proliferacija i izražaj citotoksičnih
medijatora u stanicama NK, dok se povećava stvaranje protu-upalnog kemokina
CCL17. Stanice NK pomoću perforina, NKp30, NKp44 i NKp46 ubijaju decidualne
CD14+ stanice. Decidualne CD56+ stanice ubijaju CD14+ stanice stimulirane
lipopolisaharidom i MUC1 učinkovitije nego nestimulirane stanice.
Zaključak: MUC1 podupire alternativnu aktivaciju decidualnih CD14+ stanica koje
mogu ograničiti proliferaciju NK stanica siromašnih s citotoksičnim medijatorima.
Uklanjanje MUC1 iz decidue tijekom i nakon implantacije mogao bi doprinjeti boljoj
kontroli prodiranje trofoblasta posredstvom stanica NK.
Cilj istraživanja: Kako bismo bolje razumjeli razloge uklanjanja mucina 1 (MUC1)
na mjestu implantacije, istraživali smo njegov utjecaj na decidualne CD14+ stanice
prvog tromjesečja trudnoće i njihovo međudjelovanje s decidualnim stanicama NK.
Materijali i metode: Internalizacija FITC-dekstran, određivanje površnih i
unutarstaničnih biljega, proliferacija CD14+ i/ili CD56+ stanica i citotoksičnost
CD56+ stanica prema CD14+ stanicama određivani su pomoću protočnog citometra.
Lučenje kemokina iz decidualnih CD14+ stanica određivali smo metodom ELISA.
Magnetsko izdvajanje koristili smo za pročišćavanje decidualnih CD56+ i CD14+
stanica.
Rezultati: Decidualne CD14+ stanice izražavaju zanemariv postotak CD1a i CD83,
neznatno izražavaju CD16, dok u znatnoj mjeri izražavaju manozni receptor (MR) i
DC-SIGN, pro-upalni kemokinski receptor 5 (CCR5) i receptor mamilicu, CD163, u
usporedbi s CD14+ stanicama periferne krvi. Stimulacija decidualnih CD14+ stanica
lipopolisaharidom nije utjecala na internalizaciju FITC-dekstana. MUC1 se veže i
internalizira pomoću MR na način ovisan o koncentraciji, povećava izražaj IL-1
receptora tip II i smanjuje izražaj IL-15 u decidualnim CD14+ stanicama. U prisustvu
makrofaga stimuliranih s MUC1 smanjuje se proliferacija i izražaj citotoksičnih
medijatora u stanicama NK, dok se povećava stvaranje protu-upalnog kemokina
CCL17. Stanice NK pomoću perforina, NKp30, NKp44 i NKp46 ubijaju decidualne
CD14+ stanice. Decidualne CD56+ stanice ubijaju CD14+ stanice stimulirane
lipopolisaharidom i MUC1 učinkovitije nego nestimulirane stanice.
Zaključak: MUC1 podupire alternativnu aktivaciju decidualnih CD14+ stanica koje
mogu ograničiti proliferaciju NK stanica siromašnih s citotoksičnim medijatorima.
Uklanjanje MUC1 iz decidue tijekom i nakon implantacije mogao bi doprinjeti boljoj
kontroli prodiranje trofoblasta posredstvom stanica NK.
Objectives: To better understand the reasons for mucin 1 (MUC 1) removal beneath
the embrio implantation we investigated influence of (MUC1 on early pregnancy
decidual CD14+ cells and their interaction with decidual NK cells.
Methods of the study: FITC-dextran internalisation, antigens detection,
chemokine secretion, proliferation of CD14+ and/or CD56+ cells and cytotoxicity of
CD56+ cells against CD14+ cells was analysed by flow cytometry. ELISA was used to
detect chemokine secretion in decidual CD14+cells. Magnetic separation was used for
purification of decidual CD56+ and CD14+ cells.
Results: Decidual CD14+ cells express negligible percentage of CD1a and CD83,
show low CD16 expression, higher mannose receptors (MR) and dendritic cell
specific intracellular adhesion molecule grabing nonintegrin (DC-SIGN), proinflamatory
chemokine CC receptor 5 (CCR5) and decoy CD163 receptor expression,
compared with peripheral blood counterparts. Lypopolysaccharide stimulation did
not affect FITC-dextran internalisation in decidual CD14+ cells. MUC1 binds and
internalises on a dose dependent manner for MR, increases decoy IL-1 receptor type
II and decreases IL-15 expression in decidual CD14+ cells. In the presence of MUC1
treated macrophages, proliferation and cytotoxic mediators’ expression in NK cells
attenuated, anti-inflammatory chemokine CCL17 increased. NK cells use perforin and
NRC in cell mediated cytotoxicity against CD14+ cells. Decidual CD56+ cells kill LPS
and MUC1 stimulated decidual CD14+ cells efficiently than unstimulated cells.
Conclusion: MUC1 supports alternative activation of decidual CD14+ cells with a
properties to restrict proliferation of NK cells poor with cytotoxic mediators. MUC 1
removal from decidual tissue during and after implantation might contribute to
better control of trophoblast invasion by NK cells.
Galektini-1 i -3 moduliraju mnoge stanične procese, a regulacijom migracije, fagocitoze i degranulacije
upalnih stanica, te sinteze citokina i medijatora upale, ovi su lektini uključeni u sve faze ...upalnih reakcija
uroĎenog i stečenog imunosnog odgovora. Djelovanje mu izrazito ovisi o lokalizaciji i tipu stanica, no galektin-1
općenito se smatra jakim protu-upalnim signalom, dok galektin-3 uglavnom potiče upalu. Ovim radom ispitana
je uloga galektina-3 u fiziologiji limfocita, te uloga i ekspresija galektina-1 i -3 u monocita, te klasično i
alternativno diferenciranih i aktiviranih makrofaga.
Humani limfociti i monociti izolirani su iz krvi zdravih dobrovoljnih davatelja. Uzgojem u hranidbenom
mediju uz dodatak granulocitno-makrofagnog, odnosno makrofagnog faktora stimulacije rasta kolonija, monociti
su diferencirani u makrofage tipa M1 i M2. Diferencirani makrofagi M1 aktivirani su klasično, dodatkom
lipopolisaharida i interferona-γ, ili alternativno u fenotip M2a/M2c, dodatkom interleukina (IL)-4/IL-10.
UtvrĎena je ekspresija galektina-1 i -3 na genskoj i proteinskoj razini, te njihova prisutnost na membrani stanica.
U hranidbenom mediju spomenutih stanica odreĎena je koncentracija galektina-3. UtvrĎen je učinak egzogeno
dodanog galektina-3 na fiziologiju limfocita, monocita i aktiviranih makrofaga.
Dobiveni rezultati upućuju na to da diferencijaciju i polarizaciju humanih monocita u klasično (M1) i
alternativno (M2a/M2c) aktivirane makrofage prate izrazite promjene razine ekspresije i proteolitičkog kidanja
galektina-3. Ekspresija i sekrecija galektina-3 usko su regulirane i znatno se razlikuju u klasično, u odnosu na
alternativno aktivirane makrofage, dok u galektina-1 razlike u razini ekspresije nisu toliko naglašene.
Zamijećene su izrazite razlike ekspresijskih profila i kidanja galektina-3 u istih podtipova makrofaga podrijetlom
od različitih donora krvi. U klasično aktiviranih makrofaga, temeljem intenziteta ekspresije membranskog
galektina-3, zamijećene su dvije odvojene populacije stanica. Humani monociti pokazuju izrazito velik kapacitet
vezanja egzogeno dodanog galektina-3, dok su u aktiviranih makrofaga receptori tog proteina u potpunosti
zasićeni. Egzogeno dodani galektin-3 ne utječe na izlučivanje citokina limfocita i aktiviranih makrofaga.
Razlike u razini i obrascu ekspresije galektina-3 u različito diferenciranih/aktiviranih makrofaga u odnosu na
galektin-1 su značajne. Stoga, specifičan uzorak ekspresije i sekrecije ovog proteina u diferenciranih i aktiviranih
makrofaga pridonosi boljem razumijevanju uloge i regulacije galektina-3 u tim stanicama. Novi uvid u biološke
karakteristike različito diferenciranih i aktiviranih makrofaga, te limfocita baca svjetlo na galektin-3 kao
modulator ovih stanica.
Galectins-1 and -3 modulate many cellular processes, and through regulation of cell migration, phagocytosis,
immune cell degranulation and modulation of cytokine and inflammatory mediator production, these lectins are
intimately involved in all phases of inflammatory reactions of innate and acquired immunity. Galectin-1 is
generally considered a strong anti-inflammatory and galectin-3 a pro-inflammatory signal, but their effects
tremendously vary with respect to their localization and the cell type. In this work we address the role of
galectin-3 in the physiology of lymphocytes and the role and expression of galectins-1 and -3 in human
monocytes and classically or alternatively differentiated and activated macrophages.
Human lymphocytes and monocytes were isolated from the blood of healthy donors and differentiated into
M1 and M2 subtype of macrophages by cultivation in culture media supplemented with granulocyte-macrophage
or macrophage colony-stimulating factor, respectively. M1 macrophages were activated classically by
lipopolysaccharide and interpheron-γ or alternatively into M2a/M2c phenotypes by interleukin (IL)-4/IL-10,
respectively. The expression of galectins-1 and -3 was determined on gene and protein levels, and the amount of
galectins bound to the cell membranes was estimated. Culture media were probed for secreted galectin-3. The
effect of exogenously added galectin-3 on the physiology of lymphocytes, monocytes and activated macrophages
was investigated.
Obtained results imply that differentiation and activation of monocytes into classically (M1) and alternatively
(M2a/M2c) activated macrophages is followed by marked changes of expression and proteolitic cleavage of
galectin-3. Expression and secretion of galectin-3 was tightly regulated and significantly differed among
classically and alternatively activated macrophages, while the differences of galectin-1 expression profiles were
not pronounced. Significant differences in galectin-3 expression profiles were observed between the same
macrophage subtypes obtained from different blood donors. Moreover, classically activated macrophages
polarize into two distinct populations with respect to the expression of membrane galectin-3. Human monocytes
exhibited high amount of free galectin-3 receptors, while on both types of activated macrophages the receptors
were fully saturated. Exogenously added galectin-3 does not affect cytokine secretion of lymphocytes or
activated macrophages.
Galectin-3 is more distinctive descriptor of macrophage differentiation/activation than galectin-1. Its specific
expression and secretion pattern in M1 vs. M2a/M2c macrophages contributes to better understanding of its role
and regulation in these cells and provides a new insight on biological characteristics of these cells.
Mikrookruženje tumora (TME) važna je komponenta u proučavanju ponašanja tumora kod nekoliko vrsta karcinoma u ljudi. U usporedbi s ljudima, malo je informacija o ulozi TME-a kod tumora mliječne ...žlijezde u pasa (CMTs). Cilj je rada bio istražiti odnos između TME-a, hipoksije i angiogeneze putem ekspresije CD31, VEGF, HIF-1a, CD68 i CD163 upotrebom imunohistokemijskih (IHC) metoda. U uzorcima tumora mliječne žlijezde pasa (n=34) koji su fiksirani formalinom i ugrađeni u parafin (maligni n=28 i benigni n=6), provedena je usporedba s kliničkopatološkim svojstvima tumora i analiziran odnos među njima. Nije bilo znakovite povezanosti između ekspresije CD31, VEGF, HIF-1a, CD68 i CD163 kod malignih tumora u usporedbi s benignim tumorima (P>0,05). Uočena je povezanost između gustoće mikrožila i kliničkopatoloških pokazatelja (veličina tumora P=0,013; prisutnost nekroze P=0,022) te pojedinačne histološke ocjene malignosti (G2 prema G3 P=0,028) kod malignih tumora. Iako je postojala pozitivna korelacija između CD68 i CD163 kod malignih tumora u pasa (P<0,01), ista nije uočena između drugih protutijela. Imunohistokemijsko određivanje razine angiogeneze kod TME-a može pružiti korisne informacije o angiogenom potencijalu i stupnjevanju kliničke agresivnosti pojedinih tumora mliječne žlijezde u pasa.
PDF
