Tradicionalno udomaćene sorte jabuka poznate su po svojoj adaptabilnosti na različite tipove tala i klimatske uvjete kao i na otpornosti prema bolestima. Njihovo poznavanje i očuvanje je vrlo bitno, ...ne samo radi revitalizacije tradicionalnih voćnjaka, već i zbog velikog značenja u oplemenjivanju jabuke (razvoju novih sorata). U svrhu revitalizacije tradicionalnih voćnjaka najznačajnije sorte se mogu razmnožavati mikropropagacijom, koja je i preduvjet za ex situ dugoročno očuvanje krioprezervacijom. S tradicionalno uzgajanih stabala jabuka, starih 50 ili više godina, uzimani su uzorci plodova jabuka u Hrvatskoj, na području Bjelovarsko-bilogorske županije. Morfološke karakteristike plodova određene su tijekom 3 godine, a kemijske karakteristike (topiva suha tvar, reducirajući šećeri, kiseline i ukupan sadržaj fenola) tijekom jedne vegetacije. Kultura tkiva je uspostavljena iz vegetacijskih vršaka veličine 1 mm izoliranih iz pupova jednogodišnjih izbojaka. Aksilarno grananje je inducirano iz dva tipa eksplantata na MS mediju uz dodatak 2% glukoze, 1% saharoze, 0,1 g*L−1 myo-inozitola, 0,8% agara, 0,2 mg*L−1 giberelinske kiseline (GA3), 0,1 mg*L−1 indol-3-octene kiseline (IBA) te 1,5 mg*L−1 6-benzilaminopurina (BAP) u mediju 1 (PM1) ili 2 mg*L−1 zeatina (ZEA) u mediju 2 (PM2). Morfološke karakteristike istraživanih starih stabala tradicionalno udomaćenih sorata jabuka nisu se razlikovale od standardnih vrijednosti osim prosječne mase, visine i promjera ploda koji su bili manji od standardnih vrijednosti, što se može objasniti starošću stabala. Iz rezultata analize glavnih komponenata uočljivo je da karakteristike ploda kao što su masa i oblik ploda, boja kožice i okus mesa ploda, koje su vrlo važne u oplemenjivanju, ujedno najviše utječu na ukupnu varijabilnost. Bez obzira na starost stabala, plodovi su još uvijek imali iznenađujuće dobre kemijske karakteristike, osobito kod sorte Canadian Reinette kod koje je izmjerena najviša koncentracija ukupnih fenola. Od pet tradicionalno udomaćenih sorata jabuke uvedenih u kulturu tkiva, uspješno su mikropropagirane sorte Jonathan i Canadian Reinette. Veću stopu multiplikacije imala je sorta Jonathan. Značajno veći broj izdanaka po eksplantatu dobiven je na hranidbenom mediju s dodatkom 1,5 mg*L−1 BAP nego na mediju s dodanim ZEA. Međutim, morfološke karakteristike izdanaka regeneriranih na mediju s dodatkom ZEA bile su bolje. Oba tipa eksplantata, izdanci postavljeni vertikalno na hranidbeni medij ili dvonodalni segmenti stabljike postavljeni horizontalno na hranidbeni medij, dali su slične rezultate aksilarnog grananja.
Plant species Centaurium erythraea Rafn., commonly known as common centaury,
has been used for centuries to cure febrile conditions, regulate blood
sugar, treat anemia, jaundice and gout and to ...increase appetite and
stimulate digestion. Because of its numerous therapeutic properties
centaurii herba is officially recognized as a drug in a number of
pharmacopoeias. Root tips of ≈10 mm average length, isolated from seedlings
obtained under sterile conditions, were used as initial explants in this
work. The in vitro culture of non-transformed centaury roots was established
on solid half-strength MS nutrient medium without growth regulators.
Organogenesis is a spontaneous process in centaury root culture. The first
changes were noticeable on the basal part of the initial explants, after
seven days of growth on MS medium. The root explants thickened and began to
burst over the entire length of the basal part. During four weeks of
subculture, a large number of adventitious buds were observed on initial
explants. In order to obtain transgenic centaury plants with lowered
endogenous cytokinin levels, in vitro cultivated root explants were
transformed with Agrobacterium tumefaciens GV3101 bearing a pBinHTX plasmid
with either AtCKX1 or AtCKX2 genes encoding isoforms of cytokinin
oxidase/dehydrogenase (CKX). PCR analysis of genomic DNA confirmed the
effecient integration of both AtCKX1 (30%) and AtCKX2 (28.2%) genes. In
order to investigate the expression of AtCKX genes in transgenic centaury
plants, an optimization of PCR protocol with qPCR primers was necessary.
Optimization of PCR protocol implicated finding the optimal annealing
temperature and simultaneous application of different PCR additives and
enhancers. Addition of 5% DMSO significantly improved the specificity of
qPCR amplification of AtCKX1 and AtCKX2 genes. qRT-PCR analysis indicated
that AtCKX1 and AtCKX2 genes were expressed in 50% and 64% of the analyzed
transgenic lines, respectively. In this work we clearly demonstrate a
significant effect of AtCKX genes on cytokinin metabolism in transgenic
centaury plants. Since CKX is the only known enzyme involved in cytokinin
catabolism, it is considered a key factor in controlling the cytokinin
levels in plant tissues. CKX enzyme activity was determined in shoots and in
roots of all AtCKX transgenic lines. The analysis of the content of total
cytokinins and individual groups of endogenous cytokinins in non-transformed
centaury plants enabled, for the first time, a determination of cytokinin
profile of this species in vitro. In this work we also showed that changes
in the cytokinin metabolism have unpredictable effects on the endogenous IAA
levels in plant tissues. The expression of AtCKX genes also affected some
morphological traits of the transgenic centaury plants. We observed that a
decrease of endogenous cytokinins caused a reduction of morphogenetic
potential of transgenic centaury plants but did not significantly affect the
biomass production in comparison to control plants. Analysis of
photosynthetic pigments of centaury indicated that a decrease of endogenous
cytokinins might be a prerequisite rather than a signal for the onset of
senescence. The main active pharmacological compounds of the centaury are
secoiridoids and xanthones. The content of the secoiridoids found in plants
grown in vitro was similar to that in plants collected from nature, whereas
the quantity of xanthones was significantly elevated in plants grown in
vitro, in comparison to plants from nature. Most of the obtained AtCKX
transgenic centaury lines produced less secoiridoids than plants from
natural habitat or plants grown in vitro. On the contrary, it was determined
that the majority of the AtCKX transgenic centaury lines accumulated more
xanthones than plants grown in nature. As xanthones are increasingly being
used for their pharmacological properties, AtCKX transgenic centaury plants
could be used as a useful source of plant material for the production of
novel drugs.
Biljna vrsta Centaurium erythraea Rafn., u našem narodu poznata kao kičica,
od davnina se upotrebljava kao lek za sniženje temperature i nivoa šećera u
krvi, lečenje anemije, žutice i gihta, za jačanje apetita i povećanje
stomačne sekrecije. Zbog poznatih lekovitih svojstava, kičica se nalazi u
mnogim farmakopejama. Kao početni materijal za uspostavljanje kulture
korenova in vitro korišćeni su vrhovi adventivnih korenova prosečne dužine
~10 mm koji su izolovani od sterilno dobijenih klijanaca kičice i dalje su
gajeni na čvrstoj MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja. Proces
organogeneze u kulturi korenova kičice je spontan. Posle sedam dana gajenja
u kulturi na bazalnom delu početnog eksplantata uočavaju se prve promene.
Koren zadebljava i tkivo počinje da puca celom dužinom bazalnog dela. Tokom
četvoronedeljnog pasaža, duž razraslog dela eksplantata, formira se veliki
broj adventivnih pupoljaka. U cilju dobijanja transgenih biljaka sa sniženim
nivoom endogenih citokinina, za transformaciju su korišćena dva bakterijska
soja Agrobacterium tumefaciens GV3101 koji nose pBinHTX plazmid sa dva
različita gena, AtCKX1 odnosno AtCKX2, koji kodiraju enzim citokinin
oksidazu/dehidrogenazu (CKX). Efikasna integracija AtCKX1 gena (30% ) i
AtCKX2 gena (28.2% ) određena je PCR analizom genomske DNK. U cilju što
boljeg određivanja nivoa ekspresije AtCKX gena kičice prvo je bilo neophodno
urađena je optimizacija PCR protokola sa prajmerima za qPCR. Ovaj postupak
sastojao se u pronalaženju optimalne temperature vezivanja prajmera uz
istovremenu primenu različitih aditiva odnosno pojačivača PCR reakcije.
Dodavanje 5% DMSO-a u qPCR reakcije značajno je poboljšalo specifičnost
amplifikacije AtCKX1 i AtCKX2 gena kičice. qRT-PCR analizom potvrđena je
ekspresija AtCKX1 i AtCKX2 gena kod 50% odnosno 64% analiziranih linija. U
ovom radu uspešno je pokazano da ekspresija AtCKX gena u transgenim biljkama
kičice značajno utiče na metabolizam citokinina. Ključni faktor u kontroli
nivoa citokinina u biljnim tkivima predstavlja CKX enzim, jedini do sada
poznati enzim koji učestvuje u katabolizmu citokinina. Specifična aktivnost
CKX enzima određivana je u izdancima i korenovima svih transgenih AtCKX
linija. Analiza količine i sadržaja ukupnih kao i pojedinačnih grupa
endogenih citokinina netransfromisanih biljaka kičice omogućila je, po prvi
put, određivanje citokiniskog profila kičice in vitro. Takođe je pokazano da
se promene u metabolizmu citokinina prilično nepredvidivo odražavaju na
količinu auksina tj. količinu ukupne endogene IAA u samom biljnom tkivu.
Uspešno je pokazano da ekpresija AtCKX gena takođe utiče i na neke
morfološke parametre transformisanih biljaka kičice. Promenjena citokininska
homeostaza utiče na smanjenje morfogenetskog potencijala transformisanih
biljaka kičice, ali ne utiče na značajno odstupanje prirasta mase izdanaka u
odnosu na kontrolu. Rezultati analize fotosintetičkih pigmenata kičice
ukazuju na to da sniženje citokinina može biti jedan od preduslova, ali ne i
sam signal za početak senescencije. Dominantne farmakološki aktivne
supstance kičice su sekoiridoidi i ksantoni. Sadržaj sekoiridoidnih
komponenti biljaka in vitro ne razlikuje se mnogo u odnosu na biljke iz
prirode dok se količina ksantonskih jedinjenja značajno povećava kod biljaka
gajenih in vitro. Većina transgenih AtCKX linija kičice produkuje manje
sekoiridoida u odnosu na biljke in vitro i biljke iz prirode. Povećana
akumulacija ksantona određena je u skoro svim AtCKX linijama kičice u
poređenju sa biljkama iz prirode. Imajući u vidu da su ksantoni sve više u
upotrebi zbog svojih farmakoloških svojstava, transgene AtCKX linije kičice
mogle bi biti koristan izvor biljnog materijala u proizvodnji novih lekova.
Prirodni citokinini iz eksudata bora, koje smo rastavili papirnom kromatografijom i dodali podlozi na koju smo nasadili gljivu Suillus variegatus, utjecali su stimulativno na rast micelija. Kao što ...kinetin (KIN) pospješuje rast micelija i zeatin; optimalna koncentracija je 10-8 g/ml. Zeatinribozid ima gotovo za polovicu slabije djelovanje na rast kulture gljive S. variegatus. KIN sinergistično utječe na rast micelija u kombinaciji s 0-indoloctenom kiselinom (IAcA, konc 10-8 g/ml). Sama IAcA nema utjecaja na rast te u većim koncentracijama djeluje inhibi- torno (Gogala 1971).
Viša biljka utječe na rast mikorizne gljive S. variegatus svojim tvarima rastenja koje ona izlučuje u svoj okoliš.
EN The "Orri" mandarin is a sterile variety obtained by irradiation of the Orah mandarin (Temple x Dancy) in the Agricultural Research Organization (ARO) of Israel. "Orri" is distinguished because ...its late ripening and its organoleptic quality. However, the main problem of the variety is its irregular production. Fruit set is the transition from ovary to fruit. The initial development of the ovary is carried out through cell division in the pericarp and the formation of the juice vesicles in the endocarp. In citrus, the process is regulated hormonally, by gibberellins, and nutritionally. Nowadays it is currently unknown if the reason for the lack of production of the ¿Orri¿ mandarin is due to a poor fruit setting provoked by hormonal or nutritional deficiencies. In this TFM the endogenous and exogenous hormonal regulation of the mandarin "Orri" fruit set is studied. Finally, the results indicate that the low parthenocarpic set fruit is not due to hormonal factors, because the "Orri" mandarin increases the expression of the GA3ox1 gene in the ovary (it is able of synthesizing GA1) and the exogenous applications of phytohormones have a null effect on the final production of the "Orri" mandarin, regardless of the pattern in which it is grafted.
ES La mandarina "Orri" es una variedad estéril obtenida por irradiación de la mandarina Orah (Temple x Dancy) llevada a cabo por la Agricultural Research Organization (ARO) de Israel. "Orri" destaca por su época de maduración tardía y su calidad organoléptica. No obstante, la principal problemática de la variedad es su irregular producción. El cuajado es la transición del ovario a fruto. El desarrollo inicial del ovario se lleva a cabo a través de la división celular en el pericarpo y la formación de las vesículas de zumo en el endocarpo. En los cítricos, el proceso está regulado hormonalmente, por las giberelinas, y nutricionalmente. Actualmente se desconoce si el motivo de la falta de producción de la mandarina "Orri" es debido a un cuajado deficiente, y, en su caso, a factores hormonales o nutricionales. En este TFM se estudia la regulación hormonal endógena y exógena del cuajado de la mandarina "Orri". Finalmente, los resultados indican que el bajo cuajado partenocárpico no es debido a factores hormonales, porque la mandarina "Orri" aumenta la expresión del gen GA3ox1 en el ovario (es capaz de sintetizar GA1) y las aplicaciones exógenas de fitohormonas tienen un efecto nulo en la producción final de la mandarina "Orri", independientemente del patrón en el cual esté injertada.
ES La mandarina "Orri" es una variedad estéril obtenida por irradiación de la mandarina Orah (Temple x Dancy) llevada a cabo por la Agricultural Research Organization (ARO) de Israel. "Orri" destaca por su época de maduración tardía y su calidad organoléptica. No obstante, la principal problemática de la variedad es su irregular producción. El cuajado es la transición del ovario a fruto. El desarrollo inicial del ovario se lleva a cabo a través de la división celular en el pericarpo y la formación de las vesículas de zumo en el endocarpo. En los cítricos, el proceso está regulado hormonalmente, por las giberelinas, y nutricionalmente. Actualmente se desconoce si el motivo de la falta de producción de la mandarina "Orri" es debido a un cuajado deficiente, y, en su caso, a factores hormonales o nutricionales. En este TFM se estudia la regulación hormonal endógena y exógena del cuajado de la mandarina "Orri". Finalmente, los resultados indican que el bajo cuajado partenocárpico no es debido a factores hormonales, porque la mandarina "Orri" aumenta la expresión del gen GA3ox1 en el ovario (es capaz de sintetizar GA1) y las aplicaciones exógenas de fitohormonas tienen un efecto nulo en la producción final de la mandarina "Orri", independientemente del patrón en el cual esté injertada.
EN The "Orri" mandarin is a sterile variety obtained by irradiation of the Orah mandarin (Temple x Dancy) in the Agricultural Research Organization (ARO) of Israel. "Orri" is distinguished because its late ripening and its organoleptic quality. However, the main problem of the variety is its irregular production. Fruit set is the transition from ovary to fruit. The initial development of the ovary is carried out through cell division in the pericarp and the formation of the juice vesicles in the endocarp. In citrus, the process is regulated hormonally, by gibberellins, and nutritionally. Nowadays it is currently unknown if the reason for the lack of production of the ¿Orri¿ mandarin is due to a poor fruit setting provoked by hormonal or nutritional deficiencies. In this TFM the endogenous and exogenous hormonal regulation of the mandarin "Orri" fruit set is studied. Finally, the results indicate that the low parthenocarpic set fruit is not due to hormonal factors, because the "Orri" mandarin increases the expression of the GA3ox1 gene in the ovary (it is able of synthesizing GA1) and the exogenous applications of phytohormones have a null effect on the final production of the "Orri" mandarin, regardless of the pattern in which it is grafted.
CA La mandarina '“Orri”' és una varietat estèril obtinguda per irradiació de la mandarina Orah (Tremp x Dancy) duta a terme per l'Agricultural Research Organization (ARO) d'Israel. '“Orri”' destaca per la seua època de maduració tardana i la seua qualitat organolèptica. Això no obstant, la principal problemàtica de la varietat és la seua irregular producció. El quallat és la transició de l'ovari a fruit. El desenvolupament inicial de l'ovari es porta a terme a través de la divisió cel·lular en el pericarp i la formació de les vesícules de suc a l'endocarp. En els cítrics, el procés està regulat hormonalment, per les gibberel·lines, i nutricionalment. Actualment es desconeix si el motiu de la manca de producció de la mandarina '“Orri”' és causa d'un quallat deficient, i, si s'escau, a factors hormonals o nutricionals. En aquest TFM s'estudia la regulació hormonal endògena i exògena del quallat de la mandarina '“Orri”'. Finalment, els resultats indiquen que el baix quallat partenocàrpic no és causa de factors hormonals, perquè la mandarina "Orri" augmenta l'expressió del gen GA3ox1 a l'ovari (és capaç de sintetitzar GA1) i les aplicacions exògenes de fitohormones tenen un efecte nul en la producció final de la mandarina "Orri", independentment del patró en el qual estiga empeltada.
PDF
