Provedena je preliminarna karakterizacija tirozinaze proizvedene brazilskim sojem gljive Lentinula boryana, radi procjene moguće primjene u biotehnologiji. Enzim je po mnogo čemu sličan tirozinazama ...drugih gljiva. Nakon karakterizacije sirovog ekstrakta, aktivnost tirozinaze bila je optimalna pri pH=6 i ne osobito termostabilna, s poluvremenom raspada od 10 i 1 min pri 50 i 60 °C. Enzim je pročišćen taloženjem pomoću amonijeva sulfata i ionskom kromatografijom na koloni DEAE-sefaroze, s prinosom od 33 % i faktorom obogaćivanja od 5,3. Primjenom metode SDS-PAGE dobivene su 3 trake pročišćenoga proizvoda, molekularne mase od 20, 27 i 47 kDa. Pokazatelji kinetike inhibicije supstrata tog proizvoda s L-DOPA (3,4-dihidroksi-L-fenilalaninom) iznosili su KM=1.9 mM i KI=72 mM. U istim uvjetima reakcije tirozinaza iz komercijalnih gljiva ponašala se prema Michaelis-Mentenovom modelu s vrijednošću KM=0,51 mM. Iako ovim istraživanjem nije ustanovljeno da je tirozinaza iz gljive L. boryana najprikladnija za biotehnološku primjenu, ipak je pridonijelo spoznajom da L-DOPA utječe na inhibiciju supstrata enzima, što dosad nije bilo poznato.
Ciljevi istraživanja:
Na temelju rezultata istraživanja u zadnjih desetak godina predložen je model u
kojem inhibicija sinteze ribosoma rezultira oštecenjem jezgrice i oslobaanjem
ribosomskih ...proteina (RP) RPL5, RPL11, RPL23, RPL26 i RPS7 iz jezgrice u jezgru,
gdje vežu negativni regulator p53, Mdm2 (engl. mouse double minute 2 homolog),
inhibiraju njegovu ubikvitin-ligaznu aktivnost, te posljedicno aktiviraju supresor tumora
p53.
Ciljevi su :
1. Odrediti specificnu ulogu RPL5, RPL11, RPL23, RPL26 i RPS7 u aktivaciji p53 nakon
inhibicije razlicitih koraka u sintezi ribosoma.
2. Razjasniti precizne molekularne mehanizme putem kojih ti RP aktiviraju p53.
Materijali i metode:
U stanicama A549 i U-2 OS sinteza ribosoma inhibirana je aktinomicinom D
(AktD), 5-fluorouracilom (5-FU) ili primjenom specificnih malih molekula RNA, siRNA
(utišavajucih RNA, engl. silencing RNA) protiv komponenti koje sudjeluju u sintezi
ribosoma. Podrijetlo, stabilnost i unutarstanicni smještaj novosintetiziranih RP te njihova
udruženost s drugim proteinima analizirana je brojnim metodama molekularne i stanicne
biologije te biokemije (tretman stanica inhibitorima sinteze proteina i proteasoma,
izolacija stanicnih odjeljaka, metoda Western blot, imunotaloženje, lancana reakcija
polimerazom i konfokalna mikroskopija).
Rezultati:
Dokazano je da su RPL5 i RPL11, a ne RPL23, RPL26 i RPS7, kljucni pozitivni
regulatori p53 nakon inhibicije sinteze ribosoma. Vecina RP sintetizira se i nakon
inhibicije sinteze ribosoma, ali se vrlo brzo razgrauju u proteasomima. Novosintetizirani
RPL5 i RPL11 ne razgrauju se u proteasomima, vec se nakupljaju u izvanribosomskim
odjeljcima gdje vežu negativni regulator p53, Mdm2. Sklop RPL5-RPL11-Mdm2-p53
transportira se u oštecenu jezgricu i udružuje s aktivatorom p53, proteinom PML (engl.
promyelocytic leucemia protein), što rezultira potpunom aktivacijom p53.
Zakljucci:
Dokazano je da su RPL5 i RPL11 kljucni aktivatori p53 nakon inhibicije sinteze
ribosoma te su razjašnjeni precizni molekularni mehanizmi ove regulacije. Naši rezultati
mogu pomoci u razumijevanju patogeneze bolesti uzrokovanih poremacajima sinteze
ribosoma.
Objectives:
Overexpression experiments suggested that perturbation of ribosome biogenesis
causes nucleolar disruption and translocation of a number of ectopically expressed
ribosomal proteins (RPs), including RPL5, RPL11, RPL23, RPL26, and RPS7, from the
nucleolus to the nucleoplasm, where they bind to Mdm2 and inhibit its ubiquitin ligase
function toward p53, leading to p53 up-regulation.
Our objectives are:
1. To determine the role of specific endogenous RPs in p53 activation upon impairments
of various steps of ribosome biogenesis.
2. To elucidate the molecular mechanisms by which specific RPs activate p53 under
these conditions.
Material and Methods:
Ribosome biogenesis was inhibited with actinomycin D, 5- fluorouracil or siRNAmediated
depletion of RPs. A number of biochemical as well as molecular and cellular
biological methods were used to analyze the source, stability and intracellular
localization of newly synthesized RPL5 and RPL11 upon impairment of ribosome
biogenesis, including treatment with protein synthesis or proteasome inhibitors, Western
blot analysis, qRT-PCR, immunoprecipitation, cellular fractionations and live-cell imaging
microscopy.
Results:
We showed that RPL5 and RPL11, but not RPL23, RPL26 and RPS7, are
required for p53 activation upon inhibition of ribosome biogenesis. Whereas several
other newly synthesized RP are degraded by proteasomes upon inhibition of Pol I
activity by actinomycin D, RPL5 and RPL11 accumulate in the ribosome-free fraction
where they bind to Mdm2. This selective accumulation of free RPL5 and RPL11 is due
to their mutual protection from proteasomal degradation. Furthermore, the endogenous,
newly synthesized RPL5 and RPL11 continue to be imported into nucleoli even after
nucleolar disruption and colocalize with Mdm2, p53 and PML.
Conclusions:
We demonstrate the key role of RPL5 and RPL11 in p53 activation by
impairments of ribosome biogenesis and uncover the molecular mechanisms of this
regulation. Our findings may have important implications with respect to understanding
the pathogenesis of diseases caused by impaired ribosome biogenesis.
Svrha je istraživanja bila odrediti antioksidacijsko djelovanje i sposobnost inhibicije enzima acetilkolinesteraze u vodenim infuzijama oraha (Juglans regia L.), paprene metvice (Mentha × piperita ...L.), jagode (Fragaria × ananassa L.), matičnjaka (Melissa officinalis L.), kadulje (Salvia officinalis L.) i smilja (Helichrysum arenarium (L.) Moench.). HPLC-PDA analizom utvrđeno je da u vodenim infuzijama odabranih biljaka najviše ima fenolnih kiselina (ružmarinske, galne, kafeinske, neoklorogenske i 3-p-kumaroil-kinske kiseline), te flavonola (kvercetin-3-galaktozid i luteolin-7-glukozid). Antioksidacijsko djelovanje vodenih infuzija određeno je LDL metodom (sprječavanje oksidacije lipoproteina male gustoće), DPPH metodom, metodom izbjeljivanja ß-karotena i Rancimat metodom (produženi proces oksidacije masti). Utvrđeno je da vodene infuzije jagode i matičnjaka potpuno sprječavaju oksidaciju LDL-a pri koncentraciji od 0,005 g/L u sustavu, te da je izrazito produžena lag faza tijekom oksidacije LDL-a uzrokovana djelovanjem vodenih infuzija paprene metvice i kadulje. Nadalje, testirane infuzije u rasponu koncentracija od 0,05 do 2,85 g/L pokazale su jako visoki stupanj uklanjanja DPPH radikala (90-100 %) i sprječavanja izbjeljivanja ß-karotena (89-100 %). Rancimat metodom utvrđeno je da vodene infuzije kadulje i smilja (masenog udjela od 0,16 %) najviše utječu na odgađanje procesa oksidacije masti. Inhibicija enzima acetilkolinesteraze pomoću testiranih vodenih infuzija određena je Ellmanovom metodom, pri čemu su vodene infuzije oraha i jagode (u koncentraciji od 1,36 g/L u sustavu) pokazale najveći stupanj inhibicije acetilkolinesteraze. Dobiveni rezultati upućuju na to da prirodni antioksidansi svojim djelovanjem mogu pridonijeti poboljšanju terapije i prevenciji Alzheimerove bolesti.
Forenzični biološki uzorci često sadržavaju male količine DNA uz prisustvo smjese inhibitora umnažanja DNA. Tijekom izolacije DNA s podloge dijelovi podloge kao potencijalni inhibitori mogu se ...izolirati zajedno s genomskom DNA, čime se smanjuje ili u potpuno onemogućuje umnažanje mikrosatelitnih lokusa. Cilj ovog istraživanja jest ukloniti inhibitore umnažanja DNA pomoću aktivnog ugljena uz što manji gubitak humane DNA. Kvaliteta izolirane DNA testirana je umnažanjem deset mikrosatelitnih lokusa. Uspoređena je efikasnost neafinitetnih metoda izolacije genomske DNA (Chelex i organska izolacija), kao i metoda pročišćavanja ultrafiltracijom (Amicon komercijalna kolona) i adsorpcijom (aktivni ugljen). Općenito, Chelex se pokazao kao učinkovitija metoda izolacije DNA, a usporedbom metoda pročišćavanja nije bilo statistički značajne razlike u kvaliteti umnožene DNA. Primjena aktivnog ugljena pokazala se jednostavnom, brzom, ekonomičnom i reproducibilnom metodom pročišćavanja. Aktivni ugljen uspješno je adsorbirao hematin, prirodni inhibitor iz krvi, bez značajnih gubitaka DNA. Nadalje, smanjena je koncentracija inhibitora iz podloge kao što su humusne tvari iz zemlje i tanini iz drva. Amicon se pokazao kao efikasnija metoda za uklanjanje indiga iz trapera kao podloge. Pročišćavanje bioloških uzoraka temeljeno na fizikalnim i kemijskim svojstvima aktivnog ugljena dosad nije provedeno, stoga spoznaje utvrđene u ovom istraživanju daju prvi uvid u novu primjenu tog dobro poznatog adsorbensa.
Forensic biological samples often contain small quantities of DNA in presence of mixture of DNA amplification inhibitors. During the genomic DNA extraction, parts of the substrate, as potential inhibitors, could be co-extracted with genomic DNA and reduce or completely disable amplification of microsatellite loci. Aim of this study is to eliminate inhibitors of DNA amplification using activated carbon, without significant loss of human DNA. Quality of extracted DNA was tested by amplification of ten microsatellite loci. In this doctoral thesis, efficiency of non-affinity DNA extraction methods (Chelex and organic extraction) as well as purification methods based on ultrafiltration (Amicon commercial column) and adsorption (activated carbon) were compared. Generally, Chelex extraction method was more efficient, while no statistically significant difference was obtained if purification methods were compared. Application of activated carbon was shown as simple, fast, economic and reproducible purification method. Activated carbon effectively adsorbed hematin, as inhibitor naturally originated from blood, without significant loss of DNA. In addition, concentration of inhibitors present in the substrate, such as humic substances in soil substrate, as well as tannins in wood, was reduced. Amicon was more efficient method for elimination of indigo dye as inhibitor present in denim substrate. Since purification of biological samples based solely on chemical and physical characteristics of activated carbon has not yet been performed, results of this research provide the first insight into a new application of this well known adsobent.
Istražen je proces proizvodnje ciklodekstrina iz škroba pomoću ciklodekstrin glukanotransferaze iz bakterije Bacillus megaterium. Pomoću optimalno uređenog plana i metode odzivnih površina istražen ...je utjecaj koncentracije škroba i enzima na proizvodnju ciklodekstrina. Izrađeni su matematički modeli koji opisuju proces u dva područja varijacija nezavisnih varijabla koja se preklapaju. Modeli su upotrijebljeni za određivanje optimalnih vrijednosti varijabla. Povećanjem koncentracije škroba povećala se količina nastalog β-ciklodekstrina, a smanjio prinos. Optimalna koncentracija škroba bila je 50 mg/mL. Kritična je koncentracija ciklodekstrin glukanotransferaze, prijeko potrebna za maksimalnu proizvodnju β-ciklodekstrina, bila 2 U/g. Utvrđeni su faktori koji limitiraju potpunu konverziju škroba u ciklodekstrine i ustanovljeno je da produkti reakcije znatno inhibiraju aktivnost enzima. Dokazano je da ciklodekstrin glukanotransferaze može razgraditi velike koncentracije β-ciklodekstrina i transformirati ga u različite tipove ciklodekstrina. Djelovanjem enzima nastaju α-, β- i γ-ciklodekstrini u različitim omjerima, ovisno o dužini trajanja procesa.
Pozadina istraživanja. Vrste roda Curcuma (Zingiberaceae) poznate su ljekovite biljke u Indiji i jugoistočnoj Aziji. Usprkos različitim istraživanjima koja potvrđuju njihov pozitivan biološki učinak, ...vrlo je malo podataka o vrsti Curcuma caesia. Stoga je svrha ovog istraživanja bila odrediti udjel fenola, antioksidacijsku aktivnost i svojstvo inhibicije α-glukozidaze u rizomu i lišću biljke C. caesia.
Eksperimentalni pristup. Rizom i lišće biljke C. caesia sušeni su u pećnici ili zamrzavanjem, te su pomoću etanola i vode u različitim omjerima: Φ(etanol,voda)=100:0, 80:20, 50:50 i 0:100 dobiveni ekstrakti biljke. Biološka aktivnost ekstrakata C. caesia mjerena je in vitro, pri čemu su određeni udjel ukupnih fenola, antioksidacijska aktivnost (pomoću metoda DPPH i FRAP) i svojstvo inhibicije α-glukozidaze. Metabolomskim pristupom su na osnovi rezultata protonske nuklearne magnetske rezonancije (1H NMR) pronađeni najaktivniji ekstrakti, ovisno o profilu metabolita i njhovom utjecaju na biološku aktivnost crne kurkume.
Rezultati i zaključci. Ekstrakt dobiven sušenjem rizoma zamrzavanjem te ekstracijom u čistom etanolu (Φ(etanol,voda)=100:0) imao je velik udjel ukupnih fenola izražen u ekvivalentima galne kiseline od (45,4±2,1) mg/g, FRAP-vrijednost izraženu u Trolox ekvivalentima od (147,7±8,3) mg/g i svojstvo inhibicije α-glukozidaze izraženo kao IC50 vrijednost od (265,5±38,6) µg/mL. Najveću sposobnost uklanjanja DPPH radikala imali su ekstrakti dobiveni sušenjem rizoma zamrzavanjem i ekstrakcijom u otopinama etanola Φ(etanol,voda)=80:20 i 100:0, a među njima nije bilo statistički bitne razlike. Stoga su ekstrakti dobiveni nakon sušenja rizoma zamrzavanjem odabrani za metabolomsku analizu. Analizom glavnih komponenata (PCA) opažene su jasne razlike između ekstrakata. Metodom parcijalnih najmanjih kvadrata pronađene su pozitivne korelacije između metabolita, uključujući derivat ksantorizola, 1-hidroksi-1,7-bis(4-hidroksi-3-metoksifenil)-(6E)-6-hepten-3,4-dion, valin, luteolin, zedoardiol, β-turmeron, γ-selinen, zedoalakton B i germakron, i antioksidacijske aktivnosti te inhibicije α-glukozidaze, dok su kurdion i 1-(4-hidroksi-3,5-dimetoksifenil)-7-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-(1E,6E)-1,6-heptadien-3,4-dion bili u korelaciji s inhibicijom α-glukozidaze.
Novina i znanstveni doprinos. Rizom i lišće biljke C. caesia sadržavaju fenolne spojeve te imaju različitu antioksidacijsku aktivnost i svojstvo inhibicije α-glukozidaze. Rezultati istraživanja jasno pokazuju da rizom biljke C. caesia predstavlja vrijedan prirodni izvor aktivnih sastojaka za primjenu u farmaceutskoj i prehrambenoj industriji.
Silikatna isplaka je KCl/polimerna isplaka s malo čvrstih čestica i s dodatkom topivog natrijevog ili kalijevog silikata radi povećanja inhibicije i stabilnosti kanala bušotine. Silikatne isplake ...pokazuju izvanredna svojstva u stabiliziranju šejla i krede, čime se postiže nominalan promjer kanala bušotine i stvaranje čvrstih krhotina tijekom bušenja kroz reaktivne šejlove i meke krede. Silikati štite šejlove in-situ geliranjem u kontaktu s neutralnim slojnim fluidom i taloženjem do kojeg dolazi uslijed reakcije silikata s dvovalentnim ionima prisutnim na površini šejla. Tijekom bušenja kroz meku kredu silikati sprečavaju disperziju i proširenja jer reagiraju s Ca2+ ionima koji su prisutni na površini krhotina krede i stijenki kanala bušotine i formiraju zaštitni film. Zbog njenih superiornih svojstava u stabiliziranju šejla silikatna isplaka se može koristiti tijekom bušenja kroz naslage anhidrita sa proslojcima šejla. Međutim, bušenje kroz anhidrit može dovesti do prevelike potrošnje silikata odnosno smanjenja njegove koncentracije u isplaci, te promjene reoloških i filtracijskih svojstava isplake. Zbog toga je neophodno provođenje laboratorijskih ispitivanja radi utvrđivanja kritične koncentracije iona kalcija u isplaci. U, radu se opisuje mehanizam inhibicije šejla kad se koristi silikatna isplaka, i prikazuju rezultati laboratorijskih ispitivanja provedenih radi određivanja utjecaja Ca2+ iona na razinu silikata u isplaci i na njena svojstva.
Glifosat je vodeći herbicid na današnjem svjetskom tržištu, unatoč neprestanim raspravama između potrošača, znanstvene zajednice i regulatornih agencija o njegovoj kancerogenosti, genotoksičnosti, ...postojanosti u okolišu i utjecaju na razvoj neurodegenerativnih bolesti. Kemijski gledano, glifosat pripada velikoj obitelji pesticida, organofosfornim spojevima (OP) koji imaju neurotoksični učinak inhibirajući acetilkolinesterazu (AChE) i butirilkolinesterazu (BChE), esencijalne enzime kolinergičnoga sustava koji održava proces prijenosa živčanih impulsa. Iako su različita istraživanja pokazala da je glifosat slab inhibitor kolinesteraza u riba, sisavaca i ljudi u odnosu na druge organofosforne spojeve, još uvijek ne postoje konačni podatci o njegovoj inhibiciji ljudske AChE i BChE. U ovoj smo studiji analizirali inhibitorni potencijal za ljudsku AChE i BChE, procijenili IC50 vrijednosti i utvrdili reverzibilnu inhibiciju pomoću vrijednosti konstanti disocijacije inhibitora. Glifosat je gotovo u cijelosti inhibirao aktivnost enzima pri 40 mmol/L koncentraciji (preostalo je otprilike 10 % enzimske aktivnosti). Konstante disocijacije (Ki) kompleksa glifosat-AChE i -BChE iznose 28.4±2.7 mmol/L, odnosno 19.3±1.8 mmol/L. Zaključno, glifosat iskazuje malu sklonost za vezanje BChE, no pokazuje inhibiciju u rasponu visokih koncentracija. Rezultati ovoga istraživanja podupiru rezultate postojećih studija prema kojima neurotoksični učinak glifosata nije primarno vezan za kolinergični sustav.
Salvia officinalis L. stoljećima se koristi u tradicionalnoj medicini za prevenciju i liječenje raznih upalnih i oksidacijskim stresom izazvanih poremećaja. U ovoj studiji željeli smo ekstrahirati ...kaduljino lišće korištenjem ekološki prihvatljivog, “zelenog” pristupa vodenom ekstrakcijom i liofilizacijom te odrediti njegova bioaktivna svojstva u primarnim ljudskim perifernim krvnim stanicama. Ukupni sadržaj fenola i flavonoida i GC-MS korišteni su za karakterizaciju ekstrakta. Necitotoksične koncentracije, određene metodom bojenja s bojom tripan plavo, analizirane su za procjenu antioksidacijskih (DPPH, ABTS i PAB test), antigenotoksičnih (CBMN test), imunomodulacijskih (IL-1β i TNF-α) i neuroprotektivnih učinaka (AChE inhibicija). Ekstrakt je sadržavao visoku koncentraciju ukupnih fenola (162 mg GAE/g liofilizata) i flavonoida (39,47 mg QE/g liofilizata), dok je sadržaj β-tujona bio neočekivano nizak (niži od 0,9 %). Snažna aktivnost hvatanja radikala u kombinaciji s aktivacijom glutation reduktaze dovela je do smanjenja bazalnog i H2O2 induciranog oksidacijskog stresa i oštećenja DNA. Smanjenje TNF-α i povišenje razine IL-1β sugeriraju kompleksan imunomodulatorni odgovor koji bi mogao pridonijeti antioksidacijskim i, zajedno s blagom inhibicijom AChE, neuroprotektivnim učincima. Sveukupno, ova je studija pokazala da vodena ekstrakcija kaduljina lišća smanjuje toksične spojeve kao što su tujon, 1,8-cineol, pinen i terpenski ketoni, a održava visoku koncentraciju biološki aktivnih zaštitnih spojeva u ekstraktu, što bi moglo imati potencijal za prevenciju i/ili liječenje oksidacijskih i upalnih poremećaja.
U ovome in vitro istraživanju testiran je reaktivacijski potencijal triju reaktivatora acetilkolinesteraze (AChE; EC 3.1.1.7) dobivenih iz monokvaternog reaktivatora pralidoksima. Testirani su ...sljedeći spojevi: 4-karbamoil-2-aldoksim-1-metilpiridinijev jodid (TO231), 4-etoksikarbonil-2-aldoksim-1-metilpiridinijev jodid (TO237) te 5-etoksikarbonil-2-aldoksim-1-metilpiridinijev jodid (TO238). Za usporedbu su uzeti pralidoksim i obidoksim. Kao inhibitori kolinesteraze rabljeni su živćani otrov ciklosarin i pesticid klorpirifos. Izvor acetilkolinesteraze bio je homogenat mozga štakora. Nijedan od testiranih oksima nije uspio reaktivirati acetilkolinesterazu inhibiranu ciklosarinom pri koncentraciji oksima od 1.0 mmol L-1. Kod inhibicije klorpirifosom TO231 pokazao se najsnažnijim reaktivatorom acetilkolinesteraze s reaktivacijom od 82 % pri koncentraciji oksima od 1.0 mmol L-1. Ovaj reaktivacijski potencijal jednak je onomu pralidoksima i obidoksima. Slabiju je djelotvornost iskazao TO238, a TO237 nije uspio reaktivirati acetilkolinesterazu inhibiranu klorpirifosom. Stoga nijedan od testiranih spojeva (uključujući i referentne oksime) ne može služiti kao univerzalni reaktivator acetilkolinesteraze inhibirane klorpirifosom i ciklosarinom.
