L’histoire naturelle du cancer implique des interactions entre la tumeur et les mécanismes de défense de l’hôte, tout particulièrement avec le système immunitaire adaptatif. Ainsi la transformation ...de cellules normales en cellules malignes peut engendrer l’expression d’antigènes tumoraux reconnus par les lymphocytes T. Plusieurs sous-populations de lymphocytes T (LT) CD4 contrôlent les réponses antitumorales, parmi elles, les LT CD4 helper de type-1 (Th1) jouent un rôle activateur majeur de l’immunité à médiation cellulaire antitumorale. Ils deviennent actifs grâce à la reconnaissance des peptides de 15 à 20 acides aminés dérivés d’antigènes tumoraux et présentés par les molécules HLA de classe II. Ils sont nécessaires à l’induction et la fonction des cellules effectrices dirigées contre les tumeurs notamment les lymphocytes T CD8 cytotoxiques (CTL). De plus la présence de lymphocytes CD4 Th1 infiltrant les tumeurs est souvent associée à un bon pronostic chez les patients. A l’aide d’un modèle in vitro chez l’homme et in vivo chez des souris transgéniques HLA, nous avons identifié quatre nouveaux peptides CD4 dérivés de la télomérase (TERT) un antigène de tumeur exprimé dans la majorité des cancers humains. Ces peptides appelés «Universal Cancer Peptide, UCP» se lient à la majorité des allèles HLA-DR et sont capables d’activer spécifiquement les LT CD4 de type-1. Des LT CD4 circulants spécifiques des UCP sont naturellement détectables dans plusieurs cancers humains mais absents chez des individus sains. Des clones T CD4 spécifiques des UCP générés à partir des lymphocytes de patients, produisent de forts taux d’IFN, TNF, et d’IL-2, cytokines associées à la polarisation Th1. L’analyse par ELISPOT IFN, de LT CD4 anti-UCP circulants au sein d’une cohorte de 84 patients atteints de cancers bronchiques métastatiques a montré la présence naturelle de ces lymphocytes chez 38 % des patients. De plus un effet bénéfique de la présence de cette réponse sur la survie globale a été observé chez les patients ayant une réponse clinique objective après chimiothérapie (13 vs 10 mois, P< 003). In vivo, l’immunisation de souris transgéniques HLA-A2/HLA-DR1 (Tg A2/DR1) avec les peptides UCP stimule des réponses T CD4 spécifiques caractérisées par une polarisation Th1. Nous avons montré que la présence in vivo de LT CD4 anti-UCP est nécessaire pour l’induction de réponses CTL antitumorales efficaces. Ainsi chez des souris co-immunisées en présence d’un peptide UCP, on observe un accroissement en nombre et de la qualité des réponses CTL proportionnellement à l’aide délivrée par les LT CD4 anti-UCP. L’induction de LT CD4 anti-UCP s’accompagne également d’une activation des cellules dendritiques in vivo via un mécanisme impliquant CD40L, IFN et GM-CSF. Dans un modèle de mélanome transplantable chez les souris Tg A2/DR1 nos résultats ont montré qu’une vaccination thérapeutique comportant un peptide UCP favorise un meilleur recrutement de CTL fonctionnels dans les tumeurs et améliore ainsi l’efficacité antitumorale du vaccin. Ces résultats confirment le rôle antitumoral majeur des lymphocytes CD4 Th1 et soulignent l’intérêt clinique de stimuler des réponses T CD4 spécifiques d’antigènes tumoraux de relevance clinique comme TERT.
Recent advances in immunology have now validated the concept of cancer immunosurveillance and the leading role of adaptative T cell immunity. Until a few years ago, antitumor CD8 T cell responses have been the most studied due to their direct cytotoxic activity on tumor cells. On the other hand, study of antitumor CD4 T cell responses are even more challenging because of the heterogeneity and plasticity of the various CD4 T cells subpopulations described. Among them, CD4 T helper type-1 cells (Th1), mainly characterized by the production of IFN, control the activation of antitumor cellular immunity. Thus, stimulation of specific CD4 Th1 cells may have a major interest for the development of anticancer immunotherapies. During this research thesis, we characterized novel HLA class II epitopes derived from a relevant tumor antigen, telomerase (TERT), and studied their capacities to stimulate specific CD4 Th1 cell responses. Using a method based on predictive immunology, we identified 4 peptides derived from TERT, referred as « Universal Cancer Peptides » (UCPs), enable to bind the most commonly found HLA-DR alleles in human. Using HLA-A2/HLA-DR1 transgenic mouse model, we first evaluated the in vivo immunogenicity of these peptides. Immunization of mice with UCPs induces high avidity specific CD4 T cells. The study of their polarization showed that UCP-specific CD4 T cells do not produce IL-4, -5, -10 or -17 cytokines, excluding a Th1, Treg or Th17 differentiation. In contrast, we measured high amount of IFN and IL-2 which characterize a Th1 pattern. The study of helper role allow us to demonstrate that CD8 peptide-based vaccinations in presence of UCPs enhance the efficacy of tumor specific CTL responses. Indeed, the intensity of these responses is strongly correlated with that of UCP-specific CD4 T cells induced in vivo. Furthermore, the stimulation of UCP-specific CD4 T cells promotes activation and IL-12 release by dendritic cells through a mechanism that involves IFN, GM-CSF and CD40L. We also demonstrated the antitumor efficacy of UCPs during a therapeutic vaccination in mice, as well as their capacity to foster the recruitment of specific CD8 T cells at the tumor site. In addition, the presence of naturally occurring UCP-specific CD4 T cell responses was found in different types of cancers such as leukemia, lung, colorectal or renal cancers. A study conducted in a cohort of 84 metastatic lung cancer patients revealed a synergistic effect of spontaneous UCP-specific CD4 Th1 and chemotherapy-treatment. Altogether, this study provides further evidences that stimulation of antitumor CD4 Th1 cells is a powerful method to improve cancer vaccines and also highlights the interest of TERT-derived UCPs for the innovative monitoring of antitumor CD4 T cell responses
L'enveloppe cellulaire des bactéries à Gram négatif constitue la première ligne de défense contre les antibiotiques. Sous l’effet, d’une part, de la faible perméabilité de la membrane externe qui ...s'oppose à la pénétration des agents antibactériens, d’autre part des pompes d'efflux qui favorisent leur expulsion, elle empêche nombre de composés potentiellement actifs in vitro d'atteindre leur cible, limitant l’effet antibactérien. Un enjeu important pour restaurer l’activité de ces molécules est de trouver une stratégie pour en augmenter la concentration intracellulaire. L'objectif de cette thèse est de développer des métallodrogues comme nouvelle stratégie de vectorisation de drogues dans les cellules. Cette stratégie repose sur l’association d'une drogue active in vitro, et d’un ligand auxiliaire ayant des propriétés perméabilisantes ou inhibitrices de pompe d’efflux, dans un complexe qui jouera le rôle de chaperone. Les agents antibactériens utilisés sont des inhibiteurs (dérivés d’acides hydroxamiques) de peptide déformylase (PDF) et de méthionine aminopeptidase (MetAP) développés au laboratoire. Tout d’abord, une étude globale de la stratégie de vectorisation a été réalisée (i) étude de stabilité de métallodrogues modèles : en utilisant un acide hydroxamique fluorescent, nous avons montré que, seules, des métallodrogues à Co(III), à la différence de celles à Cu(II) et Fe(III), satisfaisaient aux conditions de stabilité compatibles avec les conditions de tests biologiques. (ii) Etude de la libération de la drogue : nous avons établi par une étude RMN 1H et UV-vis qu’en milieu tampon pH = 7,4, la libération de la drogue se faisait par échange de ligand avec un thiol exogène. Récemment, une nouvelle série d’inhibiteurs de PDF a été synthétisée au laboratoire. Elle est basée sur un squelette hétérocyclique à 5 chaînons fonctionnalisé par une chaîne en C4, puis via un espaceur monocarboné, à un acide hydroxamique. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec un oxadiazole (AT002 16 µg/ml sur E. coli en présence de perméabilisant PMBN). Au cours de cette thèse, pour améliorer la lipophilie, des groupements aromatiques ont été fixés sur cet hétérocycle. Les MICs sur la souche d’E. coli sauvage n’ont pas été améliorées mais en présence de PMBN, le dérivé présentant la meilleure activité est le composé AT015 (2 µg/ml sur E. coli en présence de PMBN) qui a donc été choisi pour concevoir des métallodrogues. La métallodrogue réunit autour d’un métal deux parties: (i) un ligand auxiliaire fonctionnalisé via un espaceur par un perméabilisant peptidique analogue de peptide antimicrobien ou par un modulateur de l’efflux (ii) un acide hydroxamique inhibiteur de PDF. Au cours de la SAR réalisée en faisant varier la drogue, le ligand auxiliaire et le métal, nous avons montré que les meilleures métallodrogues permettent d’améliorer l’activité de la drogue sur la souche d’E. coli sauvage d’un facteur 16. Un des ligands auxiliaires fonctionnalisé par un tétrapeptide présente, seul, une activité sur une souche d’E. aerogenes résistante aux fluoroquinolones. Sur ce cas, l’activité biologique a été reliée, par des expériences de mapping par fluorescence, à son accumulation intracellulaire, en utilisant un analogue fluorescent de ce composé.
The gram negative bacterias’ cell envelopes are the first line of defense against antibiotics. First thanks to the low permeability of the external membrane that prevents the penetration of the antibiotics, but also thanks to the efflux pumps that help expelling the antibiotics from the cell. These mechanisms prevent many compounds, potentially active in vitro, from reaching their targets, thus limiting the antimicrobial effect. To increase the molecules’ intracellular concentration is one of the means to restore their activity. This thesis’ objective is to develop metallodrugs as a new drug vectorization strategy in cells. We here associate an active drug in vitro and an auxiliary ligand with permeabilization or efflux pumps inhibition abilities in a complex playing the role of a chaperone. We used peptide deformylase (PDF) and methionine aminopeptidase (MetAP) inhibitors (derived from hydroxamic acids) developed at the laboratory as antimicrobial agents. I’ll begin with a global study of the vectorization strategy we’ve adopted (i) Stability study of the metallodrugs models: using a fluorescent hydroxamic acid, we showed that only Co(III) metallodrugs are in agreement with the stability conditions compatible with the biological tests, in opposition with the Cu(II) and Fe(III) ones. (ii) Drug release study: we showed in 1H NMR and UV-vis studies that in a buffer solution pH 7.4, a ligand exchange with an exogenous thiol is responsible for the drug release. Recently, a new series of PDF inhibitors was synthesized at the laboratory. It is composed of a 5 membered heterocyclic skeleton functionalized by a chain in C4 followed by an hydroxamic acid via a monocarbonated spacer. The best results were obtained with an oxadiazole (AT002 16 µg/ml with E. coli and PMBN as permeabilizing agent). During this thesis, to enhance lipophilicity, we attached aromatic groups on the heterocycle. CMIs on the E. coli strain have not been increased but the compounds displaying the best activity in presence of PMBN (AT015, 2 µg/ml with E. coli and PMBN) was chosen to conceive metallodrugs. The metallodrug is composed of a metal center and two other parts: (i) an auxiliary ligand functionalized via a spacer by a permeabilizing peptide, an antimicrobial peptide analogue, or by an efflux modulator. (ii) An hydroxamic acid PDF inhibitor. We showed that the best metallodrugs enhance the drug activity on the wild E.coli strain by a 16 factor, with the SAR we realized, changing the drug, the auxiliary ligand and the metal. One of the auxiliary ligands functionalized by a tetrapeptide show an activity on a fluoroquinolone-resistant E. aerogenes strain while alone. Utilizing a fluorescent analogous of this compound, we linked the biological activity to its intracellular accumulation with fluorescence mapping experiments.
Le ciblage peptidique en oncologie nucléaire a connu un essor significatif ces 20 dernières années. Une meilleure connaissance des récepteurs peptidiques a permis le développement de nouveaux ...radioligands ciblant ces récepteurs. Si les différents travaux publiés traduisent l’intérêt de développer des peptides radiomarqués, en revanche, ils illustrent, très clairement, les difficultés rencontrées pour obtenir un médicament radiopharmaceutique avec des propriétés pharmacologiques et pharmacocinétiques en accord avec une utilisation clinique en routine aussi bien en diagnostic qu’en thérapie. Au regard de la littérature, la méthode utilisée, le plus souvent, consiste à modifier le ligand endogène afin de synthétiser différents dérivés peptidiques radiomarqués évalués molécule par molécule (
screening). Nous avons choisi d’aborder la thématique d’optimisation des analogues peptidiques radiomarqués avec une méthode différente et récente : la modélisation moléculaire, en prenant l’exemple du ciblage peptidique des récepteurs de la cholécystokinine/gastrine.
Peptidic receptor targeting in nuclear oncology has been significantly improved the last 20 years. A better in-depth knowledge of peptidic receptor has permitted more extensive research and development of new radioligands. The different published studies showed the interest of radiolabelled peptide development but also the difficulties to obtain a radiopharmaceutical with pharmacologic and pharmacokinetic properties adapted to clinical applications in diagnosis and internal radiotherapy. Based on the literature, the most applied methodology is to modify the structure of the endogenous ligand iteratively and to synthesize various derivatives radiolabelled peptide tested one by one. We chose to address the issue of optimization of radiolabelled peptide analogues from a different recent method via molecular modelling and for our purpose more specifically the targeting of the peptide receptor cholecystokinin/gastrin.
La distribution de principes actifs dans le système nerveux central (SNC) est entravée par la présence d'une barrière physiologique, la barrière hémato-encéphalique (BHE). L'endothélium cérébral est ...pourvu d'un large éventail de systèmes de transport, parmi lesquels la trancytose récepteur-dépendante, qui peut être mise à profit pour vectoriser toute une gamme d'agents thérapeutiques vers le SNC de manière non invasive. Dans le cadre de cette approche, le LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), exprimé à la surface de la BHE, est une cible particulièrement intéressante. L'objectif de ce travail est le développement de nouveaux ligands du LDLR en tant que vecteurs potentiels de la BHE. Le criblage d'une librairie de peptides aléatoires dirigée contre le LDLR a permis l'identification d'un peptide 15-mer cyclique ayant une haute affinité in vitro. Une étude des relations structure/activité a ensuite été menée afin d'améliorer l'affinité pour le LDLR et d'augmenter la stabilité plasmatique de ce peptide. Cette étude a abouti à l'identification d'un nouveau peptide « lead » qui a été conjugué à des molécules actives afin d'évaluer la capacité du peptide à vectoriser un principe actif à travers la BHE après administration in vivo chez la souris.
Drug delivery to the central nervous system (CNS) is hindered by the presence of a physiological barrier, the blood-brain barrier (BBB). The brain endothelium is endowed with a series of transport systems, including receptor-mediated transcytosis. This system can also be used to transport therapeutics into the brain as a non-invasive manner. Among receptors expressed on the BBB, the low density lipoprotein receptor (LDLR) is relevant as a drug delivery system. This project is dedicated to the development of new peptide-based ligands of LDLR as potential BBB-vectors. The screening of a random peptide library directed to the LDLR led to the identification of hits such as a cyclic 15-mer peptide with high in vitro affinity. A structure/activity relationship study was then carried out in order to improve its affinity towards the LDLR and to increase its plasmatic stability. This study led to the identification of a new lead peptide which was conjugated to bioactive compounds in order to assess the ability of our peptide to shuttle a drug across the BBB following in vivo administration in mice.
Le développement d’une nouvelle sonde dite « activity-based probe » pour réaliser la détection de formes actives de protéases appartenant à la famille des protéases à zinc de la matrice (MMP) a été ...réalisé dans ce travail, en partant d’un inhibiteur phosphinique puissant des MMP dans lequel a été introduit un groupement photoactivable de type diazérine. Ce composé se révèle un inhibiteur puissant de plusieurs MMP avec des affinités nanomolaires. Ce composé incubé avec différentes MMP est par ailleurs capables de modifier de façon covalente un grand nombre de MMP au niveau de leur site actif, avec des rendements de modification variant de plus de 50% à 11%, selon la nature des MMP. En ayant choisi comme moyen de détection la radioactivité, nous démontrons qu’avec cette nouvelle sonde qu’il est possible de détecter des formes actives de MMP avec des sensibilités de l’ordre de la femtomole dans des systèmes modèles de protéomes complexes. Appliquée à l’analyse de lavages broncho alvéolaires de souris traitées par voie pulmonaire avec des nanoparticules pour induire une réponse inflammatoire, cette nouvelle sonde permet de mettre en évidence la présence de formes actives du domaine catalytique de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc exprimée par les macrophages, mais pas dans les animaux contrôles. En revanche l’analyse de carotides humaines de patients souffrant d’athérosclérose ne nous pas conduit avec cette sonde à la détection de formes actives de MMP. Malgré ce résultat, il est à noter que la détection de forme active de MMP dans un fluide pathologique est une première dans ce domaine. Cette sonde étant validée pour sa capacité à détecter des formes actives de MMP, elle permettra dans l’avenir de tester d’autres fluides pathologiques d’origine humaine ou bien des extraits de tissu comme des tumeurs pour lesquels les MMP pourraient être des marqueurs de ces pathologies.
A new activity-based probe able to covalently modify the active site of proteases belonging to the matrix metalloprotease family (MMPs) has been developed in this thesis project. The probe was shown to behave as potent inhibitor of several MMPs, with nanomolar Ki values. This probe was also able to modify specifically only the free active site of MMPs, with particular high yields of cross-linking varying from 50 % to 11 %, depending of the MMPs tested. Using radioactivity as means of detection, this probe was able to detect active form of MMPs with a threshold of 1 femtomole. Applied to the study of bronchoalvelolar fluids (BAL) from mice exposed to nanoparticles by a lung aspiration protocol, this probe revealed the presence of the catalytic domain of MMP-12 under its active form, but not in control animals. When used to detect active form of MMPs from extracts obtained from human arteries of patient suffering from atherosclerosis, the probe was not able to detect such MMP active forms. Despite this negative result, the detection of active form of MMP in pathological fluid like BAL has never been reported before this work. Having validated this novel MMP activity-based probe, it will be possible to use it now for detecting MMPs from other pathological fluids or tissues extracts in which MMPs can be good markers of the pathology.
Ce travail de thèse consiste au développement méthodologique et logiciel d'une méthode de docking moléculaire dite inverse. Cette méthode propose à travers le programme AMIDE — Automatic Inverse ...Docking Engine — de distribuer un grand nombres de simulations d'amarrage moléculaire sur des architectures HPC (clusters de calcul) avec les applications AutoDock 4.2 et AutoDock Vina. Le principe de cette méthode consiste à tester de petites molécules sur un ensemble de protéines cibles potentielles. Les paramètres optimaux ont été définis à partir d'une étude pilote et le protocole a été validé sur des ligands et peptides liants les protéines MMPs et EBP de la matrice extracellulaire. Cette méthode montre qu'elle permet d‘améliorer la recherche conformationnelle lors du calcul de docking sur des structures expérimentales par rapport à des protocoles existants (blind docking). Il est montré que le programme AMIDE permet de discriminer des sites de fixation privilégiés lors d'expériences de criblage inverse de protéines de manière plus performante que par blind docking. Ces résultats sont obtenus par la mise en place de méthodes de partitionnement de l'espace de recherche qui permettent également à travers un système de distribution hybride de déployer un ensemble de tâches indépendantes pour un traitement autorisant le passage d'échelle.
This work is a methodological and software development of so-called inverse molecular docking method. This method offers through an in house program AMIDE — Automatic Reverse Docking Engine — to distribute large numbers of molecular docking simulations on HPC architectures (com- puting clusters) with AutoDock 4.2 and AutoDock Vina applications. The principle of this method is to test small molecules on a set of potential target proteins. The program optimum parameters were defined from a pilot study and the protocol was validated on ligands and peptides binding MMPs and EBP extracellular matrix proteins. This method improves the conformational search in docking computation on experimental structures compared to existing protocols (blind docking). It is shown that the AMIDE program is more efficient to discriminate preferred binding sites in inverse proteins screening experiments than blind docking. These results are obtained by the implemen- tation of methods for partitioning the search space that also allow through a hybrid distribution system to deploy a set of independent embarassingly parallel tasks perfectly scalable.
Chez les eucaryotes supérieurs, la progression ordonnée du cycle cellulaire est régie par une dizaine de kinases Cdk-cyclines. Les altérations génétiques ou épigénétiques impliquant des oncogènes ou ...des gènes codant pour des suppresseurs de tumeurs sont souvent associées à l'expression ou l'activation aberrante des Cdks, favorisant ainsi la prolifération cellulaire incontrôlée et notamment le développement de cancers. Malgré la pertinence oncogénique et thérapeutique de ces protéines, leur détection est restée jusqu'à présent limitée à des méthodes indirectes et invasives. Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont permis de développer un biosenseur peptidique fluorescent permettant de reconnaître spécifiquement les Cdk-cyclines. Associé à une stratégie de vectorisation non invasive basée sur l'utilisation de peptides vecteurs pénétrants, le biosenseur a été délivré efficacement dans les cellules. La mise au point d'une quantification ratiométrique du signal a par ailleurs permis d'évaluer l'abondance relative des Cdk-cyclines endogènes. Deux variants plus spécifiques de certains complexes ont pu être développés. Enfin, d'autres versions du biosenseur ont quant à elles permis d'évaluer sa biodistribution in vivo et de mettre au point un essai cellulaire en vue d'un criblage de petites molécules ayant un effet sur l'abondance relative des Cdk-cyclines.
Cdk-cyclins represent key regulators of cell cycle progression among superior eukaryotes. Genetic and epigenetic alterations involving oncogenes or tumor suppressor genes are often associated with aberrant expression or activation of Cdks, leading to the sustained proliferation of cells and by the way to the development of cancers. Despite the oncogenic and therapeutic relevance of these proteins, their detection has so far remained limited to indirect and invasive methods. My Ph.D. thesis work aimed in this context at developing peptidic fluorescent biosensors that specifically recognize Cdk-cyclins. Combined to cell-penetrating peptides, the biosensor was efficiently delivered into cells. Following the development of the signal ratiometric quantification, the relative abundance of endogenous Cdk-cyclins was directly evaluated in living cells. Two other variants, that are more specific towards specific Cdk-cyclin complexes, were also designed. Finally, the development of novel versions of the biosensor allowed us to evaluate its biodistribution in vivo and to set up a cell-based assay to screen small molecules having an effect on Cdk-cyclin relative abundance.
Les récepteurs couplés aux protéines G constituent la plus grande famille de protéines membranaires et interviennent dans de nombreux processus physiologiques. La compréhension de l’interaction ...ligand-récepteur d’un point de vue mécanistique mais également thérapeutique est cruciale. Appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs de la vasopressine et de l’ocytocine ont été choisis comme modèle d’étude. Ces hormones jouent un rôle important dans la modulation de l’attachement et de l’affect chez les mammifères. Afin d’accélérer la découverte de ligands ocytocinergiques et d’explorer les mécanismes fondamentaux de leurs interactions, nous avons conçu les premiers ligands fluorescents non peptidiques des récepteurs de la vasopressine V1a et de l’ocytocine. Ces ligands ont été utilisés pour développer des tests de liaisons par TR-FRET et démontrer la dimérisation des récepteurs de la vasopressine V1a et V2 sur cellules. Des études autour de petites plates-formes dérivées d’aza-dicétopipérazine ont permis d’accéder à un nouvel antagoniste non peptidique du récepteur de l’ocytocine. L’optimisation de dérivés benzodiazépines ocytocinergiques par des études de relations structure-activité a permis d’identifier les meilleurs agonistes non peptidiques du récepteur de l’ocytocine à ce jour. Une étude in vivo chez la souris et chez le singe est amorcée pour apporter dans un futur, une solution thérapeutique aux problèmes d’interaction sociale en général et d’autisme en particulier.
G protein coupled receptors are the largest membrane protein family and play an important role in a large number ofphysiological processes. The comprehension of the ligand-receptor interaction from a mechanistic point of view but alsofor therapeutic use is crucial. Belonging to the G protein coupled receptors, the oxytocin and vasopressin receptors havebeen used as a model system. These two hormones play an important role in the modulation of attachment and affectin mammals. To accelerate the discovery of new ligands for oxytocin and vasopressin receptors and to explore thefundamental role of their interactions, we designed the first non-peptide fluorescent ligands for oxytocin and vasopressin V1a receptors. These ligands have been used to develop new binding tests based on TR-FRET technology and to prove the V1a and V2 receptor dimerisation. In parallel, we developed a new non-peptide oxytocin antagonist around an aza-diketopiperazine platform. . Optimization of benzodiazepine derivatives enables us to identify the best non peptideoxytocin agonists to date. In vivo studies in mice and monkeys are initiated to bring in the future a therapeuticsolution to social interaction problems in general and autism in particular
Les travaux rapportés dans ce manuscrit ont porté sur la synthèse et l’étude structurale d’oligopeptides contenant l’acide N-aminoazétidine-2-carboxylique AAzC, dans le but de caractériser un nouveau ...foldamère.Nous avons dans un premier temps préparé les quatre stéréoisomères de l’acide 2 aminocyclobutane carboxylique ACBC et les deux stéréoisomères de l’AAzC. Ces synthèses ont été réalisées en employant deux méthodes similaires, rapportées par notre laboratoire, comportant une étape-clé de photocycloaddition 2 + 2 entre l’éthylène et l’uracile ou l’aza-uracile. L’étude de l’AAzC dans des couplages peptidiques a ensuite révélé une réactivité difficile à maîtriser à cause d’une forte propension à l’ouverture du cycle azétidine, ce qui nous a conduit à ne pouvoir synthétiser que des oligopeptides contenant un unique résidu AAzC, qui plus est en position N terminale. Trois cyclobutylamides du cis-ACBC, du trans-ACBC et de l’AAzC ainsi qu’un cyclobutylester de l’AAzC ont alors été préparés avec de bons rendements. Le couplage du (S) AAzC avec chacun des stéréoisomères de l’ACBC a fourni quatre dipeptides mixtes Boc−AAzC−ACBC−OMe avec de bons rendements également. Enfin, nous avons synthétisé des tétrapeptides, hexapeptides et octapeptides homochiraux du cis-ACBC ou du trans ACBC comportant un unique résidu (S)-AAzC en position N-terminale. Les composés de la série cis ont présenté une forte tendance à la gélification, entraînant une chute du rendement et augmentant la difficulté pour la caractérisation et l’analyse structurale.Enfin, nous avons analysé la structuration de ces différents composés par spectroscopie IR en solution, RMN, dichroïsme circulaire, modélisation moléculaire et diffraction des rayons X. Deux techniques de RMN plus poussées, l’IMPACT HMBC 1H-15N et la SOFAST HMBC 1H-13C ont été utilisées afin de détecter des liaisons H intramoléculaires. Nous avons ainsi pu mettre en évidence la formation d’un hydrazino turn en solution et à l’état solide pour le cyclobutylamide du (S)-AAzC. Cette structuration en hydrazino turn a également été observée pour les quatre dipeptides Boc−AAzC−ACBC−OMe, cependant en présence d'un second conformère pour les dérivés du cis ACBC. Les différentes analyses nous ont permis de conclure que le tétrapeptide Boc−AAzC−t ACBC3−OMe et l’hexapeptide Boc−AAzC−t ACBC5−OMe adoptent une structuration en hélice 8 dans le chloroforme, avec la formation d’un hydrazino turn dans la partie N-terminale. L’octapeptide Boc−AAzC−t ACBC7−OMe adopte quant à lui une structure chimère dans la pyridine, comportant un hydrazino turn dans la partie N-terminale puis se poursuivant en hélice 12 dans la partie C-terminale comme l’hexamère et l’octamère du trans ACBC.Nous avons ainsi montré que l’AAzC possède une préférence forte pour une structuration locale en cycle à 8 chaînons, mais également une forte tendance à induire une hélice 8, jusqu'à une certaine distance dans un oligopeptide.
This thesis is devoted to the synthesis and structural study of oligopeptides containing N aminoazetidine-2-carboxylic acid (AAzC), to find a new foldamer.First, we prepared each of the four stereoisomers of 2-aminocyclobutane carboxylic acid (ACBC), and the two stereoisomers of AAzC. This has been done using two similar techniques from our lab, based on a 2 + 2 photocycloaddition key-step between ethylene and uracile or aza-uracile. Peptide coupling using AAzC revealed a tricky reactivity of this new building block, due to an easy ring-opening. We were thus able to synthesize only oligopeptides containing a single AAzC residue, blocked in the N-terminal position. Three model cyclobutylamide derivatives containing ACBC or AAzC and one model AAzC cyclobutylester were prepared. Synthesis of four dipeptides each incorporating AAzC in the N terminal position and a single stereoisomer of ACBC in the C terminal position was performed within good yields. Finally, oligopeptides comprising a sequence of trans or cis-ACBC residues bearing a single AAzC unit at the N terminal position were obtained. Cis-oligopeptides were difficult to analyze due to gelation phenomenon.The folding behaviour of these peptides was examined on the basis of IR spectroscopy, NMR studies, circular dichroism, molecular modelling studies and X-ray diffraction. Two new NMR techniques, IMPACT HMBC 1H-15N and SOFAST HMBC 1H-13C were used to detect intramolecular hydrogen bonds. We proved the existence of a hydrazino turn for the AAzC cyclobutylamide and the four Boc−AAzC−ACBC−OMe dipeptides. For longer oligopeptides, analyzes revealed an 8-helix structuration in chloroform for both the tetrapeptide Boc−AAzC−t ACBC3−OMe and hexapeptide Boc−AAzC−t ACBC5−OMe, helped by a hydrazino turn in the N-terminal position. Finally, octapeptide Boc−AAzC−t ACBC7−OMe shows in pyridine a chimeric structure, starting with a hydrazino turn in the N-terminal position but going on with a 12-helix in the C-terminal position as in trans-ACBC hexamer or octamer.We demonstrated here that AAzC has a strong preference for an 8-membered ring local structuration, and a strong tendency to induce an 8-helix in a peptide.
Les interactions multivalentes sucre/protéine sont impliquées dans de nombreux processus biologiques tels que l'adhésion hôte-pathogène, la communication cellulaire ou les réponses immunitaires. La ...conception de glycoconjugués capables de présenter des motifs osidiques en cluster est essentielle, non seulement pour étudier ces phénomènes de reconnaissance complexes mais aussi pour développer des agents biologiquement actifs. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse a été de synthétiser de nouveaux glycoclusters et d'évaluer leurs propriétés biologiques. Ces glycoclusters ont été obtenus en conjuguant des sucres sur des cyclopeptides par des méthodes chimiosélectives (cycloaddition de Huisgen et ligation oxime). Des composés tetravalents, hexavalents et hexadécavalents d'architectures et de compositions variables ont été synthétisés, entièrement caractérisés puis évalués au laboratoire ou dans le cadre de collaborations avec différentes cibles. Un glycocluster hexadécavalent fucosylé a ainsi pu être identifié comme puissant inhibiteur de l'interaction de la lectine PA-IIL de la bactérie Pseudomonas aeruginosa à une concentration subnanomolaire. Une autre famille de composés associant des sucres et des peptides a montré des propriétés immunologiques uniques, notamment pour activer les cellules NK contre des cellules cancéreuses sans déclencher de phénomène d'autoapoptose. Mots clés : chimie des sucres, chimie des peptides, glycoclusters, ligations chimiosélectives, interactions sucre-protéine, lectine, cellule NK.
Multivalent carbohydrates-protein interactions are involved in a large variety of biological processes such as host-pathogen adhesions, cell communication or immune responses. The design of glycoconjugates displaying multiple copies of sugars as cluster is essential, not only to study these complex recognition processes but also to develop bioactive agents. In this context, the objective of my PhD was to synthesize new glycoclusters and evaluate their biological properties. These glycoclusters were obtained by conjugating carbohydrate moieties and peptides using chemoselective ligations (Huisgen cycloaddition and oxime ligation). Tetravalent, hexavalent and hexadecavalent glycoclusters with variable structures and compositions were synthesized, fully characterized and biologically evaluated with different targets in our laboratory or in collaborations. A hexadecavalent fucosylated glycocluster was thus identified as a strong inhibitor of the lectin PA-IIL from Pseudomonas aeruginosa at subnanomolar concentration. Another type of molecule containing carbohydrate and peptides has showed unique immunological properties, in particular for the activation of NK cells against tumors without inducing apoptotic effect Key words: carbohydrate chemistry, peptide chemistry, chimioselective ligations, glycoclusters, carbohydrate-protein interactions, lectin, NK cell.
